山西老陈醋作为中国传统名醋，其酿造工艺独特且复杂，主要包括酒精发酵和醋酸发酵两个主要阶段。大曲作为传统固态发酵的关键原料，为山西老陈醋的酿造提供了丰富的菌系、酶系和物系[1]。其中，酶系在酿造过程中起着不可替代的作用，淀粉酶在大曲中占据重要地位，能够将高粱等原料中的淀粉分解为糊精和可发酵的单糖。在酒精发酵阶段，这些单糖被酵母菌利用，转化为酒精度和其他风味物质。淀粉酶不仅提高了原料的利用率，还显著加快了发酵速度，为后续的醋酸发酵奠定了良好的基础；纤维素酶能够分解植物细胞壁中的纤维素，释放出更多的可发酵糖，从而提高原料利用率和出酒率；蛋白酶能够将原料中的蛋白质分解为小分子肽和氨基酸，为微生物的生长提供必要的氮源，还可以参与风味物质的形成，进一步丰富食醋的香气和口感。
随着现代酶技术的发展，糖化酶、纤维素酶、蛋白酶以及复合酶制剂等被广泛应用于酿造过程，在提升产品品质方面具有重要作用。滕来宾等[2]研究显示，在酒精蒸煮液化过程中，添加5 U/g木聚糖酶，使酒醪的黏度降低了16.20%，发酵残糖量降低了11.35%；有报道称，在酒精发酵过程中加入纤维素酶，可提高酒精产量7.5%～23.8%[3]；黄永光[4]在白酒发酵过程中向酒醅添加蛋白酶，发现其不仅能将酒精度提高至原有酒精度的138%，而且还能在较大程度上将成品酒的挥发性成分和总酸含量提升至284%和136%；毕静[5]对镇江香醋的醋酸发酵阶段进行了蛋白酶强化的小试生产试验，发现添加蛋白酶使醋醅酸度提高了1.33%，氨基酸态氮含量提高了40%。目前酿造领域关于酶制剂强化应用的研究，主要聚焦于单一酶制剂在酒精或醋酸发酵阶段的实验室小试应用，这类研究往往难以真实反映实际生产环境中酶制剂的应用效果。因此有必要对复合酶制剂在酒精发酵和醋酸发酵过程中的应用进行研究。
山西老陈醋的主要原料高粱富含木聚糖与纤维素类物质，而兼具木聚糖酶与纤维素酶活性的SFQ200复合酶作为新型酶制剂，在传统固态发酵酿造工艺中尚鲜见工业化应用研究报道。本研究将新型酶制剂SFQ200复合酶与蛋白酶应用于酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段，并在醋厂进行中试试验。通过动态监测酿造过程中的基础理化指标、游离氨基酸以及有机酸的变化，旨在全面探讨这两种酶制剂在酒精和醋酸发酵过程中的综合应用效果，为山西老陈醋等传统酿造产业的工艺改进和品质提升提供崭新的思路与方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
SFQ200复合酶（其中木聚糖酶酶活≥2 000 U/g，纤维素酶酶活≥100 U/g）、蛋白酶（酶活≥8 000 U/g，最适pH 4.0～5.0）：杭州保安康生物技术有限公司；大曲：山西老陈醋集团有限公司；高粱：山西汾阳市永信蔚高粱专业合作社；麸皮：山西丰联农业有限公司；谷糠：文水县农盛贸易有限公司；酵母菌：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 试剂
草酸、丙酮酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸（均为色谱纯）：天津市光复精细化工研究所；L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸标准品（纯度均＞98%）：曼哈格（北京）生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
DR403-P酒精计：上海奥豪斯仪器有限公司；PB-21酸度计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；戴安U3000液相色谱仪、戴安ICA-1500离子色谱仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Eppendorf 5417R离心机：艾本德（中国）有限公司；30+氨基酸自动分析仪：英国Biochrom公司。
1.3 方法
1.3.1 山西老陈醋制作工艺及操作要点
高粱→加水润料→蒸制→焖料→摊凉→拌曲→入缸→酒精发酵→醋酸发酵→加盐→熏醅→淋醋
