红树莓（Rubus idaeus L.），是蔷薇科（Rosaccse）悬钩子属（Rubus）中的一种多年生灌木小浆果[1]，其果实含有丰富的维生素、矿物质、有机酸、多糖、磷脂、类胡萝卜素、萜类、黄酮类和酚类等物质，具有提高免疫力、预防心血管疾病、抑制癌细胞生长等功效[2-3]。成熟红树莓果实可鲜食，但由于其独特的外形结构，不耐储藏和运输，因此大多用于加工成果汁、果酱、果酒等产品[1]。
果酒是以除葡萄以外的新鲜水果或果汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的发酵酒[4]。将红树莓应用于果酒酿造，既可保留其本身的营养成分，又能在发酵过程中产生多种有益的代谢产物，从而提高红树莓的经济价值，增加酒类品种[5-8]。在红树莓果酒酿造过程中，酵母菌的选择和利用是影响红树莓果酒风味和品质的关键因素[9]。目前有关红树莓果酒的发酵多采用葡萄酒商用酵母[10-13]，使得红树莓果酒的特有风味和营养特征并不突出。近年来，筛选出的红树莓果酒酿造专用酵母能相对较好地呈现红树莓的风味[14-20]，武伟伟[21]通过传统分离培养方式从红树莓果酒自然发酵过程中分离到了3种酵母菌，分别为陆生伊萨酵母（Issatchenkiaterricola）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其中，陆生伊萨酵母和酿酒酵母（5∶5）混合发酵所得红树莓果酒品质，在有机酸降解率、香气物质含量、色度色调和感官评价等方面效果最好。卢思言[22]从野生浆果红树莓中分离得到一株降酸酵母菌株A3，能有效地缓解野生浆果自身酸涩的口感。但鲜见系统性研究红树莓果酒酵母筛选及发酵特性的报道。
本研究从野生红树莓果实、果园土壤及其自然发酵液中筛选酿酒酵母，通过TTC显色法初筛菌株，结合耐受性实验和发酵性能试验复筛得到优良产酒酵母，经过形态学观察和分子生物学鉴定，将筛选所得菌株与市售酵母菌进行红树莓果酒模拟发酵实验，并对其理化指标、感官品质及挥发性风味物质进行分析。以期为红树莓果酒酿造提供菌株资源，为红树莓果酒产品开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
野生红树莓（品种为栽秧泡）：采自贵州省仁怀市郊区；土壤：采自贵州省仁怀市郊区的野生红树莓果树区；葡萄酒与果酒专用酵母SY：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 试剂
酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、蔗糖：成都金山化学试剂有限公司；乙醇：国药集团化学试剂有限公司；碳酸钙：天津市光复精细化工研究所；硫酸镁：天津市永大化学试剂有限公司；氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾：天津市科密欧化学试剂有限公司；偏重亚硫酸钾、柠檬酸、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）：上海联硕宝为生物科技有限公司；果胶酶（酶活2 000 U/g）：帝伯仕酵母有限公司。所用试剂均为生化试剂或分析纯。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L[23]。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。YPD固体培养基：在YPD液体培养基基础上添加琼脂粉20.0 g/L。
TTC下层培养基：葡萄糖50.5 g/L，蛋白胨10.0 g/L，酵母粉7.5 g/L，酸性磷酸钾5.0 g/L，硫酸镁2.0 g/L，柠檬酸1.35 g/L，调整pH在4.0以上，琼脂粉30.0 g/L[23]。
TTC上层培养基：葡萄糖0.5 g/L，琼脂粉15.0 g/L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后冷却，再加入TTC 0.5 g/L[23]。
豆芽汁液体培养基：按照黄豆芽与水的质量比为1∶10加水，煮沸后小火熬煮30 min，用纱布过滤掉豆芽渣，补足蒸发的水分（豆芽汁10%）[24]。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SHP-250型生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司；DM3000型双目光源生物显微镜：德国莱卡微系统有限公司；FA2204N型电子天平：上海菁海仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；HZQ-C型恒温摇床：常州上特仪器制造有限公司；AOC-6000型三位一体进样器、GCMS-TQ8040型三重四级杆气质联用仪：日本SHIMADZU公司。
