荞麦（Fagopyrum esculentum Moench）属于蓼科荞麦属，富含膳食纤维、微量元素等多种营养成分及黄酮、糖醇及D-手性肌醇等高活性药用成分[1-2]。黄芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge）是豆科黄芪属植物，其根经过干燥后属于药食同源物质[3]。黄芪含有多种生物活性成分，包括黄酮类、多糖、皂苷类化合物等，对调节血糖、血压，保护心肌、提高人体免疫力等方面具有良好的功效[4-5]。目前，以药食同源为原料酿造的发酵酒包括人参酒、枸杞酒、桑葚酒和大枣酒等[6]。由于酒精度较低、营养丰富、口感清爽且风味独特，受到人们广泛的欢迎，并迅速发展。
目前，以药食同源黄芪为原料制备发酵酒的研究已有报道，姜莹等[7]以甜荞与苦荞为原料，优化了发酵罐发酵荞麦酒工艺条件，其酒精度、总黄酮含量分别为10.1%vol、103.30 μg/mL。尉杰等[8]优化了荞麦发芽种子液态发酵荞麦酒的工艺条件，提高了酒精度和总黄酮含量。目前，鲜见关于荞麦黄芪酒工艺条件及品质分析的研究报道。
本研究以荞麦和黄芪为原料，采用固态发酵法酿造荞麦黄芪酒，以酒精度和总黄酮含量为评价指标，采用单因素试验及响应面试验优化荞麦黄芪酒发酵条件，并采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术分析其挥发性风味物质成分，以期丰富药食同源发酵酒种类，为荞麦酒的开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄芪、荞麦：通辽市农牧科学研究院；白酒酒曲、金香霸酒曲：安琪酒曲股份有限公司。
三氯化铝、乙酸钾、芦丁、蒽酮、醋酸铅、草酸钠（纯度均＞98%）：上海麦克林生化科技股份有限公司；乙醚（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；盐酸、氯化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FA604B电子天平：苏州威尔有限公司；DH250A电热恒温培养箱：北京科伟有限公司；RE-5210A大型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；铜制酒精计：北京万成北增精密仪器有限公司；HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、7890A 5975C气相色谱-质谱联用仪：安捷伦科技（中国）有限公司；固相微萃取头（50/30 μmPDMS/DVB/CAR）、Stableflex萃取头：美国SUPELCO公司；MASS-6036ASH多样品自动固相微萃取仪：上海新拓分析仪器科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黄芪荞麦酒制备工艺流程及操作要点
荞麦、黄芪→蒸粮→摊凉→糖化→发酵→蒸馏→原酒
操作要点：
荞麦前处理：荞麦于120 ℃的烘箱中干燥2 h后，按荞麦与水的质量比为1∶2加水，室温浸泡4 h左右使荞麦吸水饱和直至用手轻轻捏即成粉状[9]。
黄芪前处理：挑选无虫蚀、无霉变的黄芪洗净，晾干后备用。
蒸粮：经前处理后的荞麦和黄芪在100 ℃条件下蒸25 min后，洒入70 ℃左右温水继续蒸10 min。其目的是使原料的淀粉颗粒细胞壁破裂，淀粉糊化，便于酒曲中的糖化微生物作用，糖化发酵。
摊凉：将蒸制糊化后的荞麦与黄芪混合物均匀撒入70 ℃的水，翻拌至松散状态，并于洁净操作台上摊晾，控制料温降至35 ℃左右，备用。
糖化、发酵：以荞麦及黄芪质量比为2∶1混合，向摊凉好的发酵物料中拌入0.2%金香霸酒曲（以荞麦及黄芪质量为基准），31 ℃条件下糖化20 h，糖化后的物料（pH值5.5）中添加1%白酒酒曲，31 ℃下发酵16 d左右，当24 h内质量损失＜0.5 g/100 g物料（以干基计）发酵结束[10]。
蒸馏：将固态发酵料放入蒸馏设备中，严格控制蒸馏温度与时间，采用单次连续蒸馏方式。根据蒸馏过程中酒液的流出顺序分为酒头、酒身、酒尾，蒸馏过程中每部分单独收集，截取酒头（约占总出酒量的1%～5%），其酒精度范围为50%vol～60%vol；完成酒头的截取后，继续蒸馏，获得蒸馏过程中酒精浓度最高的酒身（通常占总出酒量的70%～85%），其酒精度＞25%vol[11]；当酒液的酒精度开始下降，获得酒尾（约占总出酒量的10%～20%），其酒精度＜20%vol[12]。
1.3.2 黄芪荞麦酒发酵条件优化
（1）单因素试验
在每个单因素条件基础上，在固定的蒸馏条件下进行蒸馏，取酒身。以酒身的酒精度和总黄酮含量为评价指标，分别考察发酵温度（26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃、38 ℃）、初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、酒曲添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、发酵时间（12 d、14 d、16 d、18 d、20 d）对荞麦黄芪酒品质的影响。