操作要点：高粱粉碎至四至六瓣，300 kg高粱加入120 kg水润料12 h，将润好的高粱蒸1.5 h，无夹心不粘手时停火；再加660 kg温度为80 ℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25～33 ℃时拌入120 kg的大曲，搅拌均匀后移入到酒精发酵缸中，加入质量分数0.1%酵母菌（以主粮计），搅拌均匀，酒精发酵10 d，前3 d为敞口发酵，之后封口发酵。酒精发酵结束后，加入120 kg麸皮和160 kg的谷糠，搅拌均匀，移入到醋酸发酵缸中，加入10%火醅（上一批发酵第2天的醋醅）（以混合干料计），醋酸发酵9 d，加入质量分数10%食盐（以混合干料计），终止发酵。醋醅采用天然气熏醅（梯度升温从40 ℃升至80 ℃），熏5 d，每天倒醅。按主粮质量5倍加入90 ℃热水于熏醅中，浸泡4 h后过滤得新淋醋。
1.3.2 酶制剂在山西老陈醋酿造过程中强化应用实验
酶制剂在不同发酵阶段强化应用：在拌入大曲时，加入酶制剂进行酒精发酵阶段强化；在拌入麸皮和谷糠等辅料时，加入酶制剂进行醋酸发酵阶段强化；在拌入大曲和拌入麸皮和谷糠时均添加酶制剂进行共同强化，具体情况见表1。
表1 SFQ200复合酶和蛋白酶在山西老陈醋酿造过程中的应用试验设计
Table 1 Experimental design for the application of SFQ200 compound enzyme and protease in the brewing process of Shanxi aged vinegar
酒精阶段处理 醋酸阶段处理对照组酒精发酵阶段强化J-SFQ200组J-蛋白酶组J-SFQ200+蛋白酶组40%大曲+0.1%酵母菌40%大曲+0.1%酵母菌+0.1%SFQ200复合酶40%大曲+0.1%酵母菌+0.1%蛋白酶40%大曲+0.1%酵母菌+0.1%SFQ200复合酶+0.1%蛋白酶——
续表
注：酒精发酵阶段：J-SFQ200组、J-蛋白酶组、J-SFQ200+蛋白酶组和J，C-SFQ200+蛋白酶组中酶制剂用量以酒醪总体积为基准进行添加；醋酸发酵阶段：C-SFQ200组、C-蛋白酶组、C-SFQ200+蛋白酶组和J，C-SFQ200+蛋白酶组中酶制剂用量以混合干料质量为基准进行添加。
酒精阶段处理 醋酸阶段处理醋酸发酵阶段强化酒精和醋酸发酵阶段共同强化C-SFQ200组C-蛋白酶组C-SFQ200+蛋白酶组J,C-SFQ200+蛋白酶组40%大曲+0.1%酵母菌40%大曲+0.1%酵母菌40%大曲+0.1%酵母菌40%大曲+0.1%酵母菌+0.1%SFQ200复合酶+0.1%蛋白酶0.1%SFQ200复合酶0.1%蛋白酶0.1%SFQ200复合酶+0.1%蛋白酶0.1%SFQ200复合酶+0.1%蛋白酶
1.3.3 样品采集方法
对山西老陈醋整个酿造阶段进行动态采样。分别在酒精发酵第0、1、2、3、5、7、9、10天从3个酒精发酵缸内各采集100 mL酒醪样品，于灭菌广口瓶中均匀混合；醋酸发酵第0、1、3、5、7、9天从3个醋酸发酵缸中，距醋醅表面30 cm处，各选取4个点各采集约100 g刚完成翻醅的醋醅样品，于无菌自封袋中混匀；上述样品及新淋醋样品存放于-80 ℃保存[6]。
1.3.4 分析检测
（1）理化指标的测定
样品前处理方法：酒醪：取样250 mL，用8层纱布进行过滤，吸取滤液10 mL，再加入90 mL蒸馏水稀释10倍备用；醋醅：50 g样品用450 mL蒸馏水浸泡2 h，过滤取滤液备用；新淋醋：取样品20 mL，再加入180 mL蒸馏水稀释20倍备用。
参照国标GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》[7]的方法测定总酸、氨基酸态氮、总酯、还原糖、不挥发性酸含量；参照GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒及配制酒卫生标准的分析方法》[8]中比重计法测定酒精度；参照酸水解法[9]测定淀粉含量。
（2）游离氨基酸的测定
外标物的配制及标准曲线绘制：分别配制0.125 mmol/L胱氨酸，0.25 mmol/L其他氨基酸，将不同浓度梯度氨基酸标准溶液在同样的条件下进样，每个浓度重复2次，绘制标准曲线[10]。
