曲为酒之骨[1],酒曲作为微生物生长繁殖的载体,含有霉菌、酵母、细菌等丰富的微生物,在整个酿造发酵过程主要起到糖化、酒化作用[2-4]。制曲工艺作为白酒酿造的核心环节之一[5],其质量直接影响了酒体的风味与品质[6-7]。米香型白酒小曲按制曲工艺主要有手工传统制曲和机械制曲两大类,我国手工传统制曲技术历史悠久[8-9],通过人工选育性能优良菌株进行纯种或混菌扩大培养生产,制成粉曲或颗粒曲形式,其存在生产效率低、劳动强度大[10-11]、吨曲成本高的问题,且酒曲质量易受环境、人员因素影响。然而,随着酿造行业生产需求及国内外技术和设备的不断更新换代,近年来圆盘机械制曲技术发展尤为迅速,米香型和豉香型白酒等越来越多白酒企业开始引进圆盘制曲机[12-13]。相较人工传统制曲技术,圆盘内配备有精密的自动控制系统[14],可在曲种培养、干燥过程实时控温调湿,且生产过程的各工序操作基本都能在封闭试自动化圆盘制曲机中进行,所需人工少、劳动强度低、自动化程度高[15],该生产模式的改变可以极大提高酒曲生产效率和质量。
微生物的生长繁殖极易受到外界环境因素的影响,培养过程工艺参数上的丝毫差异都可能会造成酒曲的理化指标及微生物指标发生较大变化,从而影响原酒的风味与口感[16]。郭敏[17]对酱香型白酒人工及机械制曲的微生物及理化因子进行研究,结果表明,两者在微生物层面无明显的差异;张智超等[18]研究发现,不同制曲方式的酒曲风味有显著差异,传统制曲的关键挥发性风味物质含量更高更丰富;唐绍培等[19]研究发现,人工制曲和机械制曲在微生物层面上具有较高的相似性,但各微生物属的相对丰度有所差异;皇甫洁等[20]采用高通量测序技术研究了广州九江酒厂有限公司米香型白酒圆盘制曲和传统制曲成品曲的理化指标和微生物群落结构差异,结果表明,传统制曲成品曲较圆盘制曲成品曲理化指标高,且两种曲微生物结构存在较大差异,但均未对两者所产原酒风味差异性进行研究。
机械化制曲技术的引进至关重要,但当前传统制曲和圆盘制曲所生产出来的酒曲质量与其酿造原酒风味间的差异性鲜有研究。因此,本研究以米香型白酒圆盘成品曲和手工传统颗粒曲为研究对象,主要对两种不同制曲工艺成品酒曲的水分、糖化力、发酵力、糖化酶活力等理化指标及微生物指标进行测定与比对分析,并将两种酒曲分别应用于米香型白酒酿造,通过常规检测方法及气相色谱(gas chromatography,GC)法分别对其理化指标及挥发性风味成分进行分析,以深入探讨不同制曲方式对原酒风味的影响,为米香型白酒机械化制曲技术的优化升级提供数据参考,推动白酒企业制曲技术的传承创新与应用。
1.1.1 材料
圆盘成品曲、传统颗粒曲(两种酒曲在生产工艺、酒曲形态上不同,圆盘成品曲为圆盘制曲机生产制成的米粉状成品曲,传统颗粒曲为手工生产的颗粒状成品曲,两者都是接种纯种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)制成):广西天龙泉酒业有限公司;大米:南宁嘉豪大米有限公司。
1.1.2 化学试剂
葡萄糖、乙醇、乙酸、乳酸、硫酸亚铁,氢氧化钠、硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、酚酞、硫酸溶液(均为分析纯):西陇科学股份有限公司;氯霉素(纯度99%):维百奥北京生物科技有限公司;甲醇(色谱纯):国药集团化学试剂有限公司;酵母浸粉(生化试剂):北京博奥森生物技术有限公司;琼脂粉(生化试剂):广西环凯微生物科技有限公司;麦芽糖、蛋白胨(均为生化试剂):北京奥博星生物技术有限责任公司。其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂(yeast peptone dextrose agar,YPD)培养基:酵母浸粉1%、葡萄糖2%、麦芽糖2%、蛋白胨2%、琼脂粉2%,115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
JM-B50002电子天平:余姚市纪铭称重校验设备有限公司;SW-CJ-2G双人单面净化工作台:苏州净化设备有限公司;MJ-250-I霉菌培养箱、THZ-100恒温培养摇床:上海一恒科学仪器有限公司;SN-DL-1G SUNNE万用电炉:上海尚普仪器设备有限公司;YM-100立式压力蒸汽灭菌锅:上海三申医疗器械有限公司;SYG-4数显恒温水浴锅:常州郎越仪器制造;PHS-3E pH计:上海仪电科学仪器股份有限公司;DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司;UV-5600紫外可见分光光度计:上海元析仪器有限公司;7890B气相色谱(GC)仪:美国安捷伦科技公司。
