酱油是以大豆、豆粕等为主要原料，面粉、小麦等淀粉类物质和食盐等为辅料，通过微生物发酵而成的一类具有特殊色泽、香气、滋味和组织状态的液态调味品[1-2]。随着气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）、气相色谱-嗅觉测量法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等技术的广泛应用，酱油风味成分的分析取得了显著进展。目前日本酱油中已明确的挥发性风味成分有300多种，主要包括烃类、醇类、酮类、醛类、酸类、酯类、呋喃（酮）、酚类、吡喃（酮）、吡啶、吡嗪和含硫化合物等[2-5]。近年来对高盐稀态酱油挥发性风味物质组成、含量和分子感官方面开展了系列研究，并取得了大量研究成果[6-9]。我国传统酿造酱油（采用传统手工工艺为主的酿造方法，主要表现为小容积陶缸长周期日晒夜露方式进行酱醪发酵。）挥发性风味成分的研究也取得了一定进展，通过不同的香气物质提取方法结合气质联用技术（GC-MS）已鉴定出300余种具有香气特征的风味物质，包括酸类、醇类、酯类、醛酮类、吡嗪类、呋喃类、吡咯类和含硫化合物等[10-13]。
近年来，研究人员广泛研究了挥发性风味化合物对酱油香气的贡献，越来越多的风味物质被鉴定出来[14-16]。DIEZSIMON C等[6]将酱油香气的特点归类为焦糖香、花香、烟熏香气、麦芽香和煮土豆香气，并对不同风味化合物的香气特征进行了描述，包括酸、醇、醛、酯、呋喃酮、吡嗪和含硫化合物等。随着GC-O技术的不断发展，研究人员对酱油中挥发性风味物质的香气贡献做了深入的研究，计算了不同风味化合物的气味活度值（odor activity value，OAV）和风味稀释因子（dilution factor，FD），越来越多的风味化合物被确定。ZHAO G等[17]通过主成分分析（principal component analysis，PCA）和气相色谱-嗅觉-质谱（gas chromatographyolfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS），确定5-甲基-2-呋喃甲硫醇（OAV 284～467）、3-甲基丁醛（OAV 409～938）、苯乙醛（OAV 47.4～566）、2-苯乙醇（OAV 7.41～14.3）、苯乙基乙酸酯（OAV 7.00～18.1）和苯乙酸乙酯（OAV 12.7～21.3）为酱油中的典型呈香化合物。在黑豆酱油香气活性化合物的分析中，共鉴定出126种挥发性风味化合物，包括44种呈香化合物和22种重要呈香化合物，与黄豆酱油相比，黑豆酱油果香增加了63%，而麦芽香、醇香、花香、烟熏香气、焦糖香和酸味减少了24%～35%[18]。DIEZ-SIMONC等[19]使用搅拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）-GC-MS对不同产地酱油的挥发性物质进行代谢组学分析，共鉴别出37种风味化合物的气味特征，并可将挥发风味物质含量的差异与生产历史、产地关联起来。
以龙牌酱油为代表的高盐稀态酱油在我国依然是酱油生产的重要分支[20]。近年来，越来越多的酱油品牌推出传统酿造产品。然而，酱油挥发性风味物质的研究主要集中于日式酱油和广式酱油[9，21]，对于传统酿造酱油挥发性风味物质研究较少。GC-IMS与GC×GC-TOF-MS对于不同化合物的检测灵敏度是不一致的，前者对于醛酮类化合物分辨率更高，而后者对中高沸点化合物的检出能力更强，因此可两者结合起来分析酱油样品中挥发风味物质。本研究以湖南传统高盐稀态酱油和广东高盐稀态酱油为研究对象，采用常规检测方法、气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）、全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOF-MS）技术及感官评价，对不同地区高盐稀态酱油的理化指标、挥发性风味物质及感官特性进行分析，并结合层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）进行差异分析，旨在对高盐稀态酱油地域划分、企业品牌标准体系建立提供科学依据，对高盐稀态酱油产区分类有一定的指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