取新淋醋1 mL与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH=2.2）以1∶15的比例混合，过0.22 μm滤膜，将所得滤液进行氨基酸分析。参考文献[11]中氨基酸自动分析仪的检测条件，以标准品保留时间定性，采用峰面积外标法对新淋醋中的游离氨基酸进行定量分析。
（3）有机酸含量的测定
外标物的配制：分别配制0.3 g/L草酸、0.5 g/L酒石酸、1.25 g/L丙酮酸、0.5 g/L苹果酸、5 g/L乳酸、10 g/L乙酸、0.5 g/L柠檬酸及1 g/L琥珀酸共8种有机酸的混合标准溶液作为外标物。
采用高效液相色谱法进行新淋醋有机酸含量测定。高效液相色谱条件：Agilent ZORBAX-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）；20 mmol/L NaH2PO4作为流动相；进样量20 μL；流动速度0.8 mL/min；波长为210 nm；柱温30 ℃，采用外标法对新淋醋中的有机酸进行定量分析。以各有机酸的保留时间定性，将不同质量浓度的有机酸标准液分别进样，采用峰面积外标法定量[12]。
1.3.5 数据处理
所有样品均重复进行3次测定，使用SPSS 25.0软件对数据进行方差分析，在P＜0.05时表示处理的结果存在显著性差异，并采用Excel 2023进行绘图。
2 结果与分析
2.1 SFQ200复合酶和蛋白酶在酒精发酵阶段的强化应用
在酒精发酵阶段SFQ200复合酶和蛋白酶强化应用对酒醪理化指标的影响结果见图1。由图1A可知，酒精发酵初期，对照组酒醪的酒精度由发酵第1天的3.70%vol急剧上升至发酵第2天的6.00%vol，之后呈平稳上升趋势，到酒精发酵结束升至7.80%vol。与对照组相比，强化组酒醪中酒精度较高，尤其是J-SFQ200+蛋白酶组的酒精度提升最为显著，酒精发酵第10天，其酒醪的酒精度为8.80%vol，相较于对照组提高了12.82%。这是因为SFQ200复合酶和蛋白酶有助于原料细胞壁的分解，加速淀粉酶的作用，同时纤维素酶有助于高粱中的纤维素类物质降解成糖类，进而发酵成酒精，从而提高原料的出酒率[3]。相类似的是，李兰[13]在生料酒曲中添加2%～3%的蛋白酶，应用于以大米、玉米和高粱等为原料的生料酿酒生产中，原料出酒率提高了1.84%～2.68%；OGASAWARA H等[14]将木聚糖酶应用于大麦烧酒制作过程中，发现酒精的产率增加。
图1 酒精发酵阶段SFQ200复合酶和蛋白酶强化应用对酒醪理化指标的影响
Fig.1 Effect of SFQ200 compound enzyme and protease strengthening during alcohol fermentation stage on physicochemical indicators of fermented mash
由图1B可知，在酒精发酵第1～2天，酒醪pH下降趋势最为明显，对照组pH由5.60急剧下降至4.20，这可能是由于酒精发酵初期，酵母菌以及乳酸菌、芽孢菌等其他微生物快速生长，从而产生酸性代谢物质，使得酒醪pH迅速降低，而随着发酵进行，酒醪中的代谢产物种类和含量不断增加，构成了缓冲体系，使得酒醪pH在酒精发酵中期至末期呈现稳定波动变化[15]。与对照组相比，试验组酒醪pH较低，酒精发酵末期，J-SFQ200+蛋白酶组酒醪pH最低，为3.06。
由图1C和图1D可知，在酒精发酵第1～2天，酒醪中淀粉和还原糖的含量急剧下降，对照组的淀粉和还原糖分别由15.84 g/100 mL、4.50 g/100 mL下降至11.66 g/100 mL、1.80 g/100 mL，发酵第2～5天，淀粉和还原糖的含量下降趋势较为缓慢，之后趋于稳定。与对照组相比，试验组酒醪中淀粉含量较低，而还原糖含量较高，这是因为添加SFQ200复合酶和蛋白酶，有利于淀粉酶分解原料中淀粉和纤维素，生成更多的还原糖。
由图1E可知，在酒精发酵阶段，酒醪总酯含量呈下降趋势。相较于对照组，试验组酒醪中总酯含量较高，尤其是SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化（J-SFQ200+蛋白酶组）最为明显，酒精发酵第10天，其总酯含量可达0.96 g/100 mL，相较于对照组，提高了11.68%，这是由于在SFQ200复合酶和蛋白酶共同作用下，进一步促进原料中淀粉和蛋白质的充分分解，有利于酯类前体物质的形成以及酯类物质的合成。