1.3 方法
1.3.1 野生红树莓果实、果园土壤及其自然发酵液中酵母菌菌株的富集、分离及初筛
野生红树莓果实、果园土壤的预处理：将100 g新鲜野生红树莓果实、100 g果园土壤分别加入到250 mL YPD液体培养基中，28 ℃、150 r/min富集培养24 h。
红树莓果酒自然发酵液的制备：将100 g野生红树莓果实在超净工作台的无菌条件下进行手工破碎，放入250 mL已灭菌的锥形瓶中，盖好发酵栓水封，在28 ℃恒温培养箱中发酵10 d，取不同发酵时间（0、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d）的发酵液。
将上述富集培养液或发酵液，按10倍梯度依次稀释至10-7，分别取200 μL涂布于TTC下层培养基上，于28 ℃倒置培养2～3 d后，向其中倒入TTC上层培养基，在28 ℃条件下避光培养2～4 h后，按照酵母菌的显色情况判断其产酒精能力，产酒精能力强的酵母菌呈深红色，次之为粉红色[25]。挑选深红色的菌落进行划线分离，接种至菌种保藏斜面，28 ℃培养48 h，之后保藏于4 ℃冰箱。
1.3.2 优良酵母菌菌株的复筛
耐受性实验：将筛选菌株的种子液（105个/mL）以5%（V/V）接种量分别接种于不同乙醇体积分数（8%、10%、12%、14%、16%）、不同SO2质量浓度（50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L）的豆芽汁液体培养基试管中（内置杜氏小管），28 ℃恒温培养48 h，观察杜氏小管内气体的变化，从中筛选出耐乙醇、SO2能力较强的酵母菌株[26]。
发酵性能实验：将复筛菌株和葡萄酒与果酒专用酵母SY种子液（105个/mL）分别按5%（V/V）的接种量接种至红树莓果汁中，加入果胶酶40 mg/L（50 ℃酶解4 h），偏重亚硫酸钾100 mg/L，调节初始糖浓度为22%，pH值为4.0，在28 ℃下恒温培养7 d，每隔24 h测定CO2质量损失。
1.3.3 优良酵母菌菌株的鉴定
形态学观察；挑取经活化的复筛菌株，在YPD固体培养基上进行连续划线分离，于28 ℃恒温培养24～48 h后，观察菌落的大小、颜色、表面形态等特征。并挑取单菌落，制作水浸片，于双目显微镜下观察酵母菌的细胞形态和出芽情况。
分子生物学鉴定：将复筛菌株分别使用十六烷基三甲基 溴 化 铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[27]提取细胞总DNA。以提取的基因组DNA为模板，使用引物对ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）扩增ITS序列[28-29]。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增体系（50 μL）：2×PCR master 25 μL，ITS1 2 μL，ITS4 2 μL，模板DNA 1 μL，双蒸水（ddH2O）22 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环后，72 ℃终延伸10 min。扩增的ITS序列产物送至北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司测序，测序结果上传至美国国立生物技术信息中心（National Center for BiotechonologyInformation，NCBI）的GenBank数据库中进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对，选取同源性较高的序列，利用MEGA 6.0软件中的邻接（neighbor joining，NJ）法构建系统发育树。
1.3.4 红树莓果酒品质分析