（2）响应面试验
根据单因素试验的结果，以发酵温度（A）、初始pH值（B）、酒曲添加量（C）、发酵时间（D）为自变量，以酒精度（Y）为评价指标、总黄酮含量为参考指标[12]，采用Box-Behnken响应面试验对黄芪荞麦酒的发酵条件进行优化，Box-Benhnken试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化Box-Benhnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken tests for fermentation conditions optimization
水平 A 发酵温度/℃ B 初始pH值 C 酒曲添加量/% D 发酵时间/d-1 01 29 32 35 5.5 6.0 6.5 0.6 0.8 1.0 14 16 18
1.3.3 分析检测
（1）理化指标检测
可溶性固形物测定：采用手持糖量计；酒精度测定：采用酒精计；甲醇、氰化物测定：参照国标GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准的分析方法》[13]；酸度、总糖测定：参照国标GB 12696—2016《发酵酒及其配制酒生产卫生规范》[14]中的直接滴定法和指示剂法。总黄酮测定：采用硝酸铝显色法[15]，以吸光度值（x）为横坐标，芦丁标准品质量浓度（y）为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线回归方程y=2.538 6x-0.000 1（相关系数R2=0.998 3），计算总黄酮含量（以芦丁计）。
（2）挥发性风味物质检测
采用顶空固相微萃取-气相色谱-串联质谱（HS-SPMEGC-MS）法对荞麦黄芪酒进行挥发性风味成分检测。
HS-SPME条件：萃取头老化温度250℃，老化时间300 s，样品放进20 mL顶空瓶中预加热温度40 ℃，萃取温度60 ℃，萃取时间2 400 s，解吸温度270 ℃，解吸时间300 s。
GC条件：HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温条件为初始温度40 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至70 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至150 ℃，以10 ℃/min升至230 ℃，保持2 min；流速1.4 mL/min；质量选择检测器（mass selective detector，MSD）；载气为高纯氦气（He）（纯度99.999%），流量40 mL/min；分流进样（分流比为10∶1）；隔垫吹扫流量3 mL/min；进样口温度270 ℃。
MS条件：采用电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；传输线温度280 ℃；选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）模式；质量扫描范围为35～550 m/z；溶剂延迟1.0 min。
定性定量分析：通过美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）02质谱数据库进行定性分析，选取相似度＞80%的化合物，并通过峰面积归一化法进行相对定量。
1.3.4 数据统计与分析
采用GraphPad Prism 9.5.0进行数据处理、图像绘制，利用SPSS24.0软件进行显著性分析，采用Design-Expert 13.0对响应面试验的数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 发酵条件优化单因素试验结果
2.1.1 发酵温度的确定
合适的发酵温度能够促进酵母的活性，保证发酵速率[16]。发酵温度对黄芪荞麦酒酒精度及总黄酮含量的影响见图1。由图1可知，随着发酵温度在26～38 ℃范围内的增加，黄芪荞麦酒的酒精度、总黄酮含量均呈先升高后降低的趋势，当发酵温度为32 ℃时，酒精度及总黄酮含量均达到最高值，分别为30.3%vol、57.57 mg/L。过低的温度酵母活性较低，过高的温度不仅会影响酒曲中微生物的生长，导致酒精度下降，还会导致原料过度软化或降解，从而影响黄酮类化合物的释放[17]。因此，确定最佳发酵温度为32 ℃。
图1 发酵温度对黄芪荞麦酒酒精度及总黄酮含量的影响
Fig.1 Effect of fermentation temperature on the alcohol content and total flavonoid content of Astragalus and buckwheat wine
不同小写字母表示酒精度差异显著（P＜0.05）。不同大写字母表示总黄酮含量差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 初始pH值的确定