由图1F可知，氨基酸态氮含量在酒精发酵过程中呈上升趋势，对照组酒醪氨基酸态氮含量由第1天的0.01 g/100 mL逐渐升至第9天的0.12 g/100 mL，而后趋于稳定，这是由于大曲中蛋白酶分解高粱中蛋白质，释放出游离氨基酸，这些氨基酸在进一步的生化反应中转化为氨基酸态氮。与对照组相比，添加蛋白酶的试验组（J-蛋白酶组和J-SFQ200+蛋白酶组）中氨基酸态氮含量提升较为明显，酒精发酵第10天，J-蛋白酶组和J-SFQ200+蛋白酶组氨基态氮含量分别为0.23 g/100 mL和0.25 g/100 mL，较对照组分别提高76.92%和92.31%，这是由于SFQ200复合酶能将包裹蛋白质的纤维素充分分解，使蛋白质的裸露状态，同时额外添加了蛋白酶，有利于蛋白酶更加完全地分解蛋白质，从而生成更多的氨基酸态氮[6]。
综上，在酒精发酵阶段，SFQ200复合酶和蛋白酶的强化应用明显提升了酒醪的理化指标。因此，SFQ200复合酶和蛋白酶在酒精发酵阶段的强化应用对山西老陈醋的酿造具有重要意义。
2.2 SFQ200复合酶和蛋白酶在醋酸发酵阶段的强化应用
醋酸发酵阶段SFQ200复合酶和蛋白酶强化应用对醋醅理化指标的影响见图2。由图2A可知，醋酸发酵初期，对照组醋醅还原糖含量由第1天的2.40 g/100 g急剧上升至第3天的2.85 g/100 g，这是由于醋酸发酵阶段酒醪拌入大量的麸皮、谷糠等辅料，多种酶将辅料中淀粉、纤维素等大分子物质分解；随后醋醅中醋酸菌、乳酸菌、芽孢菌大量生长繁殖消耗还原糖，醋醅中还原糖含量逐渐下降，发酵第9天降至0.48 g/100 g。与对照组相比，试验组的醋醅中还原糖的含量较高，尤其是添加SFQ200复合酶的C-SFQ200组和C-SFQ200+蛋白酶组，醋酸发酵第9天，其还原糖含量分别为1.28 g/100 g、1.52 g/100 g，分别是对照组的2.67倍和3.17倍。
图2 醋酸发酵阶段SFQ200复合酶和蛋白酶强化应用对醋醅理化指标的影响
Fig.2 Effect of SFQ200 compound enzyme and protease strengthening during acetic acid fermentation stage on physicochemical indicators of Cupei
由图2B可知，在醋酸发酵过程中，醋醅中酒精度呈下降趋势，对照组醋醅的酒精度由刚拌完醅时的4.50%vol降至醋酸发酵第5天的0，这是因为醋酸发酵阶段产主体酸的醋酸菌在酒精度脱氢酶和乙醛脱氢酶的作用下，通过呼吸链将大量酒精度氧化为乙酸[16]。相较于对照组，试验组醋醅中酒精度减少速度较快，尤其是添加两种酶制剂进行强化的C-SFQ200+蛋白酶组，醋酸发酵第3天酒精度降至0，这是由于添加两种酶制剂能加快原辅料中大分子物质分解速率，提供了充足营养物质，醋酸菌大量生长繁殖，高效地利用酒精度进行代谢，从而更快地降低了酒精度。这一结果表明在醋酸发酵阶段添加SFQ200复合酶和蛋白酶，具有缩短发酵周期和提高生产效率的潜力。
由图2C和图2D可知，总酸和不挥发性酸在醋酸发酵第1～5天均呈上升变化趋势，对照组醋醅总酸和不挥发酸的含量由醋酸发酵初始的1.69g/100g、1.08g/100g升至第9天的5.16 g/100 g、1.40 g/100 g。与对照组相比，试验组的醋醅总酸和不挥发性酸较高，特别是C-SFQ200+蛋白酶组提高较明显，醋酸发酵第9天，C-SFQ200+蛋白酶组的醋醅总酸含量为5.81 g/100 g，较对照组提高了12.60%；C-SFQ200+蛋白酶组的醋醅不挥发性酸含量1.76 g/100 g，较对照组提高了33.33%，这是由于SFQ200复合酶中的多种酶类协同作用，促进了淀粉、纤维素等大分子物质的降解，增加能被微生物利用的小分子物质，如葡萄糖、果糖等，为醋酸菌的生长和代谢提供了更为丰富的底物；蛋白酶能分解原辅料中蛋白质生成游离氨基酸，被乳酸菌等其他微生物利用转化成酸。