挑选无损坏、无虫害的红树莓果实进行破碎，添加100 mg/L偏重亚硫酸钾，40 mg/L果胶酶（50 ℃酶解4 h），调节初始糖浓度为22%，pH值为4.0，75 ℃灭菌15 min，再冷却至室温，得到待发酵的红树莓果汁。在无菌操作环境中分别接种复筛菌株和葡萄酒与果酒专用酵母SY种子液（105个/mL）按5%的接种量（V/V）接种于上述红树莓果汁中，在28 ℃条件下主发酵7 d。主发酵结束后用多层纱布过滤，在28 ℃条件下进行10 d后发酵，再密封于17 ℃下陈酿2个月[16]。陈酿结束后测定酒精度、总糖、总酸含量，并进行感官评价和挥发性风味物质的测定。
1.3.5 理化指标测定
酒精度、总糖含量和总酸含量的测定：参照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[30]。
1.3.6 感官评价
选取10名专业的感官品评人员组成感官评价小组，参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的葡萄酒评分细则[31-33]，从外观、香味、滋味和典型性4个方面对红树莓果酒样品进行感官评价，感官评价标准见表1。
表1 红树莓果酒感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of red raspberry fruit wine
项目 评价标准 感官评分/分外观香味滋味典型性酒红色，清亮，有光泽酒红色，稍有浑浊，光泽不明显浅红色，浑浊，暗淡无光泽黄色，浑浊，暗淡无光泽浓郁的酒香、清新的红树莓果香酒香良好、红树莓果香良好，无异味酒香、果香不足，有异味无酒香，异味浓重酒体丰满，醇厚协调，爽口酒体淡薄，酸甜适中，柔和无酒味，较甜，略酸无酒味，酸涩，口感粗糙风格独特优雅、风味典型风格良好、风味典型风格一般、风味欠缺无典型风味18～20 15～17 11～14 0～10 26～30 21～25 16～20 0～15 35～40 28～34 21～27 0～20 8～10 5～7 2～4 0～1
1.3.7 挥发性风味物质测定
采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术测定红树莓果酒的挥发性风味物质。
HS-SPME条件：取3 mL红树莓果酒样品置于10 mL顶空瓶中，加入0.1 g/mLNaCl溶液，并以聚四氟乙烯隔垫密封，三位一体进样器进样，40 ℃条件下以400 r/min萃取40 min后进入GC-MS系统，解吸5.0 min。
GC条件：DB-FFAP色谱柱（60.0 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序为初始温度45 ℃保持2 min，以4 ℃/min升高至180 ℃，保持10 min；以10 ℃/min升高至230 ℃，保持5 min；传输线温度230 ℃；载气为高纯氦气（He）（99.999%）；载气流速1.9 mL/min。
MS条件：进样口温度250 ℃；采用电子电离（electronic ionization，EI）源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围30～350 u。
定性定量分析：对采集到的挥发性风味物质质谱图与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）17.L标准质谱谱图进行对比，选取匹配度≥80%的组分并结合保留指数进行定性，峰面积归一化法定量计算出各挥发性风味物质相对含量。
2 结果与分析
2.1 优良产酒酵母菌菌株的分离、纯化及初筛
对野生红树莓果实、果园土壤及其自然发酵液中的菌种进行分离纯化，共分离得到162株菌株，共有24株在TTC培养基呈深红色或粉红色，将其编号为YSM-1～YSM-24，24株酵母菌菌株产酒精能力测定结果见图1。并将这24株产酒精菌株进行复筛。
图1 24株酵母菌菌株产酒精能力测定结果
Fig.1 Determination results of alcohol production capacity of 24 yeast strains
2.2 产酒酵母菌菌株的复筛
2.2.1 乙醇耐受性实验结果
筛选菌株乙醇耐受实验结果见表2。由表2可知，在乙醇体积分数8%条件下，菌株YSM-2、YSM-3、YSM-4、YSM-7等11株菌株在发酵24 h和48 h内仅产生1/6气体，产气能力较差；菌株YSM-5、YSM-6、YSM-12、YSM-17等10株菌株在发酵24 h和48 h内仅分别产生1/6、2/6气体，产气能力较差。而菌株YSM-1、YSM-8和YSM-10在发酵24 h内分别产生2/6、3/6、5/6气体，产气能力较强。在乙醇体积分数14%条件下，菌株YSM-1、YSM-8和YSM-10在48 h内仍能分别产生1/6、1/6、2/6气体，说明这3株菌株对乙醇有相对较强的耐受性。因此，将菌株YSM-1、YSM-8和YSM-10进行进一步实验。
