植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）是一类广泛存在于自然界的革兰氏阳性菌，具有发酵糖生成乳酸的能力。该菌株经常在葡萄果皮和葡萄酒中被发现，其不仅可耐受14%vol的酒精度，还显现出与酒酒球菌（Oenococcus oeni）相当的SO2耐受性，这种双重耐受特性使其在葡萄酒发酵体系中具有独特的生态竞争优势[1-3]。基因组学研究揭示，植物乳植杆菌携带由1个citP、3个mleP基因构成的2-羟基羧酸转运蛋白（2-hydroxycarboxylate transporter，2HCT）家族，这类基因簇可以使该菌株代谢利用有机酸和耐受高酸环境，使该菌株在葡萄酒酿造工业中具有巨大的应用潜力[4-9]。柠檬酸转运蛋白（citrate transporter，CitP）属于一种质子转运体，通过电化学偶联Hcit2-与单个H+易位产生电位差，驱动柠檬酸的跨膜运输，具有控制柠檬酸代谢的功能[10]。苹乳发酵（malolactic fermentation，MLF）通过乳酸菌代谢将苹果酸转化为乳酸，降低葡萄酒酸度并提升口感圆润度，且可调控酯类与醇类比例，减少生青味并增强香气复杂度[11-12]。在苹乳发酵过程中（图1），苹果酸由苹果酸转运蛋白（malate transporter，MleP）转运到细胞内，然后主要由苹果酸乳酸酶（malic enzyme，MleA）催化生成乳酸；而柠檬酸则依赖CitP转运，经柠檬酸裂解酶（citrate lyase，CL）分解为乙酸和草酰乙酸，后者通过苹果酸脱氢酶（催化草酰乙酸脱羧）（malate dehydrogenase（oxaloacetate-decarboxylating），MaeA）转化为丙酮酸和二氧化碳，丙酮酸作为细胞内重要的中间产物，可进一步转化为乳酸、乙酸、双乙酰、乙偶姻、2,3丁二醇等风味物质[9]。前期研究证实，植物乳植杆菌柠檬酸转运蛋白缺陷株XJ25-ΔcitP因缺失柠檬酸转运功能，在维持苹果酸代谢能力的同时，使培养基中乙酸、乳酸、双乙酰及乙偶姻含量显著低于野生株XJ25[10]。基于此，系统解析该缺陷株对葡萄酒苹乳发酵过程中风味特征的影响机制，可为靶向调控葡萄酒品质提供理论依据。
图1 乳酸菌苹果酸和柠檬酸代谢途径示意图
Fig.1 Schematic diagram of the metabolic pathways of malic acid and citric acid by lactic acid bacteria
MDH：苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase）；FH：延胡索酸水合酶（fumarate hydratase）；SdhA：延胡索酸还原酶（fumarate reductase）；LDH：乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase）；PdhA：丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase）；AckA：乙酸激酶（acetate kinase）；AlsS：乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase）；AlsD：乙酰乳酸脱羧酶（acetolactate decarboxylase）；ButA：双乙酰还原酶（acetoin reductase）；ButB：乙偶姻还原酶（butyraldehyde reductase）。
葡萄酒中已鉴定出1 000余种挥发性香气成分，这些物质通过品种香、发酵香与陈酿香共同塑造感官特征，其含量受葡萄品种、气候条件和酿造工艺等多重因素调控[13-14]。鉴于香气物质阈值低但对整体风味贡献显著，建立精准的分析方法体系尤为重要。现有一些研究采用气相色谱-嗅闻-质谱联用技术（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）结 合 气 味 活 度 值（odor activity value，OAV），可直接鉴定关键呈香物质[15-16]。另一些研究则采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱技术（headspace solidphase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用偏最小二乘-判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）等多元统计分析，可有效辨识差异化合物[17-19]。值得注意的是，当前关于苹乳发酵的研究多聚焦于酒酒球菌，而对植物乳植杆菌风味调控机制的解析仍较匮乏。