本研究所用样品均为特级酱油成品。湖南传统高盐稀态酱油样品（编号为LOP1）（主要原料为水、非转基因大豆、面粉、食盐等）：龙牌食品股份有限公司；广东高盐稀态酱油样品（编号为HAY）（主要原料为水、非转基因大豆、小麦、食盐等）、广东高盐稀态酱油样品（编号为LKJ）（主要原料为水、非转基因大豆、面粉、食盐等）：广东省某酱油生产企业。
1.1.2 化学试剂
1-己醇-d13、特戊酸、愈创木酚-d3、辛酸乙酯-d15（均为色谱纯）：Sigma（上海）有限公司；氢氧化钠、盐酸、硝酸银（均为分析纯）、C4～C9正构酮（均为色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
PHS-3C pH计、ZDJ-4B自动电位滴定仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；KLCP3010-XH消化炉、KDN-04A凯氏定氮仪：德恩斯仪器科技（无锡）有限公司；490 Micro型气相色谱仪、Agilent 7890气相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；
气相色谱-离子迁移谱联用仪：德国G.A.S公司；固相微萃取手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司；Pegasus 4D气相色谱-飞行时间质谱联用仪：美国LECO公司。
1.3 方法
1.3.1 理化指标检测
pH测定：采用pH计；总酸测定：采用甲醛滴定法[22]；氯化钠、可溶性无盐固形物、全氮、氨基酸态氮测定：采用国标GB/T 18186—2000《酿造酱油》[22]；还原糖测定：采用国标GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》[24]。
1.3.2 酱油挥发性风味物质HS-GC-IMS检测
酱油中挥发性风味物质检测采用HS-GC-IMS法[25]，并稍作修改。
样品前处理：酱油醪样品加入顶空瓶，并在40 ℃下孵育15 min，然后采用50 ℃加热注射器将300 μL顶空气体自动注入进样口（85 ℃，无分裂模式）。
GC-IMS条件：采用MXT-WAX毛细管柱（30m×0.53mm×1.00 μm），载气为高纯氮气（N2）（纯度＞99.999%），载气流量程序为2mL/min，0～2min；10mL/min，2～10min；100mL/min，10～20min；100mL/min，20～50min。被分析物在60℃下洗脱分离，然后在IMS电离室中采用3H电离源（活性为300 Mbq）正离子模式下电离。9.8 cm漂移管在45 ℃恒压（5 kV）下运行，氮气流量为150 mL/min。每个频谱报告为12次扫描的平均值。注射器在每次分析前自动用氮气流冲洗30 s，每次分析后自动冲洗5 min，以避免交叉污染。
定性定量方法：保留指数（retention index，RI）的计算采用自动质谱反褶积鉴定系统进行。通过比对美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）和信息管理系统（Information Management System，IMS）数据库的RI和保留时间（retention time，RT），对目标物进行定性分析；以C4～C9正构酮为标准物，采用外标法根据GC-IMS的峰信号强度定量分析。