适当的初始pH值能够促进酵母活性、提高酒精产量，并有助于荞麦和黄芪中黄酮类功能成分释放[18]。初始pH值对黄芪荞麦酒酒精度及总黄酮含量的影响见图2。由图2可知，随着初始pH值在5.0～7.0范围内的增加，黄芪荞麦酒的酒精度及总黄酮含量均呈先升高后下降的趋势，当发酵料初始pH值为6.0时，总黄酮含量、酒精度均最高，分别为57.20 mg/L、29.8%vol。因此，确定最佳初始pH值为6.0。
图2 初始pH值对黄芪荞麦酒酒精度及总黄酮含量的影响
Fig.2 Effect of initial pH on the alcohol content and total flavonoid content of Astragalus and buckwheat wine
2.1.3 酒曲添加量的确定
酒曲添加量过少时，原料与酵母的混合不足，会导致发酵过程不完全，直接影响最终的酒精度。当酒曲添加量过多时，酵母会过度繁殖，不仅消耗掉部分还原糖，还可能产生一些不利的代谢副产物，从而影响发酵进程[19]。酒曲添加量对黄芪荞麦酒酒精度及总黄酮含量的影响见图3。由图3可知，随着酒曲添加量在0.4%～1.2%范围内的增加，黄芪荞麦酒酒精度和总黄酮含量均呈先升高后下降的趋势，当酒曲添加量分别为0.8%、1.0%时，酒精度、总黄酮含量均达到最高，分别为30.23%vol、60.25 mg/L。白酒酒曲中的微生物可以分泌酶，酶能够促催化植物细胞壁的分解，从而释放出原本被包裹的黄酮类化合物[20]。因此，确定最佳酒曲添加量为0.8%。
图3 酒曲添加量对黄芪荞麦酒酒精度及总黄酮含量的影响
Fig.3 Effect of Jiuqu addition on the alcohol content and total flavonoid content of Astragalus and buckwheat wine
2.1.4 发酵时间的确定
发酵时间对黄芪荞麦酒酒精度及总黄酮含量的影响见图4。由图4可知，随着发酵时间在12～20 d范围内的增加，黄芪荞麦酒的酒精度、总黄酮含量均呈先升高后下降的趋势，当发酵时间为16 d时，酒精度及总黄酮含量均最高，分别为31.2%vol、63.10 mg/L。当发酵时间较长时，某些代谢副产物（如醇类、酸类）积累，这些物质可能与黄酮类化合物发生化学反应，影响其稳定性或溶出，从而影响总黄酮含量[21]。因此，确定最佳发酵时间为16 d。
图4 发酵时间对黄芪荞麦酒酒精度及总黄酮含量的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on the alcohol content and total flavonoid content of Astragalus and buckwheat wine
2.2 发酵条件优化响应面试验结果与分析
在单因素试验结果的基础上，分别以发酵温度（A）、初始pH值（B）、酒曲添加量（C）、发酵时间（D）为自变量，以酒精度（Y1）为响应值，总黄酮含量（Y2）为参考值，通过Design Expert 13.0软件进行Box-Benhnken响应面试验，响应面试验设计及结果见表2，以酒精度为响应值的回归模型方差分析结果见表3。
表2 发酵条件优化Box-Benhnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Benhnken tests for fermentation conditions optimization
试验号 A B C D Y1酒精度/%vol Y2总黄酮含量/(mg·L-1）1234567891 0-1 1-1-1-1 1 0000 -0 0 0 0 -1 1 -0 0 0 0 -1-1 1 1 -1-1 11 12 1 1 -11 110000 0000 110000 11 26.8 25.3 25.6 28.3 25.3 24.8 29.2 28.9 24.3 24.0 27.6 28.5 35.53 36.83 34.72 42.68 39.40 47.86 50.23 45.52 36.77 39.83 43.29 46.58
续表
试验号 A B C D Y1酒精度/%vol Y2总黄酮含量/(mg·L-1）13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 0 0 0 0 --1 1-1-1-1 1 1 -1 1 -1-1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 -1 1 -0 0 0 0 0 0 0 0 -1-1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 28.2 28.0 27.0 27.9 25.4 27.3 26.2 25.2 25.4 25.6 29.0 29.8 30.7 30.9 31.4 32.0 32.6 49.98 44.52 38.86 49.68 42.28 50.36 43.25 40.52 37.88 38.72 43.29 47.53 63.32 65.25 64.18 62.18 65.55