由图2E可知，醋酸发酵第1～5天，醋醅的总酯含量由2.29 g/100 g逐渐上升至4.33 g/100 g，这是因为发酵前期醋酸菌、乳酸菌产酸，在酯化酶作用下与酒精度结合生成酯；随着发酵的进行，醋醅中醇类含量不断减少，总酯生成量减少，有些微生物开始利用酯类物质，因此总酯含量下降，醋酸发酵9 d对照组醋醅总酯含量降至3.08 g/100 g，C-SFQ200组、C-蛋白酶组和C-SFQ200+蛋白酶组的醋醅总酯含量分别为3.91 g/100 g、3.38 g/100 g和4.04 g/100 g，相较于对照组分别提高了20.95%、9.74%、31.17%，这是因为醋酸发酵阶段加入SFQ200复合酶和蛋白酶，产总酸含量和产不挥发性酸速率较快，在酒精发酵阶段产生酒精度未消耗完情况下，进行酯化反应。
由图2F可知，醋酸发酵阶段醋醅中氨基酸态氮的含量呈缓慢上升的趋势，试验组的氨基酸态氮含量高于对照组，特别是添加蛋白酶的C-蛋白酶组和C-SFQ200+蛋白酶组，分别从醋酸发酵第1天的0.18 g/100 g和0.17 g/100 g上升至第9天的0.23 g/100 g和0.25 g/100 g。醋酸发酵第9天，相较于对照组（0.18 g/100 g），C-蛋白酶组和C-SFQ200+蛋白酶组分别提高了27.78%和38.89%，这是因为醋酸发酵阶段蛋白酶活性较低，额外添加蛋白酶进行强化，主要含有酸性蛋白酶，其最适pH值为2.5～4.5，能将谷糠和麸皮辅料中的蛋白质分解成氨基酸[5]，而SFQ200复合酶加入能高效分解水不溶性纤维素、半纤维素，降解麸皮和谷糠等植物细胞壁，有利于蛋白质进一步释放。
综上，SFQ200复合酶和蛋白酶在醋酸发酵阶段的强化应用明显提升了山西老陈醋的理化指标。相较于对照组，添加SFQ200复合酶和蛋白酶的试验组在还原糖含量、酒精度消耗、总酸和不挥发性酸生成、氨基酸态氮含量以及总酯含量等方面均表现出明显优势。
2.3 SFQ200复合酶和蛋白酶在酒精发酵和醋酸发酵阶段共同强化应用
酒精发酵阶段产生的代谢产物酒精度可以为醋酸发酵阶段提供更丰富的底物，而醋酸发酵阶段的高效转化则依赖于酒精发酵阶段的高产量，两个发酵阶段形成了一个连续的代谢网络，因此将SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化应用在酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段，对各发酵阶段的理化指标进行监测，进一步探讨两种酶制剂共同强化应用在酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段的效果，结果见图3。
图3 酒精发酵和醋酸发酵阶段SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化对醋醅理化指标的影响
Fig.3 Effect of SFQ200 compound enzyme and protease dual-strengthening during alcohol fermentation and acetic acid fermentation stages on physicochemical indicators of Cupei
SFQ200复合酶中含有木聚糖酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶等多种酶以及膨胀蛋白等酶活辅助因子，能打开原料木质素-纤维素、纤维素-纤维素之间的交联，可以高效分解水不溶性纤维素、半纤维素，降解植物细胞壁，促进养分的释放，高效分解水溶性非淀粉多糖，使原料中的淀粉、纤维素大量分解产生还原糖；蛋白酶既可以将原料中的蛋白质分解成氨基酸，又能促使L-氨基酸被菌株所吸收，最终促进菌株的生长代谢[17]。由图3可知，在SFQ200复合酶和蛋白酶协同作用下，醋酸发酵阶段，相较于对照组，试验组醋醅中酒精度下降速率加快，还原糖、总酸、不挥发酸和氨基酸态氮的含量明显增加，醋酸发酵第9天，试验组醋醅中还原糖、总酸、不挥发性酸和氨基酸态氮含量分别为1.53 g/100 g、5.48 g/100 g、1.79 g/100 g、0.26 g/100 g，分别提高了125%、5.58%、11.18%、44.44%。相较于对照组，试验组在醋酸发酵阶段表现出更高的总酯生成量，在醋酸发酵第5天总酯含量达到峰值为5.23 g/100 g，相较于对照组显著提高了20.79%，随着发酵时间的延长，微生物数量减少，代谢产生的醇类和酸类随之减少，酯化反应减弱，一些微生物分解酯类物质，总酯含量开始下降。