本研究在葡萄酒苹乳发酵过程中创新性地接种植物乳植杆菌柠檬酸转运蛋白缺陷株XJ25-ΔcitP，采用常规方法检测总酸和挥发酸含量，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）及HS-SPME-GC-MS分别检测关键有机酸组成及挥发性风味成分，并对其进行感官评价，最终结合正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA）、聚类分析（clustering analysis，CA）等多元统计方法全面揭示风味特征变化。通过多维度数据关联解析柠檬酸代谢途径对葡萄酒香气品质的调控机制，为苹乳发酵工艺优化提供新型菌株资源与理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
葡萄酒样：由河南牧业经济学院食品与生物工程学院（酒业学院）酿造的酒精发酵完成且未启动苹乳发酵的赤霞珠干红葡萄酒，酒精度为12.5%vol，总糖含量为2.7 g/L，干浸出物含量为26.8 g/L，pH值3.6，总二氧化硫含量为38.0 mg/L。
植物乳植杆菌野生菌株XJ25：分离自新疆产区自发进行苹果酸乳酸发酵的干红葡萄酒中，保藏于本实验室；柠檬酸转运蛋白缺陷株XJ25-ΔcitP：以野生菌株XJ25为出发菌株，通过成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9，CRISPR-Cas9）基因编辑技术敲除基因citP后得到的工程菌株，保藏于本实验室。
1.1.2 化学试剂
L-苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、4-辛醇（均为色谱纯）、溴酚蓝（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸锰、硫酸镁、吐温80、硫酸铵、磷酸氢二钾、正丁醇、酚酞、氯化钠（均为分析纯）、酵母浸粉（生化试剂）：天津市科密欧化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
MRS液体培养基：广东中山百微生物技术有限公司。
MRSg液体培养基[9]：一种改良的MRS培养基，含有柠檬酸1 g/L，L-苹果酸1 g/L，硫酸锰0.04 g/L，硫酸镁0.2 g/L，吐温80 1 mL/L，氯化钠5 g/L，硫酸铵2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，酵母浸粉4 g/L，用HCl调整pH值为3.7，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，灭菌后在超净工作台中加入无水乙醇使其酒精度为7%vol。
1.2 仪器与设备
UltiMate-3000高效液相色谱仪：赛默飞世尔科技有限公司；Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm×7.8 mm）：美国Bio-Rad公司；65 μm PDMS/DVB顶空固相微萃取装置及纤维头：美国Supelco公司；GCMS-QP2020 NX气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司；DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 葡萄酒样的苹乳发酵
将-80 ℃冰箱中保存的野生株XJ25及缺陷株XJ25-ΔcitP分别接种于MRS液体培养基，37 ℃静置活化培养24 h。再按5%（V/V）的接种量接种于MRSg液体培养基，25 ℃静置培养24 h进行驯化。将驯化后的菌液在8 000 r/min、4 ℃条件下离心5 min，去上清，采用等体积的葡萄酒样进行重悬后，按照5%（V/V）的接种量接种于葡萄酒样中，以未接种的葡萄酒样为空白对照，20 ℃静置培养。根据纸层析法监控发酵进程[20]，待酒样中苹果酸斑点消失视为发酵结束，发酵结束后加入60 mg/L二氧化硫。
1.3.2 分析检测方法
总酸、挥发酸含量的测定：根据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒分析方法》；关键有机酸含量的测定：采用HPLC法[9]；挥发性风味物质的测定：采用HS-SPME-GC-MS法[21]。
1.3.3 感官评价
由河南牧业经济学院酿酒工程专业10名受训成员（5男5女）组成感官评价小组，采用10分制量化强度对葡萄酒样的果香、花香、生青、香料、奶油、烘烤及刺激味7类特征香气进行评分[15]。数据经方差分析剔除异常值后取均值，以消除个体差异对酒样客观特性的影响。