1.3.3 酱油挥发性风味物质GC×GC-TOF-MS检测
酱油挥发性风味物质检测采用GC×GC-TOF-MS法[26]，并稍作修改。样品前处理：酱油样品进行HS-SPME[27]，并稍作修改。手动顶空采样系统采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取小柱。5 g酱油样品加30 μL内标混合物（质量浓度为362.17 μg/kg 1-己醇-d13；质量浓度为851.23 μg/kg特戊酸；质量浓度为284.54 μg/kg愈创木酚-d3；质量浓度为102.09 μg/kg辛酸乙酯-d15）加入20 mL顶空瓶中，在40 ℃预平衡10 min，在相同温度下提取30 min。完成萃取的固相微萃取小柱插入GC×GC-TOF-MS进样口，250 ℃热解吸5min，进而通过GC×GC-TOF-MS进行挥发性风味物质分析。
GC×GC-TOF-MS条件：以DB-WAX （30 m×250 μm×0.25 μm）和DB-17 MS（2 m×100 μm×0.10 μm）为第一维和第二维色谱柱。以高纯氦气（He）（99.999%）为载气，流速为1 mL/min。升温程序为初始温度在40 ℃下保持2 min。温度以4 ℃/min升高到160 ℃，再以10 ℃/min升高到250 ℃，并保持9 min。调制器相对于次级烘箱偏移5 ℃，调制时间为4 s。电子电离（electronic ionization，EI）源，离子源温度230 ℃，传输线温度250 ℃，MS的电离能量为70 eV。质谱扫描范围为29～500 amu，采集速率为50张/s。
定性定量方法：GC×GC-TOF-MS数据由LECO公司Chroma TOFR工作站进行数据处理，色谱峰自动积分解卷积后与NIST 14和Wiley 9质谱库比对，选择正反相似度均＞800的化合物，根据正构烷烃（C7～C30）中各烷烃的保留时间，计算挥发性风味成分的保留指数，并与文献报道的保留指数对比定性，采用内标法进行挥发性风味物质半定量分析。
1.3.4 酱油感官评价
从实验室随机选取10位受到系统培训的品评员进行盲评，口感方面分别从咸味、鲜味、苦味、甜味、酸味、厚味、综合口感、偏爱程度8个维度对样品进行评分；香气方面分别从酸味、豆香、麦芽香、焦香、醇香、综合香气、酱香、偏爱程度8个维度对样品进行评分。评分方法为：每个维度满分为10分，感官强度大则得分高；每位品评员对每组样品盲评3次，时间间隔30 min，计算平均分，各维度得分为10位品评员的评分算术平均值。
1.3.5 数据分析
采用MeV 4.9.0软件对GC-IMS和GC×GC-TOF-MS数据进行标准化，采用SIMCA14.1软件包（Umetrics）进行主成分分析（PCA），评价测试样品间的相似性和差异性，采用SPSS 26.0对理化指标进行差异显著性分析，采用Metabo Analysis 2.0软件绘制聚类分析热图，采用Excel 2019分析感官评价数据。
2 结果与分析
2.1 不同地区高盐稀态酱油理化指标差异分析
采用常规理化指标测定方法对不同地区高盐稀态酱油理化指标进行测定，结果见表1。由表1可知，湖南传统高盐稀态酱油（LOP1）pH值（4.50）低于广东高盐稀态酱油HAY和LKJ pH值（4.61、4.89），而样品HAY总酸为2.08 g/100 mL，高于样品LOP1和LKJ总酸（1.89 g/100 mL、1.69 g/100 mL）；样品LOP1和LKJ氨基酸态氮（0.873 g/100 mL、0.854 g/100 mL）略低于样品HAY氨基酸态氮（0.929 g/100 mL）。样品LOP1全氮为1.61 g/100 mL，明显高于样品HAY和LKJ全氮（均为1.56 g/100 mL）；另外，样品LOP1还原糖、氯化钠和可溶性无盐固形物（8.87 g/100 mL、22.87 g/100 mL、21.8%）也明显高于样品HAY和LKJ还原糖、氯化钠和无盐固形物（4.07 g/100 mL、17.03 g/100 mL、17.40%；5.47 g/100 mL、17.90 g/100 mL、17.50%），高含量氯化钠和可溶性无盐固形物提高了LOP1酱油的可溶性固形物含量，有利于酱油美拉德反应进行，进而为传统酱油丰富的风味物质形成提供了基础[30-31]。结果表明，不同区域高盐稀态酱油的总酸、氨基酸态氮、还原糖差异显著（P＜0.05），湖南传统高盐稀态酱油还原糖、NaCl含量和可溶性无盐固形物显著高于广东高盐稀态酱油（P＜0.05）。