表2 筛选菌株乙醇耐受实验结果
Table 2 Ethanol tolerance test results of screened strains
注：“+”表示气体量占杜氏小管的1/6，“+++”表示气体量占杜氏小管的3/6，“+++++”表示气体量占杜氏小管的5/6，“++++++”表示气体充满整个杜氏小管；“–”表示不产气。下同。
菌株 时间/h乙醇体积分数/%8 10 12 14 16 YSM-2、YSM-3、YSM-4、YSM-7、YSM-9、YSM-11、YSM-13 YSM-5、YSM-6、YSM-12、YSM-17、YSM-18、YSM-19、YSM-21、YSM-22、YSM-23、YSM-24–++–++YSM-1++++–––––+–+––––––––+YSM-8+–+YSM-10 12 24 48 12 24 48 12 24 48 12 24 48 12 24 48+++++++++++++++++++++++++++++++–++++++++++++++++++++++++++++––––––––+––+–+++––––––––––––––+
2.2.2 SO2耐受性分析
果酒酿造过程中添加SO2能起到抑制发酵环境中杂菌的生长繁殖的作用[17]。3株筛选菌株SO2耐受实验结果见表3。由表3可知，在SO2质量浓度为100 mg/L的条件下，3株菌在12 h内均能起酵。在SO2质量浓度为150 mg/L条件下，菌株YSM-8在48 h内产生2/6气体，在SO2质量浓度为200 mg/L条件下，菌株YSM-8不起酵，菌株YSM-1在48 h内产生3/6气体，但菌株YSM-10在发酵48 h内产气量能够充满整个杜氏小管。因此，3株菌株对SO2的耐受能力大小为：YSM-10＞YSM-1＞YSM-8。
表3 筛选菌株SO2耐受实验结果
Table 3 SO2 tolerance test results of screened strains
菌株 时间/h SO2质量浓度/（mg·L-1）50 100 150 200 250+YSM-1++++++++––+++YSM-8––+YSM-10 12 24 48 12 24 48 12 24 48++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++––––++++++++++++++––––––––++
2.2.2 发酵力分析
3株筛选菌株和葡萄酒与果酒专用酵母SY在红树莓果汁的发酵过程中CO2质量损失见图2。由图2可知，3株筛选菌株在接种后均能够快速起酵，其中，菌株YSM-8发酵速度最快，在第2天就到达发酵高峰，此时，CO2质量损失为4.99 g，在第4天完成主发酵（泡盖消散），发酵急促；与菌株YSM-8相比，菌株YSM-10、YSM-1和酵母SY发酵速度较缓，均在第4天才达到发酵高峰，此时，CO2质量损失分别为5.86 g、3.88 g、5.63 g，在第6天完成主发酵（泡盖消散），但不同菌株均在8 d时发酵结束（CO2质量损失为0）。3株菌均满足红树莓果酒发酵。
图2 筛选菌株和酵母SY在红树莓果汁发酵过程中CO2质量损失
Fig.2 CO2 mass loss during red raspberry juice fermentation by screened strains and yeast SY
2.3 优良产酒酵母菌菌株的鉴定
2.3.1 形态学观察
菌株YSM-1、YSM-8、YSM-10的菌落及细胞形态见图3。由图3可知，菌株YSM-1、YSM-8、YSM-10菌落大而厚，乳白色，为圆形、菌落表面光滑、粘稠、中央和边缘颜色均一，细胞形状为圆形，为典型的圆形酵母属，出芽生殖[14]。因此，菌株YSM-1、YSM-8、YSM-10为典型的圆形酵母属。
图3 菌株YSM-1、YSM-8、YSM-10的菌落（a）及细胞（b）形态
Fig.3 Colony (a) and cell (b) morphology of strains YSM-1, YSM-8 and YSM-10
2.3.2 分子生物学鉴定
基于ITS基因序列构建的3株酵母菌株的系统发育树见图4。由图4可知，3株菌株YSM-1、YSM-8和YSM-10与Saccharomyces cerevisiae CSY13聚于一分支，亲缘关系最近。结合形态学特征，将菌株YSM-1、YSM-8、YSM-1鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