1.3.4 数据处理与统计分析
每个样品3个平行，结果用“平均值±标准差”表示。利用Microsoft Office 2019和IBM SPSS Statistics 26软件进行数据统计及处理；采用Graphpad Prism 8.0.2软件绘制香气组成差异图；采用SIMCA 14.1软件进行OPLS-DA，并计算变量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）值；采用Origin 2024软件绘制热图及雷达图。
2 结果与分析
2.1 总酸与挥发酸含量差异分析
苹乳发酵后不同葡萄酒样中总酸及挥发酸含量的测定结果见图2。由图2可知，与空白对照组酒样相比，菌株XJ25发酵酒样与菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样的总酸含量分别显著下降9.70%、5.06%（P＜0.05），但菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样的总酸含量显著高于菌株XJ25发酵酒样5.14%（P＜0.05）。与空白对照组酒样相比，菌株XJ25发酵酒样中挥发酸含量显著提高64.00%，而菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样无显著差异（P＞0.05），但菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样的挥发酸含量显著低于菌株XJ25发酵酒样37.80%（P＜0.05）。结果说明，citP基因的存在与高挥发酸的产生有直接关联，敲除该基因能够在一定程度上实现既有效降低葡萄酒酸度，又避免因挥发酸过高而影响酒体风味的目标。
图2 苹乳发酵后不同葡萄酒样中总酸及挥发酸含量测定结果
Fig.2 Determination results of total acid and volatile acid contents in different wine samples after malolactic fermentation
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 关键有机酸含量分析
苹乳发酵后不同葡萄酒样中关键有机酸含量的测定结果见图3。由图3可知，与空白对照组酒样相比，菌株XJ25与XJ25-ΔcitP发酵酒样未检出苹果酸，而乳酸含量分别显著升高492.06%、468.72%（P＜0.05），这是由于酒精发酵结束后的葡萄酒中还存在少量残糖，可以被乳酸菌代谢生成乳酸，导致乳酸检测结果有所偏高；菌株XJ25发酵酒样未检出柠檬酸，菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样中保留了81.56%柠檬酸含量（P＜0.05），说明菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样过程中有少量柠檬酸通过简单扩散进入细胞内；菌株XJ25发酵酒样乙酸含量显著升高了86.67%（P＜0.05），而菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样只显著提高了8.93%（P＜0.05），这是由于柠檬酸代谢过程中会产生乙酸。此外，由于柠檬酸转运蛋白的缺失，对酒石酸与琥珀酸的含量也有所影响。与空白对照组酒样相比，菌株XJ25发酵酒样酒石酸及琥珀酸含量分别显著提高了1.03%、10.98%（P＜0.05），而菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样无显著变化（P＞0.05），琥珀酸质量浓度过高会使葡萄酒滋味浓厚，甚至会有苦味，而酸度是高品质葡萄酒感知的驱动因素，直接影响消费者的偏好程度[22]。与菌株XJ25发酵酒样相比，菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样中的乙酸、乳酸和琥珀酸含量分别显著降低了41.65%、3.94%和8.97%（P＜0.05）。因此，采用菌株XJ25-ΔcitP进行苹乳发酵，能够在实现有效降低挥发酸含量的同时，显著降低乙酸含量，有效控制琥珀酸含量，维持乳酸的核心骨架作用，保留少量柠檬酸带来清新感，从而提升葡萄酒的风味复杂性和稳定性，展现出较大的应用潜力。
图3 苹乳发酵后不同葡萄酒样中有机酸含量测定结果
Fig.3 Determination results of organic acid contents in different wine samples after malolactic fermentation