表1 不同地区高盐稀态酱油理化指标测定结果
Table 1 Determination results of physicochemical indexes of high-salt dilute-state soy sauce from different regions
注：不同小写字母表示同列数据差异显著（P＜0.05）。
样品编号 pH值 总酸/（g·100 mL-1）氨基酸态氮/（g·100 mL-1）全氮/（g·100 mL-1）还原糖/（g·100 mL-1）氯化钠/（g·100 mL-1）可溶性无盐固形物/%LOP1 HAY LKJ 4.50±0.08a 4.61±0.04a 4.89±0.03b 1.89±0.07c 2.08±0.03a 1.69±0.04b 0.873±0.009c 0.929±0.004a 0.854±0.008b 1.61±0.02a 1.56±0.03a 1.56±0.04a 8.87±0.35c 4.07±0.21a 5.47±0.15b 22.87±0.55b 17.03±0.32a 17.90±0.26a 21.80±0.30b 17.40±0.20a 17.50±0.30a
2.2 不同地区高盐稀态酱油挥发性风味物质GC-IMS分析
2.2.1 挥发性风味物质GC-IMS分析色谱图
不同地区高盐稀态酱油挥发性风味物质GC-IMS检测3-D和2-D色谱图见图1。
图1 不同地区高盐稀态酱油挥发性风味物质GC-IMS分析三维（a）及二维（b）谱图
Fig.1 Three-dimensional (a) and two-dimensional (b) spectra of volatile flavor compounds of high-salt dilute-state soy sauce from different regions analysis by GC-IMS
由图1a可知，样品HAY检出峰分布与样品LKJ较为相似，而与样品LOP1存在较大差异。2-D色谱中纵坐标为气相保留时间轴，横坐标为迁移时间轴，图中每个点代表一种挥发性风味物质。由图1b可知，样品HAY和LKJ挥发性物质组成相似度较高，二者与样品LOP1有明显差异，特别是在保留时间200～400 s时间范围内；乙醇和乙酸两种物质峰因含量较高出现拖尾呈带状，样品HAY和LKJ中乙醇含量较高，样品LOP1中乙酸含量较高；说明在广式酱油有比较充分的酒精代谢，这可能与其采用大罐发酵，底层醪相对厌氧有关；传统酱油醋酸含量高可能与长周期发酵过程乙醇和乙醛的氧化或美拉德反应产酸有关。
2.2.2 挥发性风味物质GC-IMS分析指纹图谱
为全面直观分析3种酱油挥发性物质组成的异同点，采用GC-IMS数据处理软件对3种样品谱图中挥发性物质峰进行处理，形成指纹图谱，结果见图2。由图2可知，乙酸（acetic acid）、γ-丁内酯（gamma-butyrolactone）、丙酸乙酯（ethyl propanoate）、异丁酸乙酯（ethyl isobutyrate）、4-乙基愈创木酚（4-ethylguaiacol）、3-甲硫基丙醛（methional）、甲基乙基硫醚（methyl ethyl sulfide）、正戊醛（pentanal）等红框中的物质在样品HAY、LKJ中含量较低，在样品LOP1中含量较高。