葡萄酒是以鲜葡萄或者葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成，含有一定酒精度的发酵酒[1]，葡萄酒中含有糖类、多种维生素、有机酸以及原花青素、白藜芦醇、多酚类等成分[2]，具有抗氧化[3]、抗炎[4]、抗癌[5]及心血管保护[6]等保健作用。毛葡萄（Vitis heyneana）是我国特有的重要野生葡萄种质资源，其果实富含氨基酸、有机酸、酚类物质、维生素等多种营养成分，赋予其促进消化、调经活血、延缓衰老、缓解疲劳等健康功效[7]。然而，毛葡萄果实糖分含量较低、酸度较高、色泽深浓且单宁含量丰富，风味过酸，因此鲜食适口性不佳而多用于酿酒[8]。马春花等[9]以野生毛葡萄为原料酿造红葡萄酒的总酚含量为5.5 g/L，原花青素含量为29.10 mg/mL，酒体果香浓郁，协调优雅。车金鑫等[10]研究表明，广西毛葡萄含有丰富的多酚和黄酮类物质，抗氧化活性较高，具有很好的应用潜力。
肉桂（Cinnamomum cassia Presl.）为樟科植物肉桂的干燥树皮[11]，主要产于中国广西、广东、福建及东南亚等热带地区[12]。传统医学记载肉桂具有补火助阳、温经止痛之效[13]。现代研究发现，肉桂作为药食同源物质，其主要活性成分为肉桂醛、香豆素、挥发油等，具有抗氧化、抗炎、免疫调节等多种药理功能[14-15]。肉桂兼具风味改良与功能强化作用[16]，且其乙醇提取物在抗氧化方面表现尤为显著[17]。果蝇作为一种重要的模式生物，因其体型小、寿命短、繁殖快、易观察，且与人类约75%的疾病基因功能同源，被广泛用于抗氧化研究[18]。目前，鲜见关于肉桂酿造葡萄酒工艺及抗氧化活性的研究报道。
因此，本研究以广西罗城毛葡萄为主要原料，肉桂为辅料酿造肉桂毛葡萄酒，通过单因素和正交试验，优化其发酵工艺条件，并通过果蝇模型对其抗氧化活性进行分析，以期促进毛葡萄加工利用，为肉桂毛葡萄酒的产品开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
肉桂（Cinnamomum cassia）粉（50目）：广西仙茱中药有限公司；毛葡萄：产地广西罗城；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 受试动物
Oregon K野生型黑腹果蝇，购买于广西菲域贸易有限公司。置于温度（25±1）℃，相对湿度为75%的恒温恒湿箱中饲养，给予自然光照周期（12 h光照/12 h黑暗）。
1.1.3 试剂
偏重焦亚硫酸钾、琼脂、蔗糖、葡萄糖、冰糖（均为食品级）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芦丁（纯度＞98%）：麦克林生化科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；蛋白定量（total protein，TP）试剂盒、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.1.4 培养基
基础培养基：玉米粉19.43 g、琼脂2.80 g、蔗糖7.90 g、葡萄糖15.80 g、酵母粉7.50 g、尼泊金甲酯0.37 g、无水乙醇3.75 mL、蒸馏水325 mL。121 ℃灭菌30 min。
肉桂毛葡萄酒组低、中、高剂量组培养基：在上述培养基基础上，添加不同浓度的肉桂毛葡萄酒，配置成浓度为2.5%、5.0%、7.5%的肉桂毛葡萄酒培养基。
将配制好的培养基倒入灭菌的果蝇管中，培养基厚度约为3 cm（果蝇管和海绵塞121 ℃灭菌30 min），待培养基凝固，置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.2 仪器与设备
Purelab Classic UV超纯水仪：英国ELGA公司；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；KFJ-A电子秤：凯丰集团有限公司；YXQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BES700-GY智能培养箱：武汉博尔斯科学仪器设备有限责任公司；PHB-4型便携式pH计：德图仪器国际贸易（上海）有限公司；BK-8480酒精计：北京柏莱斯特科技发展有限公司；PAL-1型手持糖度计：河北凡耕科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 肉桂毛葡萄酒加工工艺流程及操作要点
操作要点：
原料预处理：选用新鲜、籽粒饱满、质量一致的毛葡萄，清水洗净表面污物后放入1%盐水溶液浸泡30 min，自来水清洗3次，晾干，葡萄除梗、手工破碎后装入发酵罐。