2.3 挥发性风味成分分析
2.3.1 挥发性风味成分定性定量分析
苹乳发酵后不同葡萄酒样中挥发性风味成分的GC-MS分析结果见表1。由表1可知，通过HS-SPME-GC-MS技术从3种葡萄酒样中共检测到118种挥发性风味物质，包括醇类38种、酯类49种、酸类7种、醛类7种、酮类5种、萜烯类6种、烷烃类1种、其他物质5种。空白对照组酒样中共检出85种挥发性风味物质，包括醇类23种、酯类41种、酸类7种、醛类5种、酮类2种、萜烯类2种、烷烃类0种、其他物质5种；菌株XJ25发酵酒样中共检出88种挥发性风味物质，包括醇类24种、酯类41种、酸类7种、醛类5种、酮类3种、萜烯类3种、烷烃类1种、其他物质4种；菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样中共检出83种挥发性风味物质，包括醇类26种、酯类40种、酸类7种、醛类3种、酮类1种、萜烯类2种、烷烃类0种、其他物质4种。综上所述，3种葡萄酒样在挥发性风味成分的种类存在区别。各类别挥发性风味成分含量占比见图4。
表1 苹乳发酵后不同葡萄酒样中挥发性风味成分GC-MS分析结果
Table 1 Volatile flavor components in different wine samples after malolactic fermentation analyzed by GC-MS
种类 序号 化合物 香气特征[16-17，23-28] P 值含量/（μg·L-1）空白对照组 菌株XJ25发酵酒样 菌株XJ25-ΔcitP 发酵酒样1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 83.10±7.02-- - -5.20±0.16 3.00±0.24--320.60±10.86 10.55±0.61 96.90±3.02 230.05±115.03 0.15±0.08 0.65±0.33-4.40±0.33-0.80±0.40 7.50±0.73 348.10±20.49 10.45±1.18 0.35±0.18醇类（38种）11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26异丁醇2-甲基丁醇异戊烯醇正戊醇3-甲氧基-1,2-丙二醇4-甲基-1-戊醇2-庚醇（S）-（+）-2-庚醇3-甲基-1-戊醇正己醇反式-3-己烯-1-醇3-乙基-4-甲基-1-戊醇反式-2-己烯-1-醇顺式-2-己烯-1-醇2-壬烯-1-醇蘑菇醇正庚醇5-甲基-5-壬醇6-甲基-5-庚烯-2-醇2-乙基己醇3-乙基-4-甲基戊-1-醇4-甲基-2-戊醇正辛醇2,3-丁二醇反式-2-癸烯醇反式-2-辛烯-1-醇轻甜、酒精味果香、花香脂肪味苦杏仁味、香脂味-坚果味柠檬、柑橘-辛辣、青草香香草草本-生青味生青味青香、脂肪味蘑菇脂肪花香、果香青香花香-刺激味柑橘黄油、奶酪-青香--84.60±15.51 528.35±37.93 0.30±0.15 0.85±0.43 0.75±0.38 3.85±0.20 0.90±0.45-6.30±0.82 343.10±1.31 10.05±1.51-1.05±0.04 0.95±0.04 1.20±0.08 3.80±1.90 9.95±0.29 2.05±0.20 0.45±0.04 13.50±0.33 18.45±0.12 4.85±0.04 19.70±0.49 11.45±0.45-0.90±0.00-- - - - - ---1.60±0.80-- -15.10±2.94 20.40±3.84-19.30±3.10 10.10±3.51 1.30±0.24-15.45±0.69 19.75±0.86-19.15±1.92 3.00±0.90 0.35±0.18 1.20±0.16 0.378 0.009 0.244 0.286 0.125 0.004 0.001 0.125 0.000 0.173 0.903 0.125 0.000 0.000 0.000 0.226 0.000 0.000 0.000 0.532 0.698 0.000 0.965 0.015 0.002 0.000
续表