3-羟基-2-丁酮（3-hydroxy-2-butanone）、乙醇（ethanol）、异丁醇（2-methyl-1-propanol）、异戊醇（isopentyl alcohol）等绿框中物质在样品HAY、LKJ中含量较高，在样品LOP1含量相对较低。叶醇（（Z）-3-hexenol）、糠醇（2-furanmethanol）等物质为样品HAY中特有的挥发性风味物质，正辛醛、正戊醛、异丁醛等物质为样品LOP1中特有的挥发性风味物质，样品LKJ中庚醛、2,5-二甲基呋喃含量明显高于样品HAY和LOP1。结果表明，广东地区高盐稀态酱油样品HAY、LKJ中醇类物质含量较为丰富，而湖南传统高盐稀态酱油样品LOP1中酯类和含硫化合物含量较高。醇类物质主要由酵母类微生物代谢产生[32]，含硫化合物与美拉德反应有关[33]，推测两种酱油风味化合物的产生途径存在差异。
图2 不同地区高盐稀态酱油挥发性风味物质GC-IMS指纹图谱
Fig.2 GC-IMS fingerprints of volatile flavor compounds of high-salt dilute-state soy sauce from different regions
2.2.3 挥发性风味物质层次聚类分析
为了比较不同酱油中GC-IMS检出的挥发性风味物质差异，对结果进行层次聚类分析（HCA），结果见图3。由图3可知，HAY与LKJ两组样品聚为一支，说明样品LOP1中的挥发性风味物质与样品HAY与LKJ存在显著差异，推测不同区域、不同酿造工艺对酱油风味物质的形成有重要影响。湖南传统高盐稀态酱油样品LOP1中糠醛、2-甲基吡嗪、正戊醛、异丁酸乙酯、4-乙基愈创木酚、反式-3-己烯-1-醇、正戊酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲硫基丙醇、乙酸、乙酸丙酯等物质的含量显著高于广东高盐稀态酱油样品HAY与LKJ。同时，广东高盐稀态酱油样品HAY与LKJ中含有较高含量的乳酸乙酯、乙醇、2-戊酮、3-羟基-2丁酮等化合物。
图3 不同地区高盐稀态酱油挥发性风味物质聚类分析热图
Fig.3 Heat map of clustering analysis of volatile flavor compounds of high-salt dilute-state soy sauce from different regions
2.3 不同地区高盐稀态酱油挥发性风味物质GC×GCTOF-MS分析
2.3.1 挥发性风味物质GC×GC-TOF-MS分析总离子流色谱图
IMS作为GC检测器在精确定量分析方面存在局限性，因为IMS响应是非线性的，这意味着其检测十亿分之一（parts per billion，ppb）和万亿分之一（parts per trillion，ppt）水平浓度的物质可能是一个挑战[34]；为了对低含量（ppb或ppt）挥发性化合物进行高分辨定量分析，本研究采用GC×GC-TOF-MS结合SPME对3种不同地区高盐稀态酱油进行了挥发性风味成分检测，其总离子流色谱图见图4。
图4 酱油样品LOP1（a，b），HAY（c，d）和LKJ（e，f）挥发性风味物质GC×GC-TOF-MS分析二维及三维总离子流色谱图
Fig.4 Two-dimensional and three-dimensional total ions chromatogram of volatile flavor compounds of soy sauce samples LOP1 (a, b), HAY (c, d) and LKJ (e, f) analysis by GC×GC-TOF-MS
由图4可知，样品LOP1检出峰与样品HAY、LKJ差异明显，0～16.67 min，样品LOP1检出峰分离度优于样品HAY和LKJ，样品HAY和LKJ均出现多峰聚合的现象，这可能与样品HAY和LKJ高含量乙醇检出有关；16.16～33.33 min，样品LOP1检出峰明显多于样品HAY和LKJ，说明样品LOP1在保留时间16.16～33.33 min的挥发性风味成分的丰度高于样品HAY和LKJ。