表3 以酒精度为响应值的回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model with alcohol content as the response value
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14 ABCDA B AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总和148.25 0.607 5 1.02 0.963 3 46.41 4.41 2.10 0.360 0 0.302 5 0.090 0 0.010 0 63.72 16.28 26.51 29.89 1.25 0.435 8 0.812 0 149.50 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 118.81 6.82 11.45 10.81 520.73 49.48 23.59 4.04 3.39 1.01 0.1122 714.87 182.63 297.44 335.36＜0.000 1 0.020 5 0.004 5 0.005 4＜0.000 1＜0.0001 0.000 3 0.064 1 0.086 7 0.332 0 0.742 6＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1*********************10 4 28 10.59 0.607 5 1.02 0.963 3 46.41 4.41 2.10 0.360 0 0.302 5 0.090 0 0.010 0 63.72 16.28 26.51 29.89 0.089 1 0.043 6 0.203 0 0.214 7 0.977 9
通过Design-Expert 13.0软件对表2中的数据进行多元二次回归拟合，建立以酒精度（Y1）为响应值的二次多项式回归模型，得到Y1与发酵温度（A）、初始pH值（B）、酒曲添加量（C）、发酵时间（D）4个因素的多元二次回归方程：
Y1=31.52+0.225 0A+0.291 7B-0.283 3C+1.97D+1.05AB-0.725AC+0.300AD+0.275BC+0.150BD+0.050CD-3.26A2-1.71B2-2.15C2-2.28D2
由表3可知，该回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＞0.05），模型变异系数（coefficient of variation，CV）值为1.08%，表明该模型可靠性高，可充分的反映试验情况[22-23]。模型决定系数R2adj=0.991 7，调整决定系数R2adj=0.983 3，说明该模型能解释99%的响应值变化，表明试验模型拟合度良好，误差较小。由P值可知，一次项A对结果影响显著（P＜0.05），一次项B、C、D，交互项AB、AC及二次项A2、B2、C2和D2对结果影响极显著（P＜0.01），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，对酒精度影响较大的因素排序为发酵时间（D）＞初始pH值（B）＞酒曲添加量（C）＞发酵温度（A）。
各因素间交互作用对酒精度影响的响应曲面及等高线见图5。
图5 各因素间交互作用对酒精度影响的响应曲面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on alcohol content
响应曲面坡度陡峭且等高线呈椭圆形表明各因素之间的相互作用越显著[24-25]。由图5可知，AB、AC的响应曲面图较陡峭，等高线呈椭圆形，表明发酵温度（A）与初始pH值（B）之间、发酵温度（A）与酒曲添加量（C）之间的相互作用极显著。这与方差分析结果一致。
通过Design-Expert 13.0软件对回归模型进行最优求解，得到黄芪荞麦酒的最佳发酵条件为：发酵温度30.98 ℃、初始pH值5.50、酒曲添加量0.99%、发酵时间16.55 d。在此优化条件下，黄芪荞麦酒的酒精度预测值为33.17%vol，总黄酮含量预测值为65.36 mg/L。考虑到实际操作情况，将最佳的发酵条件调修正为：发酵温度31 ℃、初始pH值5.5、酒曲添加量1%、发酵时间17 d。在此条件下，酒精度实际平均值为33.06%vol，总黄酮含量实际平均值为64.46 mg/L。实际值与预测值接近，表明该模型可靠，可用于黄芪荞麦酒发酵条件优化。
2.3 黄芪荞麦酒理化指标检测结果
黄芪荞麦酒总糖（以葡萄糖计）含量为8.60 g/L，总酸（以酒石酸计）含量为4.20 g/L，甲醇含量为0.2 g/L，符合国标GB 2757—2012《食品安全国家标准蒸馏酒及其配制酒》[26]要求。