图4 基于ITS基因序列构建的菌株YSM-1、YSM-8、YSM-10的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of the strains YSM-1, YSM-8 and YSM-10 based on ITS gene sequences
2.4 优良产酒酵母菌株在红树莓果酒中的应用
2.4.1 理化指标及感官品评分析
菌株YSM-1、YSM-8、YSM-10和葡萄酒与果酒专用酵母SY酿造红树莓果酒的常规理化指标检测结果及感官评分见表4。由表4可知，与酵母SY相比，菌株YSM-1、YSM-8酿造的红树莓果酒酒精度及感官评分较低，而总糖及总酸含量较高。分析其原因可能是，菌株YSM-1、YSM-8发酵能力不够。与酵母SY相比，菌株YSM-10酿造的红树莓果酒酒精度（14.7%vol）增加11.4%，总糖含量（9.24 g/L）无明显差异，而总酸含量（13.22 g/L）降低5.2%，口感更协调，因此，感官评分更高（92.8分）。菌株YSM-10具有较强的产酒能力，且酿造红树莓果酒的酒精度、总糖、总酸等指标符合行业标准NY/T1508—2017《绿色食品 果酒》[4]中半干型果酒理化指标的要求。
表4 红树莓果酒理化指标及感官评分
Table 4 Physicochemical indexes and sensory evaluation of red raspberry fruit wine
菌株 酒精度/%vol总糖含量/（g·L-1）总酸含量/（g·L-1）感官评分/分YSM-1 YSM-8 YSM-10 SY 10.8 11.7 14.7 13.2 10.57 10.27 9.24 9.52 14.89 14.50 13.22 13.94 82.2 88.7 92.8 90.6
2.4.2 挥发性风味物质分析
红树莓果汁及4种不同酵母酿造红树莓果酒挥发性风味化合物含量检测结果见表5。由表5可知，不同红树莓果酒样品中共检出115种挥发性风味成分，包括醇类31种、酯类31种、酮类23种、酸类8种、烷烯烃类7种、醛类4种、萜烯类3种、其他类8种。其中，红树莓果汁及酵母SY、YSM-1、YSM-8、YSM-10酿造果酒中分别检出38种、66种、65种、55种、59种挥发性风味物质。
表5 红树莓果汁及不同酵母酿造红树莓果酒挥发性风味化合物含量检测结果
Table 5 Detection results of volatile flavor compounds in red raspberry juice and fruit wines brewed with different yeast strains
种类 序号 保留时间/min保留指数 化合物相对含量/%果汁 SY YSM-1 YSM-8 YSM-10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0.76 0.25 10.605 12.242 13.684 15.830 15.853 15.897 17.256 19.559 19.700 20.028 20.940 22.195 24.398 24.613 25.761 25.796 26.728 27.626 28.087 28.516 28.954 30.925 31.503 32.990 33.230 34.614 34.772 34.781 38.837 39.173 40.092 1 046 1 104 1 147 1 211 1 212 1 213 1 251 1 315 1 319 1 328 1 354 1 388 1 451 1 457 1 490 1 491 1 519 1 545 1 559 1 572 1 585 1 646 1 664 1 711 1 719 1 764 1 770 1 770 1 899 1 908 1 933正丙醇异丁醇正丁醇2-甲基-丁醇异戊醇正辛醇戊醇4-甲基-1-戊醇5-甲基-2-己醇3-甲基-1-戊醇正己醇叶醇1-辛烯-3-醇庚醇2-丙基-1-戊醇2-乙基己醇2-壬醇2,3-丁二醇正辛醇1-庚烯-4-醇4-甲基-2-己醇薄荷醇壬醇龙脑2-癸醇癸醇3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇异香芹薄荷醇苯甲醇α-紫罗兰醇苯乙醇合计乙酸乙酯丁酸乙酯乙酸异戊酯己酸乙酯1-甲基乙酸己酯庚酸乙酯2-乙基己基乙酸酯辛酸乙酯3-羟基丁酸乙酯壬酸乙酯癸酸甲酯二十七烷酸甲酯3.32 