种类 序号 化合物 香气特征[16-17，23-28] P 值含量/（μg·L-1）空白对照组 菌株XJ25发酵酒样 菌株XJ25-ΔcitP 发酵酒样α-松油醇3-甲硫基丙醇2-十一醇2-壬醇正癸醇香茅醇苯甲醇苯乙醇肉豆蔻烯醇月桂醇反式-橙花叔醇肉豆蔻醇丁香脂肪味花香、果香脂肪、柑橘花香青草、蔷薇、丁香果香、烘烤味、甜味玫瑰、蜂蜜木头味花香花香木头味-- - -0.029 0.125 0.125 0.000 0.628 0.824 0.125 0.006 0.000 0.000 0.000 0.019酯类（49种）27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38小计39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71乙酸乙酯乙酸异丁酯丁酸乙酯2-甲基丁酸乙酯3-甲基丁酸乙酯乙酸异戊酯己酸甲酯4-甲基戊酸甲酯丁酸庚酯己酸乙酯丁酸异戊酯乙酸己酯3-己烯酸乙酯（E）-3-己烯酸乙酯乙酸叶醇酯（E）-3-己烯-1-醇乙酸酯庚酸乙酯2-己烯酸乙酯己酸丁酯乳酸乙酯乙酸异辛酯3-甲基戊基乙酸酯辛酸乙酯1-丙戊基丁酸酯己酸异戊酯甲酸庚酯3-羟基丁酸乙酯壬酸乙酯DL-白氨酸乙酯乳酸异戊酯丙二酸二乙酯癸酸甲酯2-戊基异丁基亚硫酸酯果香香蕉、果香草莓味、水果味果香、青香果香香蕉、果香水果味香料青香果香、甜香果香苹果、茴芹果香果香花香-菠萝、香蕉花香、果香果香果香果香-果香、酯香、甜香-香蕉、果香果香、花香花香果香、玫瑰香果香果香0.35±0.18 0.05±0.03-1.00±0.00 8.20±1.22 3.10±0.65-576.35±19.72 0.65±0.12 6.95±0.12-1.20±0.00 1 593.4±55.44 385.55±10.90 18.65±9.33 38.00±7.76 0.20±0.10 1.10±0.16 925.20±108.27 1.65±0.83 2.55±1.28-581.15±107.41-22.50±4.25 1.55±0.20 0.50±0.25-0.30±0.15 1.95±0.53 23.05±7.39-14.45±0.37——-7.35±0.37 2.90±0.33-492.70±1.06-5.50±0.00 0.95±0.12 0.95±0.12 1 020.05±19.88 335.65±24.21 25.15±2.65 39.80±1.31 3.20±0.00 1.00±0.00 871.20±17.64-4.65±0.86 0.70±0.35 576.70±12.41 0.35±0.18 21.60±0.82 0.50±0.25 1.30±0.08 0.65±0.04 0.75±0.04-31.05±0.29 1.05±0.12 40.35±0.20 0.15±0.04-576.90±20.49 0.45±0.04 3.85±0.37-0.65±0.04 1.70±0.08-7.75±0.20 0.25±0.04 1.70±0.08 0.95±0.04 545.00±92.02 0.60±0.08 4.55±0.53 11.90±0.90 0.95±0.04 1.40±0.41 4.35±0.04 3.65±0.12 0.10±0.05 2.25±0.20-0.70±0.16-0.65±0.33-7.70±0.73 2.80±0.41 3.35±1.68 486.00±26.62-4.95±0.04-0.40±0.20 1 547.15±80.14 351.65±27.07 25.65±0.69 38.10±1.47 3.10±0.65 1.10±0.16 799.75±41.85-4.15±0.12-559.10±20.82-22.30±1.55 1.30±0.16 1.50±0.16 0.20±0.10 0.20±0.10 1.80±0.16 21.65±4.12-13.80±0.00 2.00±1.00 0.20±0.10 526.55±20.53-3.95±0.04 8.95±0.04 0.70±0.08 2.15±0.37 4.70±0.57 3.65±0.37 0.25±0.04 1.35±0.61-0.145 0.698 0.910 0.000 0.702 0.256 0.125 0.313 0.125 0.936 0.125 0.939 0.022 0.018 0.001 0.039 0.002 0.197 0.000 0.000 0.139 0.125 0.676 0.000 0.209 0.000 0.004 0.140 0.000 0.000 0.064 0.130 0.000
续表