添加偏重亚硫酸钾：以毛葡萄果浆质量为基准，于果浆中添加3%的肉桂粉及3%偏重亚硫酸钾[19]。
接种酵母：于果浆中加入0.03%活性干酵母（5%葡萄糖水溶液中37 ℃活化20 min）。
主发酵：于22 ℃的智能恒温培养箱中发酵14 d，每日监测酒精度，当酒精度不再上升时发酵结束。
皮渣分离：主发酵结束后，将肉桂葡萄发酵液皮渣分离，皮渣用4层脱脂纱布进行压榨过滤。
后发酵：充分利用分离时带入少量空气，促使肉桂毛葡萄酒中的酵母将剩余糖分继续分解，转化为酒精。由于后续发酵过程中会产生气体，因此在玻璃罐顶部留出5～15 cm的空间，于22 ℃发酵45 d，直到不再产生气体发酵结束。
澄清、过滤：将酒液于15 ℃冰箱进行冷藏处理48 h，采用8层纱布过滤[20-21]，即得澄清的肉桂毛葡萄酒成品。
1.3.2 肉桂毛葡萄酒发酵工艺条件优化
单因素试验：在上述工艺流程基础上，以感官评分为主要评价指标，酒精度、总黄酮得率为参考指标，分别考察初始糖度（18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx、26°Bx）、酵母添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、主发酵时间（6 d、10 d、14 d、18 d、22 d）和肉桂粉添加量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）对肉桂毛葡萄酒品质的影响。
正交试验：在单因素试验结果的基础上，以初始糖度（A）、酵母添加量（B）、主发酵时间（C）、肉桂添加量（D）为影响因素，采用4因素3水平L9（34）正交试验设计，优化肉桂毛葡萄酒发酵工艺条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 肉桂毛葡萄酒发酵工艺条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization of cinnamon-Vitis heyneana wine
水平 A 初始糖度/°Bx B 酵母添加量/%C 主发酵时间/d D 肉桂添加量/%1 2 3 20 22 24 0.02 0.03 0.04 14 18 22 0.5 1.0 1.5
1.3.3 理化指标测定
酒精度的测定：参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]。
总黄酮含量的测定：采用NaNO2-Al（NO3）3显色法[23]，以芦丁质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线，获得芦丁标准曲线回归方程为y=0.514 3x+0.022 6，相关系数R2=0.999。
式中：C为样品中总黄酮的质量浓度，mg/L；V为原浸提液体积，mL；N为稀释倍数；M为肉桂葡萄酒的取样量，g。
1.3.4 感官评价
依据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用试验方法》，选取10名经过感官培训的人员对肉桂毛葡萄酒进感官评价，从色泽、风味、口感、风格4个方面对肉桂毛葡萄酒进行感官评价，感官评分为100分。感官评分标准见表2。
表2 肉桂毛葡萄酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of cinnamon-Vitis heyneana wine
项目 评分标准 得分/分色泽（15分）风味（30分）澄清透明、有光泽、鲜艳的紫红色轻微浑浊、无光泽、淡紫红色有明显悬浮物和沉淀物、无光泽、色泽暗淡酒香醇厚、浓郁，香气协调酒香较浓郁，香气较协调香气不协调11～15 6～10 1～5 21～30 11～20 1～10
续表
项目 评分标准 得分/分口感（40分）风格（15分）酒体协调、醇厚、酸甜适中酒体协调、酸甜较适中偏酸/偏甜，总体不协调酒体不协调，口感寡淡具有典型性较有典型性缺乏典型性31～40 21～30 11～20 1～10 11～15 6～10 1～5
1.3.5 肉桂毛葡萄酒抗氧化活性
（1）果蝇寿命实验
在研究抗氧化和抗衰老作用的生物实验中，寿命是最直接的观测指标，果蝇实验中，通常用半数死亡时间、平均寿命以及最长寿命作为观测[24]。参考GOLUBEV D等[25]的研究方法，收集10 h内羽化的果蝇成虫用乙醚麻醉后随机分成4组，即空白对照组（不添加肉桂毛葡萄酒）、低剂量组（2.5%肉桂毛葡萄酒）、中剂量组（5.0%肉桂毛葡萄酒）、高剂量组（7.5%肉桂毛葡萄酒），每组均设雌雄2个小组，雌雄分别30只，各重复3次。每隔3 d更换一次各组果蝇培养基，每天定时记录果蝇死亡只数，逃逸或非正常死亡的果蝇不计在内，直到每组最后一只果蝇死亡。绘制果蝇生存曲线，计算果蝇的平均寿命、最长寿命、半数死亡时间。各项寿命指标的计算公式如下：