综上，SFQ200复合酶和蛋白酶在山西老陈醋酿造过程中的共同强化应用，不仅优化了酒精发酵和醋酸发酵阶段的代谢网络，还提升了老陈醋的品质。通过协同作用，这两种酶制剂有效促进了原料的分解和养分的释放，提高了酒精发酵过程中酒精度和氨基酸态氮的含量，加速了醋酸发酵过程中酒精度的下降速率，并增加了还原糖、总酸、不挥发酸和氨基酸态氮的含量。此外，SFQ200复合酶和蛋白酶的共同强化应用在醋酸发酵阶段表现出更高的总酯生成量，进一步丰富了老陈醋的风味。
2.4 SFQ200复合酶和蛋白酶在酒精发酵和醋酸发酵阶段共同强化对新淋醋的影响
2.4.1 对新淋醋理化指标的影响
将SFQ200复合酶和蛋白酶强化应用于山西老陈醋的酒精发酵和醋酸发酵阶段，对新淋醋的理化指标进行测定，结果见图4。由图4可知，在酒精发酵和醋酸发酵阶段共同强化的试验组的新淋醋pH、总酸、不挥发性酸、氨基酸态氮、还原糖和总酯含量分别为3.56、5.73 g/100 mL、2.40 g/100 mL、0.30 g/100 mL、1.74 g/100 mL、3.16 g/100 mL。相较于对照组，试验组新淋醋的总酸、不挥发性酸、氨基酸态氮、还原糖和总酯含量分别显著提高了16.70%、79.10%、100.00%、24.90%、17.68%（P＜0.05）。这结果表明SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化能显著改善新淋醋的理化特性，显示了SFQ200复合酶和蛋白酶在山西老陈醋酿造中具有潜在应用价值。
图4 酒精发酵和醋酸发酵阶段SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化对新淋醋理化指标的影响
Fig.4 Effect of SFQ200 compound enzyme and protease dualstrengthening during alcohol fermentation and acetic acid fermentation stages on physicochemical indicators of new leaching vinegar
“*”表示与对照组相比差异显著（P＜0.05）；“**”表示与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。下同。
2.4.2 对新淋醋游离氨基酸的影响
游离氨基酸不仅是食醋的重要营养成分，而且对食醋的香气、口感和外观都有重要贡献，具有提鲜、增香、矫正酸味等功能，能够缓冲乙酸的刺激酸味协调风味的作用[18-20]。酒精发酵和醋酸发酵阶段SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化对新淋醋游离氨基酸含量的影响见图5。由图5可知，对风味有贡献的氨基酸分为鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸，其中甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸对食醋滋味贡献较大[22]，与对照组相比，试验组谷氨酸、亮氨酸、和丙氨酸等特征氨基酸含量提升显著（P＜0.05），分别提高了45.57%、14.00%、和28.84%，其中谷氨酸赋予食醋鲜味，亮氨酸赋予食醋苦味，丙氨酸赋予食醋甜味，使得试验组新淋醋的风味更为丰富、协调，整体口感更佳。此外，试验组的天冬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸和胱氨酸含量较对照组提升显著（P＜0.05）。这是因为山西老陈醋的酿造过程中游离氨基酸的来源主要包括原料中的蛋白质分解以及微生物的代谢活动，SFQ200复合酶和蛋白酶的共同强化应用，使原辅料中蛋白质得到充分分解，促进了氨基酸的释放和生成，同时也促进微生物生长代谢。因此，在发酵阶段进行SFQ200复合酶和蛋白酶强化不仅能够提升食醋的营养价值，而且丰富新淋醋的风味层次，提升了整体口感。