2.3.2 各类别挥发性风味物质数量及占比
不同地区高盐稀态酱油挥发性风味物质GC×GCTOF-MS分析结果见表2。由表2可知，样品LOP1中共检出280种挥发性风味物质，其中醇类48种，含量33.651 mg/L，占比38.04%，主要有乙醇、环丁醇、2,3-丁二醇、2-甲基丁醇、2-乙烯氧基乙醇等；醛类32种，含量22.372 mg/L，占比25.29%，主要有2-甲基丁醛、异丁醛、乙醛、苯乙醛、糠醛等；酯类38种，含量4.043 mg/L，占比4.57%，乙酸乙酯含量最高（2.075 mg/L），其次为丁二酸单甲酯（0.752 mg/L）；酸类17种，含量11.367 mg/L，占比12.85%。
表2 不同地区高盐稀态酱油样品中各类别挥发性风味物质数量、含量及占比
Table 2 Quantity, contents and proportion of various categories volatile flavor compounds in high-salt dilute-state soy sauce samples from different regions
类别数量/种样品LOP1含量/（mg·L-1）数量/种样品HAY含量/（mg·L-1）数量/种样品LKJ含量/（mg·L-1）占比/%醛类酮类醇类酸类酯类17 38呋喃类吡嗪类烷烃类烯烃类酚类其他类32 44 48 19 5 16占比/% 占比/%25.29 9.74 38.04 12.85 4.57 1.28 0.13 0.19 0.04 0.19 7.68 22.372 8.616 33.651 11.367 4.043 1.132 0.115 0.168 0.035 0.168 6.794 25 42 32 19 51 15 9 10 30 33 49 16 36 10 6 11 5 7 4 9 3 4 4 6 16.996 6.260 17.530 3.467 4.482 0.317 0.528 0.258 0.035 0.065 8.730 28.97 10.67 29.88 5.91 7.64 0.54 0.90 0.44 0.06 0.11 14.88 6 6 4 2 16.456 4.549 28.886 2.570 4.360 0.321 0.0819 0.233 0.221 0.510 4.813 26.12 7.22 45.85 4.08 6.92 0.51 0.13 0.37 0.35 0.81 7.64
样品HAY中共检出256种挥发性风味物质，其中醇类32种，含量17.530 mg/L，占比29.88%，乙醇含量最高（12.944 mg/L），其次为苯乙醇和异丁醇（1.336 mg/L和1.194 mg/L）；醛类25种，含量16.996 mg/L，占比28.97%，2-甲基丁醛含量最高（5.555 mg/L），其次为乙醛和异戊醛（3.337 mg/L，3.070 mg/L）；酯类51种，含量4.482 mg/L，占比7.64%，其中乙酸乙酯含量最高（1.910 mg/L），其次为乳酸乙酯（1.188 mg/L）。
样品LKJ中共检出245种挥发性风味物质，其中醇类49种，含量28.886 mg/L，占比45.85%，乙醇含量最高（15.527 mg/L），其次为异戊醇和异丁醇（2.812 mg/L和2.163 mg/L）；醛类30种，含量16.456 mg/L，占比26.12%；乙醛含量最高（5.579 mg/L），其次为2-甲基丁醛、羟乙醛（5.251 mg/L和1.570 mg/L）；酯类36种，含量4.360 mg/L，占比6.92%，乙酸乙酯含量最高（2.624 mg/L），其次是乳酸乙酯、乙二醇单甲酸酯（0.727 mg/L和0.334 mg/L）、甲基硫环己酯（0.252 mg/L）。