种类 序号 化合物 香气特征[16-17，23-28] P 值含量/（μg·L-1）空白对照组 菌株XJ25发酵酒样 菌株XJ25-ΔcitP 发酵酒样γ-丁内酯癸酸乙酯正辛酸异戊酯丁二酸二乙酯乙基9-癸烯酸酯水杨酸甲酯苯乙酸乙酯月桂酸甲酯乙酸苯乙酯月桂酸乙酯2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇单异丁酸酯3-羟基辛酸乙酯肉豆蔻酸乙酯2-乙基己基苯甲酸酯棕榈酸甲酯乙二醇月桂酸酯烘烤味果香、脂肪、愉悦果香果香-冬青油味甜香、花香、蜂蜜-玫瑰、蜂蜜、花香果香、奶酪、花香--椰子、蜂蜡1.00±0.00 137.70±2.86 4.60±0.16 23.70±0.73 10.45±0.53 1.60±0.00 1.10±0.00 0.30±0.15 28.35±1.43 2.75±0.20 4.30±0.24 1.20±0.08 0.45±0.04 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87小计88 89 90 91 92 93 94小计95 96 97 98 99 100 101小计102 103 104 105 106小计107 108 109 110 111 112小计0.85±0.20 135.45±5.27 4.20±0.08 23.75±0.86 9.45±0.20 5.00±0.33 0.85±0.04-25.45±2.74 4.35±0.20 4.40±0.33 1.10±0.08 0.55±0.04-- - 醋味-- ---0.285 0.277 0.032 0.337 0.410 0.000 0.034 0.125 0.585 0.003 0.973 0.850 0.917 0.000 0.125 0.000酸类（7种）乙酸异丁酸3-甲基戊酸正己酸辛酸正癸酸月桂酸奶酪味生青味汗臭味奶酪味、酸腐味脂肪味金属味0.40±0.00 2 615.6±26.62 5.65±0.04 2.20±0.33 5.00±0.90 30.45±0.29 58.75±2.49 13.75±0.37 1.20±0.08 122.00±2.70 0.000 0.008 0.054 0.024 0.086 0.035 0.029正辛醛正壬醛癸醛苯甲醛十一醛β-环柠檬醛月桂醛化学味脂肪、柑橘、生青油脂、柑橘杏仁味花香果香、花香脂肪味2 767.5±6.70 4.65±0.12 3.60±0.08 7.70±0.73 40.75±1.43 73.40±4.41 13.05±2.08 0.85±0.37 149.3±4.90 0.25±0.13 14.85±0.45 3.60±0.00 15.40±0.49 0.80±0.00 141.80±1.71 4.75±0.20 25.50±1.88 9.35±1.35 4.55±0.45 1.05±0.12-29.20±5.47 5.70±0.82 4.35±0.61 1.20±0.33 0.50±0.25 0.40±0.08 0.25±0.13 0.60±0.00 2 823.1±364.4 32.55±1.02 3.40±0.41 5.90±0.98 38.35±4.61 71.80±8.74 17.55±1.10 1.75±0.20 171.30±15.02-2.90±1.45 6.60±1.31 13.95±0.29 1.05±0.29 0.10±0.05-24.6±0.41 0.60±0.30 28.85±1.18--醛类（7种）--5.90±0.33 29.30±1.14 0.95±0.12--0.125 0.000 0.019 0.000 0.002 0.125 0.000 0.60±0.08 34.7±1.06-2.70±0.73-0.60±0.00-3.30±0.00 36.15±1.59--酮类（5种）2,3-戊二酮乙偶姻甲基庚烯酮大马士酮（Z）-6-十五烯-2-酮奶油、焦糖味奶油味-玫瑰香、果香---0.15±0.12--0.125 0.000 0.125 0.000 0.013 0.45±0.20 29.90±0.29 0.20±0.10 0.30±0.15-0.20±0.10 0.15±0.12脂肪味-木头味——-萜烯类（6种）月桂烯（+）-柠檬烯α-柏木烯（E）-β-金合欢烯（Z）-β-金合欢烯顺式-茴香烯--茴香味0.10±0.05-0.10±0.05-0.10±0.05--0.125 0.125 0.125 0.296 0.125 0.000 0.80±0.65 0.20±0.10-1.30±0.00 1.50±0.16
续表
注：“-”表示未检出。
含量/（μg·L-1）空白对照组 菌株XJ25发酵酒样 菌株XJ25-ΔcitP 发酵酒样烷烃类（1种）种类 序号 化合物 香气特征[16-17，23-28] P 值1-甲氧基十一烷--芳——0.000其他类物质（5种）113小计114 115 116 117 118小计总计（S）-L-丙氨酸乙酰胺甘菊蓝间苯二甲醚1-甲基萘2-甲基萘香- - -28.15±3.39 4.75±1.02 1.35±0.12 2.35±0.20 1.50±0.00 38.10±3.02 4 013.15±35.56 1.45±0.12 1.45±0.12 26.35±0.86 6.85±2.82-1.65±0.45 1.50±0.08 36.35±3.02 4 080.8±437.40 23.20±3.18 8.70±0.24-1.60±0.16 1.40±0.16 34.90±3.10 4 357.45±114.43 0.263 0.154 0.000 0.082 0.579