1.3.1 圆盘成品曲与传统颗粒曲理化及微生物指标的检测
糖化力的测定:采用化饭法[21]。糖化力定义为每1 g酒曲糖化100g大米饭24h所生成的葡萄糖的质量,单位为g/100g。
发酵力的测定:参考江威等[22]的方法。发酵力定义为每1 g酒曲糖化100 g大米饭24 h后,取其90 g糖化饭加水发酵72 h所生成的酒精换算成20 ℃时的酒精度,单位为%vol。
糖化酶活力的测定:采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法,以1 g干曲在35 ℃,pH4.6条件下反应1 h,将可溶性淀粉分解为葡萄糖的克数表示,单位为U/g[23]。
水分含量的测定:参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》采用减压干燥方法。
微生物指标的检测:准确称量5.0g酒曲样品,加入45 mL无菌水,置于30 ℃、120 r/min条件下恒温振荡培养30 min,并按十倍梯度稀释至10-5,取100 μL合适梯度的稀释液涂布于YPD培养基平板上,30 ℃培养48 h,培养结束后,根据菌落形态,参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》的计数方法对扣囊复膜酵母及酿酒酵母菌落进行计数。
1.3.2 米香型白酒生产工艺流程及操作要点
原料蒸煮→摊晾下曲→入槽糖化→入罐发酵→蒸馏→原酒
操作要点[24]:
原料蒸煮、摊晾下曲:准确称取100 kg大米,装入浸米桶中,加自来水浸泡至少20 min,米饭蒸煮要求“熟而不烂、内无生心”,米饭水分控制在53%~58%。蒸熟后出锅摊晾下曲,下曲温度为(30±2)℃,下曲比例为1%,原料与酒曲搅拌均匀后铲入糖化槽内。
入槽糖化:入槽后米饭糖化品温要求低于45 ℃,糖化时间控制28 h内。
入罐发酵:糖化成熟后,按原料质量加120%水,搅拌均匀后抽入不锈钢发酵罐中,连续发酵13 d,发酵过程控制温度<30 ℃。
蒸馏:发酵13 d后抽入蒸馏釜蒸馏,摘取一定量酒头,流酒温度≤30 ℃,取酒精度为55%vol的原酒。
将两种酒曲在夏、秋两季节陆续开展55批次不同季节试验。
1.3.3 米香型白酒理化指标及挥发性风味物质检测
乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、异丁醇、异戊醇、杂醇油、β-苯乙醇及总酯含量的测定:参考GB/T 10345—2022《白酒分析方法》的GC法和指示剂法;总酸含量的测定:参考GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》的酸碱滴定法。
1.3.4 数据处理与统计分析
采用Excel 2016、Origin 2024等软件对数据进行统计分析并绘图。
糖化力、发酵力、水分、糖化酶活力等理化指标都是衡量酒曲质量和是否达到投入生产水平的重要指标,其中,糖化力和糖化酶活力都是衡量酒曲糖化作用强弱的一个重要指标[25],发酵力是反映其产乙醇的重要指标[26],水分含量则影响酒曲的储藏质量,一般酒曲适宜的水分含量应<13%[27]。圆盘成品曲和传统颗粒曲的理化指标见表1。由表1可知,相比于传统颗粒曲,圆盘成品曲的糖化力(28.00g/100g)、糖化酶活力(1 248.36 U/g)显著更高(P<0.05),发酵力(37.00%vol)和水分含量(8.00%)也略高,但差异不显著(P>0.05),表明采用圆盘制曲方式更有利于物料中糖化菌的生长繁殖。
表1 圆盘成品曲和传统颗粒曲的理化指标
Table 1 Physicochemical indexes of finished disc Qu and traditional granular Qu
注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
酒曲 糖化力/(g·100 g-1)水分含量/%圆盘成品曲传统颗粒曲发酵力/%vol糖化酶活力/(U·g-1)28.00±4a 20.00±5b 37.00±2a 36.00±1a 1 248.36±83a 713.14±155b 8.00±2a 7.80±2a