（2）抗氧化活性检测
参考朱蕴兰等[26]的研究方法，分组及饲养方法同上述果蝇寿命实验。在培养25 d时，将果蝇分别放入干净灭菌的培养管中饥饿2 h，在干冰中冷冻处死。准确称取待测果蝇质量，按照果蝇质量与生理盐水比例为1∶19加入预冷的生理盐水，在4 ℃条件下进行组织研磨破碎，充分破碎后，离心（7 500 r/min，10 min），将上清液按比例稀释成适当浓度，按照说明书要求测定SOD、CAT活性及T-AOC能力。
1.3.6 数据处理与统计分析
使用SPSS statistics 25.0软件进行统计学分析，Graphpad prism 8.0.2绘制生存曲线，多组间均数比较采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），所有数据均以“平均值±标准偏差”表示，P＜0.05具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 肉桂毛葡萄酒发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 初始糖度的确定
糖对葡萄酒的质量起决定性作用，是葡萄酒发酵过程中酵母菌生长和代谢的主要能源[27]。初始糖度对肉桂毛葡萄酒品质的影响见图1。由图1可知，随着初始糖度的增加，肉桂毛葡萄酒的总黄酮得率呈下降趋势，总黄酮得率范围为11%～13%，酒精度及感官评分均出现先上升后下降的趋势，当初始糖度为22°Bx时，酒精度和感官评分达到最高，分别为18.4%vol和84.4分，此时总黄酮得率为11.97%。随着初始糖度的继续增加，酒精度降低的原因可能是，浓度过高的糖抑制酵母菌的发酵速度及产酒效率[28]。综合考虑，选择初始糖度为20°Bx、22°Bx、24°Bx进行正交试验。
图1 初始糖度对肉桂毛葡萄酒品质的影响
Fig.1 Effect of initial sugar content on the quality of cinnamon-Vitis heyneana wine
2.1.2 酵母添加量的确定
酵母菌是将糖转化为酒精、二氧化碳以及多种次级代谢产物的主要微生物，在葡萄酒酿造过程中起着重要的作用[29]。酵母添加量对肉桂毛葡萄酒品质的影响见图2。由图2可知，随着酵母接种量的增加，肉桂毛葡萄酒的酒精度、感官评分及总黄酮得率均呈出现先上升后下降的趋势，当接种量为0.03%时，酒精度、感官评分及总黄酮得率最高，分别为达17.8%vol、82.0分、15.97%。接种量继续增加，酒精度、感官评分及总黄酮得率下降的原因可能是，菌种接种密度过大，会抑制酵母生长[30]。综合考虑，选择酵母接种量为0.02%、0.03%、0.04%进行正交试验。
图2 酵母添加量对肉桂毛葡萄酒品质的影响
Fig.2 Effect of yeast addition on the quality of cinnamon-Vitis heyneana wine
2.1.3 主发酵时间的确定
葡萄汁在酵母的作用下通过酒精发酵转化为葡萄酒的初步形态，此过程伴随着糖分向酒精和二氧化碳的转化[31]。主发酵时间对肉桂毛葡萄酒品质的影响见图3。由图3可知，随主发酵时间在6～18 d范围内的增加，酒精度、感官评分及总黄酮得率呈升高趋势；当发酵时间为18 d时，酒精度及感官评分最高，分别为18.7%vol、84.3分，此时，总黄酮得率为19.46%；当发酵时间＞18 d时，酒精度及感官评分有所下降，而总黄酮得率趋于平稳。综合考虑，选择主发酵时间为14 d、18 d、22 d进行正交试验。
图3 主发酵时间对肉桂毛葡萄酒品质的影响
Fig.3 Effect of main fermentation time on the quality of cinnamon-Vitis heyneana wine
2.1.4 肉桂添加量的确定
肉桂添加量对肉桂毛葡萄酒品质的影响见图4。由图4可知，随着肉桂添加量的递增，肉桂毛葡萄酒酒精度及感官评分呈先增加后降低的趋势，而总黄酮得率逐渐增加，当肉桂添加量分别为1.0%、1.5%、2.5%时，肉桂毛葡萄酒感官评分、酒精度及总黄酮得率最高，分别达82.3分、18.7%vol、14.90%。肉桂添加量较高时，感官评分呈下降趋势的原因可能是，肉桂毛葡萄酒酒体的风味不协调。综合考虑，选择肉桂的添加量为0.5%、1.0%、1.5%进行正交试验。