图4 苹乳发酵后不同葡萄酒样中各类别挥发性风味成分含量占比
Fig.4 Proportions of various categories of volatile flavor components contents in different wine samples after malolactic fermentation
由图4可知，在苹乳发酵作用下，葡萄酒中酯类、醇类、酸类含量占比较高。与空白对照组酒样相比，菌株XJ25与菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样中醇类物质含量占比均显著升高（P＜0.05），而酯类和酸类物质含量占比均显著下降（P＜0.05）。值得注意的是，缺陷株XJ25-ΔcitP发酵酒样中酸类物质含量占比最低，表明citP基因的敲除在抑制挥发性酸类物质生成方面效果显著。同时，菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样的醇类和酯类物质总占比（95.54%）略高于菌株XJ25发酵酒样（94.57%）、空白对照组酒样（94.38%），意味着其在提升酒体主要风味骨架方面具有优势。结果表明，苹乳发酵显著改变了葡萄酒的挥发性风味成分构成，使其主要由醇类和酯类物质主导。而菌株XJ25-ΔcitP的应用，则是在此基础上进一步优化了风味特征，通过基因敲除实现了对挥发性酸类物质更有效的抑制，同时保持了较高的醇酯总占比，从而可能赋予葡萄酒更清爽、醇厚的风味。
2.3.2 关键差异挥发性风味化合物的筛选
以3种葡萄酒样中共检测出的118种挥发性风味成分含量作为因变量，不同酒样作为自变量进行OPLS-DA[29-31]，结果见图5。由图5可知，自变量拟合指数（R2X）为0.938，因变量拟合指数（R2Y）为1，模型预测指数（Q2）为0.995，R2和Q2均＞0.5，表示模型拟合结果可接受。经过200次置换检验，Q2回归线与纵轴的相交点＜0，说明模型不存在过拟合，模型验证有效，说明该模型可用于3组酒样挥发性风味物质差异的分析。
图5 苹乳发酵后不同酒样挥发性风味物质正交偏最小二乘-判别分析得分图(a)，载荷图(b)，置换检验结果(c)及变量重要性投影值(d）
Fig.5 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis score plot (a), loading plot (b), permutation test results (c) and variable importance in the projection values (d) of volatile flavor components in different wine samples after malolactic fermentation
由图5A可知，空白对照组酒样均分布在第四象限，菌株XJ25发酵酒样均分布在第三象限，菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样均分布在第二象限，各酒样能够很好的被区分开，说明空白对照组酒样、菌株XJ25发酵酒样与菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样的挥发性风味物质存在明显差异。结合图5B可知，大马士酮、4-甲基-2-戊醇、正庚醇等为空白对照组酒样的主要呈香物质；2-壬醇、乙酸、乙偶姻等为菌株XJ25发酵酒样的主要呈香物质；顺式-茴香烯、反式-2-己烯-1-醇、苯甲醛等为菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样的主要呈香物质。根据变量投影重要性（VIP）值＞1（图5D）及P＜0.05（表1）共筛选出53种差异挥发性风味物质，包括21种醇类、18种酯类、3种酸类、5种醛类、4种酮类、1种萜烯类、1种其他类物质。其中VIP值较高的物质为：苯甲醛（杏仁味）、顺式-茴香烯（茴香味）、反式-2-己烯-1-醇（生青味）。
为了探究菌株XJ25及其缺陷株XJ25-ΔcitP对葡萄酒样挥发性风味成分的影响，基于53种差异挥发性风味物质对不同葡萄酒样进行聚类分析[32]，结果见图6。
图6 基于53种差异挥发性风味物质苹乳发酵后不同葡萄酒样的聚类分析热图