图5 酒精发酵和醋酸发酵阶段SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化对新淋醋游离氨基酸含量的影响
Fig.5 Effect of SFQ200 compound enzyme and protease dualstrengthening during alcohol fermentation and acetic acid fermentation stages on free amino acid contents of new leaching vinegar
2.4.3 对新淋醋有机酸的影响
食醋中大部分有机酸的生成依赖于微生物的代谢作用，而仅有少数源自原料本身[23-24]。乙酸主要是由醋酸菌的代谢活动产生的，而乳酸的形成主要与乳杆菌属和醋杆菌属有关；丙酮酸在乳杆菌属和醋杆菌属的共同作用下可转化为苹果酸；琥珀酸的产生则涉及酵母属、醋杆菌属和Komagataeibacter；柠檬酸的代谢主要依赖醋杆菌属，其次是链球菌属和酵母属；酒石酸只能通过草酰乙酸途径合成，并且仅有少数乳杆菌属参与这一过程[25]。SFQ200复合酶和蛋白酶加速醋醅中淀粉、纤维素和蛋白质降解为葡萄糖和其他单糖、低聚糖以及氨基酸，为微生物的生长和代谢提供了更适宜的环境。这种环境的优化，显著促进了微生物的代谢活性，使得参与有机酸合成的各类微生物能够更高效地利用底物进行发酵，从而大幅提高了有机酸的含量。酒精发酵和醋酸发酵阶段SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化对新淋醋有机酸含量的影响见图6。由图6可知，在两个发酵阶段进行蛋白酶和SFQ200复合酶的共同强化的试验组新淋醋有机酸总量为4.60 g/100 mL，与对照组相比，显著提升了30.46%，其中占比较高的乙酸和乳酸含量分别为2.38g/100mL、1.16g/100mL，分别显著提高了22.34%、39.37%（P＜0.05）；其次丙酮酸、琥珀酸和苹果酸也提升显著，含量依次为0.05g/100 mL、0.26 g/100 mL和0.38 g/100 mL，较对照组分别显著提高了400.00%、86.06%和41.72%（P＜0.05）。乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸和苹果酸分别赋予食醋刺激性、柔和、微弱带有涩感、稍带鲜味和清爽的酸味。这表明在两个发酵阶段联合使用蛋白酶和SFQ200复合酶不仅优化了发酵环境，还显著提高了微生物的代谢活性，使得有机酸的产生更为高效，从而提升了新淋醋的风味品质。
图6 酒精发酵和醋酸发酵阶段SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化对新淋醋有机酸含量的影响
Fig.6 Effect of SFQ200 compound enzyme and protease dualstrengthening during alcohol fermentation and acetic acid fermentation stages on organic acids contents of new leaching vinegar
3 结论
本试验研究了SFQ200复合酶和蛋白酶不同强化方式对山西老陈醋酿造过程中应用效果。通过对比分析结果表明，在发酵过程中，添加蛋白酶能提高总酸、不挥发性酸和氨基酸态氮含量；添加SFQ200复合酶能提高还原糖含量。醋酸发酵和酒精发酵两个阶段同时进行SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化不仅能够显著提升新淋醋的理化指标，还显著增加新淋醋中游离氨基酸和苹果酸、琥珀酸等特征有机酸的含量，从而赋予了新淋醋更加独特和浓郁的风味品质。在不同强化方式中，SFQ200复合酶和蛋白酶共同强化应用效果更好，但关于两者协同的具体机制仍需进一步探索。该研究为酶制剂强化技术优化山西老陈醋的酿造工艺提供了科学依据，同时也为传统发酵食品的现代化改造提供了新的技术路径。
[1]陈旭峰，刘丹彤，王佳丽，等.山西老陈醋大曲真菌群落结构及多样性分析[J].中国食品学报，2021，21（10）：206-214.