酿酒酵母和扣囊复膜酵母的菌落形态见图1。由图1A可知,在YPD培养基平板上,酿酒酵母菌落呈乳白色光滑状、圆形、表面湿润有光泽、中央微隆起形态;由图1B可知,扣囊复膜酵母菌落呈白色、干燥不透明、表面附着短菌丝,边缘规则或呈流苏状、菌丝状。说明通过菌落形态能够完全区分本研究中的酿酒酵母与扣囊复膜酵母。因此,采用传统平板稀释涂布法对两种酒曲样品中的酿酒酵母和扣囊复膜酵母活菌数进行检测计数,结果见图2。由图2可知,传统颗粒曲中扣囊复膜酵母的活菌落数(2.67×108 CFU/g)显著高于圆盘成品曲(0.58×108 CFU/g)(P<0.05),但两种酒曲中酿酒酵母的活菌数无明显差异(P>0.05),表明相较于圆盘机械生产方式,在人工传统制曲工艺条件下更利于扣囊复膜酵母的生长繁殖。一定数量的扣囊复膜酵母在后期酿造应用中能起到改善酒体风味与口感的作用[28],但数量过多会在一定程度上改变整个酿造发酵体系的条件,抑制酿酒酵母和其他耐受性能较弱菌群的生长代谢,从而影响原酒出酒率以及各风味物质间平衡。
图1 酿酒酵母及扣囊复膜酵母的菌落形态
Fig.1 Colony morphology of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomycopsis fibuligera
A为酿酒酵母,B为扣囊复膜酵母。
图2 圆盘成品曲和传统颗粒曲微生物活菌数检测结果
Fig.2 Detection results of microbial viable counts in finished disc Qu and traditional granular Qu
相同菌种不同字母表示差异显著(P<0.05)。
2.3.1 总酸及乙酸含量分析
酸类化合物是酯类化合物形成的前体物质,适量有机酸能够丰富白酒香气和口感[29-30]。圆盘成品曲和传统颗粒曲酿造米香型白酒中总酸及乙酸含量的测定结果见图3。由图3可知,两种酒曲酿造米香型白酒的总酸含量差异较小,基本都在(0.30±0.10)g/L范围内;而传统颗粒曲酿造米香型白酒的乙酸含量[(0.30±0.15)g/L]整体明显高于圆盘成品曲酿造米香型白酒[(0.12±0.05)g/L]。
图3 不同工艺酒曲酿造米香型白酒中总酸(a)及乙酸(b)含量测定结果
Fig.3 Determination results of total acid (a) and acetic acid (b)contents in rice-flavor Baijiu brewed with different process Jiuqu
2.3.2 总酯、乙酸乙酯及乳酸乙酯含量分析
酯类物质在白酒微量成分中占比较高,对白酒香气、风味具有显著贡献[31],乙酸乙酯、乳酸乙酯是组成白酒“四大酯类物质”之二,其比例决定了白酒的绵甜度[32]。圆盘成品曲和传统颗粒曲酿造米香型白酒中总酯、乙酸乙酯及乳酸乙酯含量的测定结果见图4。由图4a可知,传统颗粒曲酿造米香型白酒的总酯含量[(2.88±0.43)g/L]明显高于圆盘成品曲酿造米香型白酒[(1.60±0.30)g/L],且均高于国家标准GB/T10781.3—2006《米香型白酒》中优级酒标准(≥0.8g/L)。分析原因可能是传统颗粒曲中扣囊复膜酵母活菌数较高所致,扣囊复膜酵母环境耐受性能极强,繁殖速度快,可产生大量高活性酶系、促进酒体中酯类等香气物质的生成,提高原酒品质[33-34]。圆盘成品曲酿造米香型白酒中的乙酸乙酯含量[(0.46±0.17)g/L]整体高于传统颗粒曲酿造米香型白酒[(0.24±0.09)g/L],而乳酸乙酯反之,圆盘成品曲酿造米香型白酒中的乳酸乙酯含量[(1.67±0.48)g/L]整体低于传统颗粒曲酿造米香型白酒[(3.35±0.62)g/L],但均高于国家标准GB/T 10781.3—2006《米香型白酒》中优级酒标准(≥0.5 g/L)。两者都是乳酸乙酯含量高于乙酸乙酯,符合米香型白酒典型特征,但圆盘成品曲酿制米香型白酒的乳乙比例更接近米香型白酒乳乙比例传统范围(2∶1~3∶1)[35],更能突出米香型白酒“蜜香清雅、绵甜爽净”的典型风格。
图4 不同工艺酒曲酿造米香型白酒中总酯(a)、乙酸乙酯(b)及乳酸乙酯(c)含量的测定结果
Fig.4 Determination results of total esters (a), ethyl acetate (b), and ethyl lactate (c) contents in rice-flavor Baijiu brewed with different process Jiuqu
2.3.3 杂醇油、异丁醇、异戊醇及β-苯乙醇含量分析