0.07 0.13 1.19 0.14 18.78 22.63 2.84 0.02 0.95 27.52 20.88 0.75 0.24 0.08 0.02 50.46 3.30 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 0.23 0.32 0.24 0.04 0.03 1.40 0.15 0.04 3.40 0.05 0.10 0.04 0.05 0.03 1.55 0.11 0.05 0.030.01 0.10 0.12醇类2.3 0.53 0.03 0.02 0.17 0.02 0.01 0.36 0.04 0.25 0.29 0.04 0.06 0.21 0.14 0.03 0.05 0.20 4.09 0.62 0.31 0.61 0.52 0.30 0.02 0.10 0.24 0.09 0.13 0.02 0.10 0.31 0.43 59.89 0.75 3.12 26.69 1.13 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 7.220 10.363 12.860 16.715 17.764 20.417 22.214 24.061 27.026 27.493 29.481 29.521 922 1 037 1 123 1 236 1 265 1 339 1 389 1 442 1 528 1 541 1 601 1 602 0.37 0.40 0.73 3.91 36.41 24.92 0.66 3.08 39.60 5.71 0.11 0.79 3.30 1.61 6.23 3.36酯类4.82 20.64 0.04 0.05 0.13 6.00 0.02 0.11 0.04 0.18 9.30 0.01 0.02 16.36 0.84 3.56 29.92 1.65 0.33 7.19 3.17 0.07 0.07 0.12 10.49 0.100.05 0.03 0.14 0.02
续表
种类 序号 保留时间/min保留指数 化合物相对含量/%果汁 SY YSM-1 YSM-8 YSM-10 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 30.827 30.927 30.997 31.542 31.580 32.466 32.601 34.205 35.096 36.077 36.157 36.872 36.889 37.204 44.830 44.831 48.955 50.051 51.959 1 643 1 646 1 648 1 665 1 667 1 694 1 698 1 751 1 780 1 812 1 814 1 837 1 837 1 847 2 053 2 053 2 162 2 195 2 259 0.07 0.40 1.49 8-甲基壬酸乙酯苯甲酸甲酯癸酸乙酯5-甲基戊内酯丁酸内酯苯甲酸乙酯环己基异硫氰酸酯乙酸苄酯苯甲酸丙酯苯甲酸异丁酯3-羟基丁酸丁酯乙酸苯乙酯己酸-3,5,5-三甲基-2-乙基酯十二酸乙酯十三酸乙酯肉豆蔻酸乙酯肉桂酸乙酯烯丙基丙二酸二乙酯十六酸乙酯合计乙酸异丁酸3-甲基戊酸己酸异辛酸辛酸壬酸癸酸合计正己醛正辛醛壬醛苯甲醛合计丙酮2-庚酮5-甲基-2-庚酮4-甲基-2-己酮2-辛酮3-羟基-2-丁酮甲基庚烯酮4,7,9-巨豆三烯-3-酮1,4-己二酮樟脑2-十二烷酮2.12 0.07 4.87 3.13 30.91 0.01 12.03 33.88 0.08 0.19 0.08 0.38 8.00 0.10 0.07 0.14 0.08 0.47 0.05 0.09 0.71 0.08 0.29 0.12 0.41 0.8 0.29 0.07 0.37 0.05 0.70 0.05 0.47 0.02 0.03 0.10 0.10 63 64 65 66 67 68 69 70 24.630 28.536 31.861 37.289 40.387 45.401 49.385 52.547 1 458 1 573 1 675 1 850 1 941 2 066 2 175 2 279 1.70 6.2 0.08 0.03 0.07 67.08 0.52 0.06 51.01 1.47 0.10 0.10 0.35 