[2]滕来宾，郭庆文，周立国，等.新型酶制剂在酒精生产中的应用[J].酿酒，2022，49（6）：120-123.
[3]美合热阿依·木台力甫，凯迪日耶·玉苏普，王继莲.微生物来源纤维素酶的工业应用进展[J].农产品加工，2021（16）：60-62.
[4]黄永光.酱香型白酒酿造中Aspergillus hennebergii及其分泌酸性蛋白酶的研究[D].无锡：江南大学，2014.
[5]毕静.蛋白酶在镇江香醋生产中的应用研究[J].粮食与食品工业，2021，28（1）：59-60，64.
[6]陈科羲.山西不同醋厂陈醋酿造过程中微生物、基础理化和风味成分的差异性[D].晋中：山西农业大学，2022.
[7]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 19777—2013 地理标志产品 山西老陈醋[S].北京：轻工业出版社，2013.
[8]中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.48—2003 蒸馏酒及配制酒卫生标准的分析法[S].北京：轻工业出版社，2003.
[9]炊伟强.大曲传统感官评价与其内在质量、理化指标的关系[D].无锡：江南大学，2010.
[10]梁楷，王宏霞，孙晓琪，等.不同陈酿年份市售山西老陈醋理化指标、风味和功能成分的比较[J].中国酿造，2023，42（3）：41-46.
[11]张璟琳，黄明泉，孙宝国.四大名醋的游离氨基酸组成成分分析[J].食品安全质量检测学报，2014，5（10）：3124-3131.
[12]张天震.山西老陈醋微生物酿造机理及四大名醋指纹图谱差异性研究[D].晋中：山西农业大学，2019.
[13]李兰.蛋白酶在生料酿酒中的应用研究[J].食品与发酵科技，2002，38（3）：3-26.
[14]OGASAWARA H,TAKAHASHI K,IITSUKA K,et al.Contribution of hemicellulase in Shochu koji to the resolution of barley in shochu mash[J].J Soc Brewing Jpn,2019,86(4):304-307.
[15]陈旭峰，朱丹，郭宏萍，等.山西老陈醋酿造过程中理化指标动态变化及新淋醋品质分析[J].中国酿造，2021，40（12）：52-57.
[16]吴艳芳.山西老陈醋发酵过程微生物相互作用及有机酸代谢调控机制解析[D].天津：天津科技大学，2021.
[17]向双全，周志刚，张志刚，等.大曲蛋白酶对固态酿酒发酵的影响[J].酿酒科技，2016（7）：47-50.
[18]JIANG Y,LV X, ZHANG C, et al.Microbial dynamics and flavor formation during the traditional brewing of Monascus vinegar[J].Food Res Int,2019,125:108531.
[19]赵顺华，朱胜虎.四种传统谷物醋氨基酸组成特征的对比[J].中国酿造，2023，42（8）：97-102.
[20]黄婷.镇江香醋酿造微生物功能解析及酿醋人工菌群构建[D].无锡：江南大学，2022.
[21]李婷，王争争，李慧，等.四大名醋呈味物质比较分析[J].中国调味品，2020，45（10）：144-147.
[22]郑宇，程程，刘静，等.中国传统固态发酵食醋主要特征风味物质组成分析[J].中国食品学报，2020，20（8）：237-247.
[23]KONG Y,ZHANG L,SUN Y,et al.Determination of the free amino acid,organic acid, and nucleotide in commercial vinegars[J].J Food Sci,2017,82(5):1116-1123.
[24]NAKAYAMA S,TABATA K,OBA T,et al.Characteristics of the high malic acid production mechanism in Saccharomyces cerevisiae sake yeast strain No.28[J].J Biosci Bioeng,2012,114(3):281-285.
[25]SHANG G L,SUN X,ZHANG C,et al.Genome identification and analysis of genes encoding the key enzymes involved in organic acid biosynthesis pathway in apple,grape,and sweet orange[J].Scientia Horticult,2015,185:22-28.