对比广东高盐稀态酱油，湖南传统高盐稀态酱油挥发性风味成分中酯类相对含量较少，醛类、酮类、醇类、酸类、呋喃类明显较多。酯类化合物偏少的原因可能是：湖南传统高盐稀态酱油长周期发酵过程中酯类被微生物水解消耗，进一步生成醛、酸类物质[35]；醛、酮、酸类化合物的产生途径主要有微生物合成、美拉德反应及大分子氧化等途径[36-38]，湖南传统高盐稀态酱油以500 L陶缸为容器，采用长周期（8个月以上）日晒夜露发酵工艺，表层发酵醪曝晒产生高温及长时间氧气接触为大豆油脂等大分子氧化及氨基酸、还原糖美拉德反应创造了条件，下层发酵醪相对低温和长时间发酵为微生物代谢积累醛、酮、酸类化合物提供了有利条件。而广东高盐稀态酱油采用80 m3以上玻璃纤维缸进行发酵，发酵周期一般为2～3个月，发酵醪接受阳光曝晒的比例小，发酵周期短，醛、酮、酸类化合物合成较少。醇类化合物主要来自于酵母等微生物代谢合成[39]，湖南传统高盐稀态酱油相对较高的还原糖含量及长周期发酵有利于酵母等微生物合成醇类化合物。呋喃类化合物形成的主要途径有美拉德反应，糖类热裂解以及微生物代谢合成[40-43]，如上醛、酮、酸类分析，湖南传统高盐稀态酱油样品LOP1的发酵工艺和发酵周期有利于呋喃类化合物美拉德反应和微生物代谢合成；表层发酵醪在日晒状态下产生的高温也有利于糖类热裂解产生呋喃类化合物。
2.3.3 挥发性风味物质层次聚类分析
为了进一步展示LOP1、LKJ和HAY三组样品的挥发性风味物质差异，选取三组样品中的醇类、酯类、吡嗪类、呋喃类成分进行层次聚类分析（HCA），结果见图5。由图5可知，3组样品分为两支，其中样品LKJ和HAY聚为一支，说明这两组样本的挥发性风味物质的相似度较高，与样品LOP1挥发性风味物质差异较大。样品LOP1中检出了较多种类的呋喃类化合物，如3-苯基呋喃、2,3-苯并呋喃、2-正戊基呋喃、2-甲基呋喃、5-甲基呋喃醛等，LKJ和HAY样品检出量相对极少。同时，样品LOP1中部分酯类化合物的含量明显高于样品LKJ和HAY，如乙酸糠酯、异戊酸乙酯、3-丁烯酸甲酯、草酸烯丙酯、羟基乙酸丙酯、丁二酸单甲酯、乙酸甲酯等。然而，丙酸乙酯、乙醇酸乙酯、α-甲基-γ-丁内酯、异丁酸乙酯、2-羟基-3-甲基丁酸乙酯等酯类化合物在广东高盐稀态酱油样品LKJ和HAY检出量高于样品LOP1。另外，LKJ和HAY样品中检出的3-乙基-2,5-二甲基吡嗪显著高于样品LOP1。湖南传统高盐稀态酱油与广东高盐稀态酱油在呋喃类、酯类等化合物含量上差异显著，上述差异化合物为不同产地酱油鉴定提供了分子标记选择。
图5 不同地区高盐稀态酱油样品中醇类、酯类、吡嗪类和呋喃类层次聚类分析热图
Fig.5 Heat map of hierarchical clustering analysis of alcohols,esters, pyrazines and furans in high-salt dilute-state soy sauce samples from different regions
2.4 不同地区高盐稀态酱油挥发性风味物质主成分分析
为了更深入地分析不同地区高盐稀态酱油挥发性风味物质的GC-IMS和GC×GC-TOF-MS检测结果，根据化合物的信号强度进行主成分分析（PCA），结果见图6。由图6a可知，主成分1（PC1）方差贡献率为66.6%，主成分2（PC2）方差贡献率为24.7%，累计方差贡献率为91.3%，可以对原始数据进行有效解释。样品LOP1位于纵轴左侧，样品HAY与LKJ位于右侧，说明在第一主成分上湖南传统高盐稀态酱油与广东高盐稀态酱油挥发性风味物质差异较大。样品HAY与LKJ在第二主成分上分列在横轴两侧，说明两组样品在第二主成分上有一定差异。
图6 不同地区高盐稀态酱油样品挥发性风味物质GC-IMS（a）、GC×GC-TOF-MS（b）检测主成分分析