0.10 51.40 0.30 0.10 61.91 1.02 0.00 0.07 0.04酸类0.09 0.090.33 0.02 0.05 0.92 1.23 0.03 0.12 1.68 1.54 0.09 0.31 3.40 0.51 0.02 0.08 2.31醛类71 72 73 74 11.919 18.893 22.717 27.634 1 093 1 297 1 403 1 546 6.38 4.86 0.3 0.98 0.54 6.68 0.05 0.05 0.11 6.650 15.059 15.166 15.190 18.714 19.043 20.681 22.511 26.983 27.233 29.737 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 902 1 189 1 192 1 193 1 292 1 301 1 346 1 397 1 526 1 534 1 609 1.41 0.76 0.14 0.19 0.47 0.19 0.88 0.05 0.01 0.02 0.02酮类0.79 0.20 0.02 0.31 0.29 0.02 0.69 0.01
续表
种类 序号 保留时间/min保留指数 化合物相对含量/%果汁 SY YSM-1 YSM-8 YSM-10 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 31.521 31.962 36.705 37.025 37.815 38.030 38.726 39.321 41.147 41.668 42.990 43.636 1 665 1 679 1 832 1 842 1 867 1 873 1 895 1 912 1 962 1 976 2 010 2 025 β-紫罗兰酮苯乙酮β-二氢紫罗兰酮大马士酮6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮α-紫罗酮茄酮4-[2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮β-紫罗酮4-（2,6,6-三甲基环己-2-烯-1-亚基）丁-2-酮脱氢-β-紫罗兰酮4-（2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基）-3-丁烯-2-酮4.25 0.04 0.10 0.05 0.19 0.03 0.02 4.22 2.01 3.92 0.04 0.05 2.25 2.971.58 0.07 0.04 0.05 2.19 0.05 0.04 1.36 2.55 1.79 0.09 14.08 0.86 0.92 0.84 0.05 4.10 0.07 6.45 6.91 0.05 5.16烷烯烃类98 99 100 101 102 103 104 14.139 15.344 15.717 17.829 24.840 27.914 32.093 1 161 1 197 1 208 1 267 1 464 1 554 1 683 0.530.05 0.08 0.12 0.11 0.23 0.04 27.732 29.899 32.891 105 106 107 1 549 1 614 1 708合计α-水芹烯柠檬烯β-水芹烯乙烯基苯2-甲基-6-羟基-2-庚烯茶螺烷α-律草烯合计芳樟醇4-萜烯醇α-松油醇合计联二脲氨基脲邻-异丙基苯乙二醇单叔丁醚1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘2-脱氧-D-核糖氮杂环辛酮2，4-二叔丁基苯酚合计0.43 3.58 0.22 0.13 0.07 0.08 0.04 0.19 0.23萜烯类0.36 0.58 0.15 0.17 0.32 1.56 0.27 0.10 0.15 0.09 0.34 0.08 0.09 0.03 0.20 108 109 110 111 112 113 114 115 5.585 5.618 18.127 19.826 34.599 36.169 50.048 53.737 863 865 1 275 1 323 1 764 1 815 2 195 2 320 0.59 0.88 1.71 0.09 0.47 0.05 0.10其他0.41 2.12 0.06 0.74 0.07 0.02 0.03 2.15 0.09 0.14 0.07 0.07 1.12