2.4 黄芪荞麦酒挥发性风味物质分析
黄芪荞麦酒挥发性风味物质检测结果见表4。
表4 黄芪荞麦酒挥发性风味物质检测结果
Table 4 Detection results of volatile flavor compounds of Astragalus and buckwheat wine
序号 种类 化合物 保留时间/min 相对含量/% 风味特征[27-30]1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0酯类11丁酸乙酯戊酸乙酯己酸乙酯乙酸异戊酯2-异氰酰丙酸乙酯庚酸乙酯乳酸乙酯辛酸乙酯苯甲酰基异硫氰酸酯硝基乙酸甲酯癸酸乙酯5.458 6.228 9.635 6.589 7.484 9.485 9.701 11.451 13.182 14.443 15.978 0.83 0.36 10.59 3.19 0.59 0.54 1.62 1.61 0.18 0.62 0.29强烈的菠萝、香蕉果香浆果清香苹果-菠萝果甜香强烈香蕉-梨果香辛辣的塑料味葡萄、椰子淡果香奶油味柑橘、梨皮果香辛辣芥子味-椰子、白脱油脂香
续表
序号 种类 化合物 保留时间/min 相对含量/% 风味特征[27-30]12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 1 2 3 4 5 1 2 3酸类烷烃类醇类酮类苯甲酸乙酯丁二酸二乙酯苯乙酸乙酯2,2-二甲基-3-羟基丙酸甲酸已酯乙酸苯乙酯丙位壬内酯壬二酸二乙酯棕榈酸乙酯反油酸乙酯亚油酸乙酯2,1,3-苯并噻二唑-4-异硫氰酸酯双（2-羟乙基）邻苯二甲酸酯丁酸己酸乙酸丙酸戊酸异辛酸正十七烷正二十烷正十九烷1-碘十三烷异丁醇乙醇苏合香醇2,3丁二醇苯乙醇2-甲基-3-庚酮2-壬酮十七烷酮16.709 16.905 19.382 19.794 9.837 20.049 24.620 28.171 28.946 32.997 33.823 34.978 36.998 15.812 20.741 11.564 18.323 17.239 33.006 31.987 32.028 32.677 33.394 18.323 23.356 22.323 20.368 21.193 9.635 17.701 19.368 0.71 3.17 0.37 0.32 1.66 0.15 0.73 0.29 3.01 1.62 1.07 1.61 1.68 0.51 4.98 4.12 0.36 0.19 0.32 0.04 0.02 0.03 0.08 2.59 39.22 5.60 0.63 0.26 1.75 0.09 0.67冬青、樱桃甜香淡果酒味蜂蜜、玫瑰甜微弱果甜苹果、李子混合果香玫瑰、桃子花香浓椰子、桃子奶香，热带水果香淡花香、油脂味蜡质、淡脂香油脂、蜡味坚果味-微甜树脂味黄油、奶香白酒窖泥味醋味奶酪味奶酪味金属味无味、微蜡感蜡味蜡质烃味碘仿味带苦的酒味酒精淡花香、杏仁甜微甜奶油、黄油味玫瑰蜂蜜香青苹果、金属酮香奶酪、蜡质果味蜡、麝香样淡味
由表4可知，黄芪荞麦酒共检出42种挥发性风味物质，其中酯类24种、醇类5种、酸类6种、烷烃类4种、酮类3种。酯类物质和醇类物质为主要的挥发性风味物质。醇类、酯类、酸类物质相对含量分别为48.30%、38.49%、10.48%，其他挥发性风味物质含量为2.73%。醇类物质中乙醇相对含量最高，可作为溶剂来溶解和携带其他香气，苏合香醇可赋予白酒淡花香，2,3丁二醇、苯乙醇呈奶油味、玫瑰蜂蜜香，增加了酒体的复杂性[31]。酯类物质中己酸乙酯和乙酸异戊酯相对含量（分别为10.59%、3.19%）较高，己酸乙酯可为黄芪荞麦酒提供柔和的苹果-菠萝果甜香，使整体香气更协调、口感更柔和[32-34]，乙酸异戊酯可使酒体更加丰满和协调，显著提升黄芪荞麦酒的风味和复杂度[35]。酸类物质中己酸、乙酸相对含量较高（分别为4.98%、4.12%），乙酸是一种挥发性酸，在较低浓度下可以为酒带来清新、清爽的口感，但过量则会产生酸味，降低酒的品质[36]。己酸是一种长链脂肪酸，可以作为其他风味化合物的前体物质，参与形成更复杂的香气和风味[37]。烷烃类、酮类物质中2-甲基-3-庚酮相对含量较高（1.75%），可赋予酒体青苹果味，增加酒的层次感及复杂性[38]。
3 结论
本研究以荞麦、黄芪为原料，接种酒曲固态发酵、蒸馏制备黄芪荞麦蒸馏酒。采用单因素试验及响应面法优化得到其最佳发酵条件为：发酵温度31 ℃、初始pH值5.5、酒曲添加量1%、发酵时间17 d。在此优化条件下，黄芪荞麦蒸馏酒的酒精度和总黄酮含量分别为33.06%vol、68.46 mg/L；总糖、总酸含量分别为8.60 g/L、4.20 g/L，甲醇含量为0.2 g/L，理化指标均符合相关国标要求。黄芪荞麦蒸馏酒样品中共检出42种挥发性风味物质，包括酯类24种、醇类5种、酸类6种、烷烃类4种、酮类3种。其中，黄芪荞麦酒主要挥发性风味物质为醇类、酯类物质。本研究可黄芪荞麦酒的开发利用提供技术支撑。
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