图4 肉桂添加量对肉桂毛葡萄酒品质的影响
Fig.4 Effect of cinnamon addition on cinnamon-Vitis heyneana wine
2.2 肉桂毛葡萄酒发酵工艺优化正交试验
在单因素试验结果的基础上，以初始糖度（A）、酵母添加量（B）、主发酵时间（C）和肉桂添加量（D）为影响因素，以感官评分为评价指标，进行4因素3水平L9（34）正交试验，肉桂毛葡萄酒发酵工艺条件优化正交试验结果与分析见表3。
表3 肉桂毛葡萄酒发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for optimization of fermentation process of cinnamon-Vitis heyneana wine
试验号 A B C D 感官评分/分123456789k1 111222333 123123123 123231312 123312231 67.6 68.4 70.6 75.6 77.0 72.8 90.6 82.4 86.4 k2 k3R 68.867 75.133 86.467 17.600 77.933 75.933 76.600 2.000 74.267 76.800 79.400 5.133 77.000 77.267 76.200 1.067
由表3可知，由极差值（R）可知，影响肉桂毛葡萄酒感官评分的主次因素为A＞C＞B＞D，即初始糖度＞主发酵时间＞酵母添加量＞肉桂添加量。由K值可知，肉桂酒酿最佳发酵工艺条件组合为A3B1C3D2，即初始糖度24°Bx，酵母添加量0.02%，主发酵时间22 d，肉桂添加量1%。在此优化条件下进行3次平行验证试验，肉桂毛葡萄酒感官评分为91.3分，高于试验组7号，此时，肉桂毛葡萄酒色泽澄清透明、有光泽，酒香醇厚、浓郁，香气协调，口感醇厚、酸甜适中。其酒精度为15.60%vol，pH值为3.4，总糖含量为15.4 g/L，总黄酮得率为19.45%。
2.3 肉桂毛葡萄酒体内抗氧化试验结果与分析
2.3.1 肉桂毛葡萄酒对黑腹果蝇寿命的影响
为考察肉桂毛葡萄酒对黑腹果蝇寿命的影响，评估了不同剂量肉桂毛葡萄酒对Oregon K野生型黑腹果蝇寿命的影响，绘制果蝇寿命曲线见图5，平均寿命、最长寿命等指标见表4。
图5 不同剂量肉桂毛葡萄酒对果蝇存活率的影响
Fig.5 Effect of different cinnamon-Vitis heyneana wine doses on the survival rate of Drosophila melanogaster
表4 不同剂量肉桂毛葡萄酒对黑腹果蝇寿命的影响
Table 4 Effect of different cinnamon-Vitis heyneana wine doses on the lifespan of Drosophila melanogaster
注：“*”、“**”分别表示与空白对照组比较，差异显著（P＜0.05）、极显著（P＜0.01）。
组别平均寿命/d雌雄最长寿命/d雌雄半数死亡时间/d雌雄空白对照组低剂量组中剂量组高剂量组19.53±2.53 26.60±2.90**24.50±3.86*25.10±2.34*32.35±4.00 37.56±3.48 43.55±4.10**36.43±4.53 43.63±1.49 50.13±5.62 49.38±4.85 48.00±3.89 60.25±3.28 61.88±2.95 71.13±4.52**65.75±4.50 14.75±2.50 24.00±7.16 20.00±5.23 21.50±6.14 28.25±8.66 43.00±2.71**46.50±8.06**39.75±4.92*
由图5可知，培养时间为0～20 d时，不同组别果蝇存活率差异不明显；培养时间＞20 d之后，不同组别果蝇生存能力开始有明显区别，与空白组相比，低、中、高剂量肉桂毛葡萄酒组果蝇的生存能力明显增加，其中，中剂量肉桂毛葡萄酒组果蝇存活率较高。因此，中剂量肉桂毛葡萄酒可显著提高果蝇生存能力。
由表4可知，与空白对照组比较，低、中、高剂量肉桂毛葡萄酒组雌性果蝇平均寿命，分别极显著、显著延长36.20%（P＜0.01）、25.45%和28.52%（P＜0.05），雄性果蝇的平均寿命分别延长了16.11%、34.62%和12.61%，其中，中剂量肉桂毛葡萄酒组寿命延长极显著（P＜0.01）；与空白对照组相比，雌性果蝇的最长寿命分别延长14.90%、13.18%和10.02%，雄性果蝇的最长寿命分别延长2.71%、18.06%和9.13%，其中，中剂量肉桂毛葡萄酒组寿命延长极显著（P＜0.01）；与空白对照组相比，雌性果蝇的半数死亡时间分别延长62.71%、35.60%和45.76%，雄性果蝇的半数死亡时间分别极显著、显著延长52.21%、64.60%（P＜0.01）和40.71%（P＜0.05）。因此，肉桂毛葡萄酒可有效延长黑腹果蝇的寿命，且中剂量肉桂毛葡萄酒延长雄果蝇寿命效果更好。