红树莓果汁及4种酵母（SY、YSM-1、YSM-8、YSM-10）酿造红树莓果酒中醇类物质共鉴定出31种，4种酵母（SY、YSM-1、YSM-8、YSM-10）酿造果酒中分别为11种、21种、17种、16种、19种，相对含量分别为59.89%、26.69%、36.41%、39.60%、29.92%，表明红树莓果汁本身含有大量醇类物质，且主要香气成分为5-甲基-2-己醇（50.46%），经过酵母菌代谢后，醇类物质含量有所降低，可能由于酵母在发酵过程中将部分醇类转化为酯类、酸类或其他次级代谢产物，从而影响最终酒体的香气组成和风味特征。其中共有醇类物质包括异戊醇、苯乙醇、5-甲基-2-己醇、异丁醇等13种。其中，异戊醇贡献苹果、白兰地的成熟果香，苯乙醇贡献玫瑰花、茉莉花香气[12]，与酵母SY酿造果酒相比，菌株YSM-10酿造果酒中异戊醇、苯乙醇的相对含量分别增加11.18%、14.10%。
红树莓果汁及4种酵母（SY、YSM-1、YSM-8、YSM-10）酿造红树莓果酒中酯类物质共鉴定出31种，4种酵母（SY、YSM-1、YSM-8、YSM-10）酿造果酒中分别为3种、23种、19种、18种、19种，相对含量分别为1.70%、67.08%、51.01%、50.4%、61.91%，其主要香气成分分别为苯甲酸乙酯（30.91%）、乙酸乙酯（24.92%）、辛酸乙酯（16.36%）、苯甲酸乙酯（33.88%）。结果表明，红树莓果汁经过酵母菌发酵代谢明显增加酯类物质的相对含量。其中，共有酯类物主要包括苯甲酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸异戊酯和癸酸乙酯等14种。其中，苯甲酸乙酯具有类似冬青油和依兰油的香气，并带有水果的清新香味[34]，辛酸乙酯略带有玫瑰、橙子的花果香气[35]，己酸乙酯具有似苹果、香蕉味、梨的酸甜味的水果香气[36]。与酵母SY酿造果酒相比，菌株YSM-10酿造果酒中苯甲酸乙酯、辛酸乙酯相对含量分别增加2.97%、4.49%。
红树莓果汁及4种酵母（SY、YSM-1、YSM-8、YSM-10）酿造红树莓果酒中酮类物质共鉴定出23种，4种酵母（SY、YSM-1、YSM-8、YSM-10）酿造果酒中分别为8种、9种、13种、9种、9种，相对含量分别为14.08%、4.10%、6.45%、6.91%、5.16%，表明红树莓果汁本身含有较高含量的酮类物质，而经酵母发酵后含量显著降低，这可能是由于酵母在发酵过程中将部分酮类物质转化为其他次级代谢产物 （如醇类或酯类化合物），或通过β-氧化等代谢途径进一步降解所致[12]。这一转化过程可能导致果酒与原料果汁在香气特征上产生明显差异。α-紫罗酮和β-紫罗酮是红树莓的特征香气成分，其中，α-紫罗酮呈现罐藏桃子和烤苹果的香气，且香气阈值极低；β-紫罗酮则表现出典型的花香和红树莓香韵[37]。与酵母SY相比，菌株YSM-10酿造果酒中α-紫罗酮和β-紫罗酮的含量分别增加11.94%、13.29%，这使得菌株YSM-10酿造红树莓果酒更具有红树莓典型风味。
4种酵母（SY、YSM-1、YSM-8、YSM-10）酿造红树莓果酒中醇类、酯类和酮类所占的相对含量较高，因此其在果酒的香气中起到主要的作用，而醛类、酸类、烷烯烃类、萜烯类和其他类成分所占的相对含量较少，对红树莓果酒香气影响较小[10]。
3 结论
本研究通过TTC显色法从野生红树莓果实、果园土壤及其自然发酵液中初筛出24株酵母菌株，并结合乙醇和二氧化硫耐受实验复筛出3株菌株（YSM-1、YSM-8、YSM-10），均鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），将其应用于红树莓果酒模拟发酵试验，通过常规分析方法、感官评价和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术分析果酒品质。结果表明，菌株YSM-10发酵红树莓果酒品质最佳，其酒精度、总糖及总酸含量分别14.7%vol、9.24 g/L、13.22 g/L，感官评分最高（92.8分）。菌株YSM-10酿造果酒中异戊醇、苯乙醇、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、α-紫罗酮和β-紫罗酮等挥发性风味物质含量较高，可赋予酒体典型的红树莓果香和花香。因此，菌株YSM-10可为红树莓果酒酿造提供菌株资源，提高果酒品质。
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