高级醇是指含有3个或3个以上碳原子数的醇类物质总称[36],白酒中含量较高的高级醇主要有异丁醇、异戊醇、正丙醇、正戊醇和β-苯乙醇[37],其种类与含量的变化直接影响着白酒的香气与口感[38]。在米香型白酒中,适量杂醇油能让酒体口感更加醇厚,但含量过高会导致白酒口感粗糙、辛辣,饮后易上头、口干[39]。圆盘成品曲和传统颗粒曲酿造米香型白酒中杂醇油、异丁醇、异戊醇及β-苯乙醇含量的测定结果见图5。
图5 不同工艺酒曲酿造米香型白酒中杂醇油(a)、异丁醇(b)、异戊醇(c)及β-苯乙醇(d)含量的测定结果
Fig.5 Determination results of fusel oil (a), isobutanol (b), isoamyl alcohol (c), and β-phenethyl alcohol (d) contents in rice-flavor Baijiu brewed with different process Jiuqu
由图5a可知,传统颗粒曲酿造米香型白酒中的杂醇油含量[(2.15±0.15)g/L]明显低于圆盘成品曲酿造米香型白酒[(3.60±0.58)g/L],说明在传统制曲工艺下制曲酿造更有利于降低酒体中杂醇油含量,提升饮后舒适度。异丁醇和异戊醇均是白酒中的呈苦味物质[40],而β-苯乙醇是一种具有独特玫瑰风味、呈蜜香的高级芳香醇,与乙酸乙酯、乳酸乙酯相结合形成米香型白酒中特有的复合香气,由图5b~d可知,异丁醇、异戊醇及β-苯乙醇三种高级醇类物质含量整体均在圆盘成品曲酿造米香型白酒中较高,三者含量分别为(1.16±0.21)g/L、(0.81±0.15)g/L、(0.05±0.01)g/L,表明圆盘制曲工艺下更有利于具有合成β-苯乙醇能力的微生物生长繁殖。
2.3.4 乙醛及乙缩醛含量分析
圆盘成品曲和传统颗粒曲酿造米香型白酒中乙醛及乙缩醛含量的测定结果见图6。
图6 不同工艺酒曲酿造米香型白酒中乙醛(a)及乙缩醛(b)含量测定结果
Fig.6 Determination results of acetaldehyde (a) and acetal (b)content in rice-flavor Baijiu brewed with different process Jiuqu
由图6可知,两种酒曲酿造米香型白酒中的乙醛含量均高于乙缩醛,且整体上圆盘成品曲酿造米香型白酒中的乙醛含量[(0.13±0.04)g/L]略高于传统颗粒曲酿造米香型白酒[(0.09±0.03)g/L],而乙缩醛含量相反,分别为(0.04±0.01)g/L、(0.08±0.02)g/L,表明在不同生产工艺下,酒曲中的微生物代谢差异较大,传统颗粒曲中可能含有较多产缩醛酶的微生物,促进乙醛与乙醇缩合生成乙缩醛,或其菌群结构更平衡,有利于缩合反应的进行。
针对不同工艺酒曲,在理化指标方面,圆盘成品曲糖化力(28.00 g/100 g)及糖化酶活力(1 248.36 U/g)均显著高于传统颗粒曲(P<0.05),发酵力及水分含量差异不显著(P>0.05);在微生物活菌数方面,传统颗粒曲中扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)活菌数(2.67×108 CFU/g)显著高于圆盘成品曲(P<0.05),但酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)活菌数无显著差异(P>0.05)。针对不同工艺酒曲酿造的米香型白酒,圆盘成品曲酿造米香型白酒中的乙酸乙酯(0.46 g/L)、杂醇油(3.60 g/L)、β-苯乙醇(0.05 g/L)、异丁醇(1.16 g/L)、异戊醇(0.81 g/L)和乙醛(0.13 g/L)含量高于传统颗粒曲酿造米香型白酒,而乙酸(0.12 g/L)、总酯(1.60 g/L)、乳酸乙酯(1.67 g/L)及乙缩醛(0.04 g/L)含量较低。同时两种米香型白酒中乳酸乙酯、总酯含量均高于国家优级酒标准。综上,两种制曲工艺在现代酿酒行业中各有其应用价值与潜力,但圆盘制曲作为一种现代化的生产模式,在诸多方面均展现出了其独特的优势,尤其是在生产效率、产量、劳动力成本等方面,并且已然能满足企业当下生产、产品开发等多元化需求,可控性和灵活性更高,更加符合当下时代的高质量发展趋势。
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Comparison of physicochemical property,microorganism and brewing quality of Jiuqu in different process of rice-flavor Baijiu