2.3.2 肉桂毛葡萄酒对黑腹果蝇体内抗氧化活性的影响
超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等酶能有效地清除机体内部多余的活性氧，维持机体内部自由基的平衡状态[32-33]。肉桂毛葡萄酒对雌、雄黑腹果蝇体内SOD活性、CAT活性及T-AOC活力的影响见表5。
表5 肉桂毛葡萄酒对雌、雄黑腹果蝇体内超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性及总抗氧化能力的影响
Table 5 Effect of cinnamon-Vitis heyneana wine on the superoxide dismutase, catalase activities, and total antioxidant capacity in vivo
注：“*”、“**”分别表示各剂量组与空白对照组差异显著（P＜0.05）、极显著（P＜0.01）。
组别SOD活性/（U·mg蛋白质-1）雌雄CAT活性/（U·mg蛋白质-1）雌雄T-AOC活力/（mmol·g蛋白质-1）雌雄空白对照组低剂量组中剂量组高剂量组56.06±4.63 59.61±2.66 63.59±6.77**70.62±2.77**57.35±3.51 57.91±0.59 61.25±2.48*57.39±3.99 9.29±0.01 10.51±0.02**11.39±0.01**11.43±0.05**8.45±0.01 10.43±0.03**11.05±0.01**10.82±0.01**0.87±0.06 0.97±0.08*0.96±0.05*0.88±0.06 0.91±0.10 1.35±0.08**1.42±0.03**1.41±0.26**
由表5可知，与空白对照组相比，低、中、高剂量肉桂毛葡萄酒组雌、雄果蝇体内SOD活性、CAT活性及T-AOC活力均提高。其中，低、中、高剂量肉桂毛葡萄酒组雌性果蝇体内SOD活性分别提高6.33%、13.43%、25.97%，中、高剂量肉桂毛葡萄酒组雌性果蝇SOD活性极显著升高（P＜0.01）；低、中、高剂量肉桂毛葡萄酒组雄性果蝇体内SOD活力分别提高0.98%、6.80%和0.07%，中剂量肉桂毛葡萄酒组雄性果蝇体内SOD活性显著升高（P＜0.05）。与空白对照组相比，低、中、高剂量肉桂毛葡萄酒组雌性果蝇体内CAT活性分别极显著提高13.13%、22.60%、23.04%（P＜0.01），雄性果蝇体内CAT活性分别极显著提高23.43%、30.77%和28.05%（P＜0.01）。低、中、高剂量肉桂毛葡萄酒组雌性果蝇体内T-AOC活力分别提高11.49%、10.34%、1.15%，其中低、中剂量肉桂毛葡萄酒组雌性果蝇体内T-AOC活力显著升高（P＜0.05）；低、中、高剂量肉桂毛葡萄酒组雄性果蝇体内T-AOC活力分别极显著提高48.35%、56.04%和54.95%（P＜0.01）。因此，肉桂毛葡萄酒能有效增强果蝇体内抗氧化能力，且具有显著的剂量依赖性和性别差异性。其中，中剂量组肉桂毛葡萄酒对提升雄性果蝇SOD活性、CAT活性和T-AOC活力效果尤为显著。
3 结论
本研究通过单因素及正交试验对肉桂毛葡萄酒发酵工艺条件进行优化，得出最佳发酵工艺条件为：初始糖度24°Bx，酵母添加量0.02%，主发酵时间22 d，肉桂添加量1%。在此优化条件下，肉桂毛葡萄酒感官评分、酒精度、pH值、总糖含量及总黄酮得率分别为91.3分、15.60%vol、3.4、15.4 g/L、19.45%。体内抗氧化实验结果表明，低、中、高剂量组肉桂毛葡萄酒均可延长果蝇的寿命，提高果蝇体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性及总抗氧化能力（T-AOC）。与空白对照组相比，中剂量肉桂毛葡萄酒对雄性果蝇寿命延长效果最佳，其平均寿命、最长寿命、半数死亡时间分别极显著增加34.62%、18.06%和64.60%（P＜0.01），SOD酶活性、CAT酶活性和T-AOC分别显著或极显著提高6.80%（P＜0.05）、30.77%、56.04%（P＜0.01）。因此，肉桂毛葡萄酒具有一定抗氧化能力。
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