Fig.6 Principal component analysis of volatile flavor compounds in high-salt dilute-state soy sauce samples from different regions detected by GC-IMS(a)and GC×GC-TOF-MS(b)
由图6b可知，PC1方差贡献率为54.2%，PC2方差贡献率为35.1%，累积方差贡献率为89.3%。PC1对样品HAY和LKJ呈负向影响，而样品LOP1位于正轴上。PC2对样品LKJ呈负向影响，而对样品HAY呈正向影响，说两组样品在第2主成分上存在一定差异。
结果表明，湖南传统高盐稀态酱油挥发性风味物质与广东高盐稀态酱油差异明显，广东不同厂家生产的高盐稀态酱油挥发性风味物质存在一定差异。通过PCA能够有效区分不同产地、同一产地不同生产厂家高盐稀态酱油。
2.5 不同地区高盐稀态酱油感官评价
为了比较不同地区高盐稀态酱油的差异，对样品LOP1、HAY和LKJ三种酱油进行感官评价，感官评价雷达图见图7。由图7可知，香气方面，样品LOP1酸香强度明显高于样品HAY和LKJ，这与其总酸较高，以及VOCs检测出大量有机酸有相关性；样品LOP1麦芽香、焦香、酱香强度均高于样品HAY和LKJ，分析可能与样品LOP1中检出较多的呋喃、吡嗪和酚类化合物有关；而样品HAY和LKJ的醇香强度明显高于样品LOP1，这与广东高盐稀态酱油中乙醇等呈香醇类物质含量较高，以及醛、酸、呋喃类化合物含量较少，对醇香遮蔽效应较弱有关；样品LKJ豆香有明显优势。滋味方面，样品LOP1咸味、甜味、酸味、厚味强度均高于样品HAY和LKJ，这分别与样品LOP1氯化钠、还原糖和总酸含量较高有关（见表1）。另外，样品LOP1苦味也明显高于样品HAY和LKJ，推测其与湖南传统高盐稀态酱油美拉德反应程度较深，产生了少量苦味副产物有关；样品HAY酸味强度明显高于样品LKJ，主要因为其含有较高的总酸；其他滋味强度与样品HAY接近。结果显示，样品LOP1、HAY和LKJ综合香气评分分别为7.80、7.45、7.30，综合滋味评分分别为8.25、7.10、7.25，表明湖南传统高盐稀态酱油与广东高盐稀态酱油感官结果有明显差异，而不同生产厂家的广东高盐稀态酱油风味特征相近。
图7 不同地区高盐稀态酱油样品感官评价雷达图
Fig.7 Radar charts of sensory evaluation of high-salt dilute-state soy sauce samples from different regions
3 结论
本研究以湖南传统高盐稀态酱油（编号为LOP1）和广东高盐稀态酱油（编号为HAY、LKJ）为研究对象，采用理化指标分析、GC-IMS、GC×GC-TOF-MS与感官评价相结合的方法，对不同地区高盐稀态酱油的理化指标、挥发性风味物质和感官特性进行分析。结果表明，样品LOP1总酸、全氮、还原糖、可溶性无盐固形物均高于样品HAY和LKJ，氨基酸态氮略低于HAY和LKJ。GC-IMS分析表明，样品HAY和LKJ风味成分差异较小，醇类物质含量较为丰富，而传统酿造酱油检出较高含量的酯类和含硫化合物。GC×GCTOF-MS从样品LOP1、LKJ、HAY中分别检出280种、245种、256种挥发性风味物质；相较于样品LKJ、HAY，样品LOP1酸类、呋喃类化合物明显较多。通过层次聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）能够有效区分不同产地、同一产地不同生产厂家酱油。感官评价结果显示，样品LOP1、HAY和LKJ综合香气评分分别为7.80分、7.45分、7.30分，综合滋味评分分别为8.25分、7.10分、7.25分，样品LOP1的酸香、麦芽香、焦香、酱香强度以及咸味、甜味、酸味、苦味、厚味强度均高于样品HAY和LKJ，样品HAY和LKJ表现出较强的醇香。不同酿造工艺生产酱油的挥发性风味物质及感官品质有显著差异。
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