Fig.6 Cluster analysis heatmap of different wine samples after malolactic fermentation based on 53 differential volatile flavor components
各化合物的序号与表1对应。
由图6可知，聚类结果可划分为A至F六个区域，各区域的挥发性风味物质在不同酒样中表现出显著的富集特征与独特的香气属性。A区包含乳酸乙酯、正壬醛、正庚醇等17种挥发性风味物质，主要在空白对照组酒样中显著富集，这些物质主要呈现果香、脂肪、柑橘和生青等特征。B区包含正己酸、2,3-丁二醇、4-甲基-1-戊醇等8种挥发性风味物质，在空白对照组酒样与菌株XJ25发酵酒样中均显著富集，其主要呈现汗臭味、黄油、奶酪和坚果味。C区包含苯乙醇、乙酸、乙偶姻等10种挥发性风味物质，主要在菌株XJ25发酵酒样中显著富集，其主要呈现玫瑰、蜂蜜、醋味和奶油味。D区包含甲酸庚酯、3-甲基-1-戊醇、癸醛等11种挥发性风味物质，在菌株XJ25发酵酒样与菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样中均显著富集，其主要呈现果香、花香、辛辣、青草香、油脂和柑橘等特征。E区包含2-甲基丁酸乙酯、（E）-3-己烯酸乙酯、反式-2-辛烯-1-醇等3种挥发性风味物质，在空白对照组酒样与菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样中均显著富集，其主要呈现果香和青香。F区包含2-甲基丁醇、苯甲醛、顺式-茴香烯、反式-2-己烯-1-醇等4种挥发性风味物质，在菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样中显著富集，其主要呈现果香、花香、杏仁味、茴香味和生青味。综上所述，与菌株XJ25发酵酒样相比，菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样中的刺激性气味更少。在柠檬酸代谢途径中，其代谢产物2,3-丁二醇富集于B区，乙酸和乙偶姻则富集于C区，且这两个区域中还包含其他多种具有刺激性气味的物质。结果表明，柠檬酸代谢途径很可能对这些具有刺激性气味的物质的生成产生了较大影响。
2.4 感官评价结果
苹乳发酵后不同葡萄酒样的感官评价结果见图7。由图7可知，与空白对照组酒样相比，菌株XJ25与XJ25-ΔcitP发酵酒样在感官品质上均有显著提升（P＜0.05）。具体而言，两种发酵酒样中的生青味显著降低（P＜0.05），而果香、花香、奶油和烘烤香则显著增强（P＜0.05）。相较于菌株XJ25发酵酒样中相对突出的刺激味与奶油味，菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样的风味整体更加协调，刺激味与奶油味被有效抑制，使得果香、花香和烘烤香得以更好地凸显，整体感官体验更为柔和愉悦。综上所述，菌株XJ25-ΔcitP发酵酒样不仅继承了菌株XJ25发酵酒样降低生青味的优点，还在果香、花香和烘烤香等正面香气上实现了超越，展现出更优的风味潜力。
图7 苹乳发酵后不同葡萄酒样感官评价香气轮廓图
Fig.7 Aroma profile diagram of sensory evaluation of different wine samples after malolactic fermentation
3 结论
本研究系统解析了植物乳植杆菌柠檬酸转运蛋白缺陷株XJ25-ΔcitP对葡萄酒苹乳发酵风味的影响机制。结果表明，XJ25-ΔcitP菌株在不依赖柠檬酸代谢途径的条件下仍可有效完成苹乳发酵过程，其代谢调控特性显著改善葡萄酒风味品质。与野生株XJ25发酵酒样相比，缺陷株发酵酒样总酸含量显著升高5.14%（P＜0.05），挥发酸、乙酸、乳酸及琥珀酸含量分别显著降低37.80%、41.65%、3.94%与8.97%（P＜0.05），同时保留81.56%的柠檬酸，赋予酒体清新口感。通过HS-SPME-GC-MS技术从葡萄酒样中共鉴定出118种挥发性成分，结合OPLS-DA与聚类分析筛选出苯甲醛、顺式-茴香烯及反式-2-己烯-1-醇等53种主要差异挥发性风味化合物（P＜0.05，VIP＞1）。感官评价结果显示，接种缺陷株XJ25-ΔcitP进行苹乳发酵，不仅降低了原酒的生青味，增加了果香、花香与烘烤香，还避免了野生株XJ25发酵后过重的奶油味与刺激味。该研究证实，通过靶向调控柠檬酸转运蛋白可精准抑制不良代谢产物生成，为葡萄酒品质改良提供了新型菌株资源与理论依据，对推动苹乳发酵工艺革新具有重要实践价值。
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