不同糯米、小米与高粱混合酿造白酒风味对比分析

摘要：为了探究不同原料对米混高粱酒的影响，将糯米、红糯米和小米分别与高粱1∶1混合，以传统酱香型白酒的工艺酿制米混高粱白酒。利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）解析3种米混高粱白酒中的挥发性风味物质和代谢物，并对结果进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）。结果显示，3种白酒中共检出91种挥发性风味物质，基于变量重要性投影值（VIP）＞1.0和P＜0.05，筛选出48种显著差异挥发性风味物质，主要有月桂酸乙酯、癸酸乙酯和糠醛等；筛选出125种显著差异代谢物，主要物质有牛磺酸、β-丙氨酸、天冬门氨酸和谷氨酸等。聚类分析（CA）结果表明，小米高粱混合酒和红糯米高粱混合酒被聚为一类，糯米高粱混合酒单独为一类。

引文格式：陈诺，母应春，苏伟，等.不同糯米、小米与高粱混合酿造白酒风味对比分析[J].中国酿造，2025，44（1）：35-43.

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31860441）；黔科合服企[2020]4009（006）

作者简介：陈诺（2000-），女，硕士研究生，研究方向为食品加工与安全。

*通讯作者：母应春（1974-），女，正高级实验师，硕士，研究方向为食品微生物。

Comparative analysis of flavor of Baijiu brewed by different glutinous rice and millet mixed with sorghum

CHEN Nuo,MU Yingchun*,SU Wei,QI Qi,LIN Caixia
(School of Wine Making and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Abstract：In order to investigate the effects of different raw materials on a Baijiu brewed with different glutinous rice and millet mixed with sorghum,the glutinous rice,red glutinous rice and millet were mixed with sorghum in a 1∶1 ratio,respectively,and the Baijiu was brewed by the traditional process of sauce-flavor(Jiangxiangxing)Baijiu.The volatile flavor compounds and metabolites in the Baijiu were analyzed by headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME-GC-MS)and liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS),which results were subjected to principal component analysis(PCA)and partial least squares-discriminant analysis(PLS-DA).The results showed that a total of 91 volatile flavor components were identified,48 significantly different volatile flavor substances,mainly ethyl laurate,ethyl caprate and furfural,etc.were screened out based on the variable importance projection(VIP)value＞1.0 and P＜0.05.A total of 125 significantly different metabolites were screened out,with taurine, β-alanine,aspartate and glutamic acid as the main substances.The results of cluster analysis(CA)showed that the millet and sorghum Baijiu and the red glutinous rice and sorghum Baijiu were grouped into one category,and the glutinous rice and sorghum Baijiu was grouped into one category alone.

酱香型是中国白酒主要香型之一，具有酱香突出，香气细腻，口感醇厚，留香持久的典型风格特征[1]。传统的酱香型白酒多以糯性高粱为原料，糯性高粱中具有较高的支链淀粉，在蒸粮时更容易吸水膨胀，被糊化，更容易被微生物分解利用[2]。为了丰富酱香型白酒原料的多样性，挑选同样富含高支链淀粉的糯米[3]、小米[4]，将糯米、红糯米、小米与高粱1∶1混合为原料，用传统的酱香型白酒工艺生产白酒，这样制成的白酒既有米酒口味香甜醇美、柔和协调[5]的特色，也含有酱酒酱香突出，口感醇厚的特点，深受消费者喜爱。

酿酒原料是决定白酒质量和产量的重要因素，由于原料本身组成成分不同，微生物发酵后产生的风味物质在种类及含量上也存在差异[6-7]。陈彬等[8]选用5种不同粮食酿造清香型白酒，得出不同种类的粮食可为白酒提供不同类型的风味。闫涵等[9]比较了单粮和多粮型白酒酿造过程中的风味组成，发现单粮酒醅中含有更多的酸类和酚类物质，多粮酒醅中则生成更多醇类和含氮化合物。沈馨等[10]比较了大米、籼糯米和粳糯米酿造黄酒的品质，得出原料种类对黄酒的滋味品质有显著的影响。

白酒风味由各种物质如酯类、醇类、酸类、醛类、含氮化合物、硫化合物等风味化合物构成[11]。曾庆军等[12]探究了赤水河流域五个不同产区代表性的52个样品酱香型白酒，最终确定了19个对贵州不同产区风味物质差异具有贡献的物质。骆茂香等[13]分析了一到七轮次及综合基酒中的非挥发性有机酸类及酚酸物质，检出18种非挥发性风味物质。目前大多数酱香白酒风味已经得到有效研究，但糯米、小米和高粱混合制备白酒的风味研究鲜有报道，因此本研究以不同品种米与高粱（1∶1）混合原料酿造白酒为研究对象，利用顶空固相微萃取-气相色谱/质谱联用技术（headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME/GC-MS）和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术分析糯米和高粱混合酒、红糯米和高粱混合酒、小米和高粱混合酒的风味成分，结合主成分分析（principle componentanalysis，PCA）和偏最小二乘法-判别分析（partialleast squares-discriminant analysis，PLS-DA）模型分析和变量重要性投影值（variable importance projection，VIP）解析三种白酒的风味差异，为糯米、小米与高粱混合酿造白酒的风味研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3种不同原料成品酒（53%vol）：贵州省仁怀市茅台镇某酒厂；糯米和高粱混合白酒（糯米∶高粱=1∶1）、小米和高粱混合白酒（小米∶高粱=1∶1）及红糯米和高粱混合白酒（红糯米∶高粱=1∶1）：分别记为NMJ、XMJ和HNMJ，3种白酒由同一工厂采用相同的酿造工艺酿造而成。

环己酮（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇、甲酸、醋酸铵（均为色谱纯）：美国Thermo Fisher公司。

1.2 仪器与设备

Trace 1300-TSQ 8000顶空微萃取-气相色谱-质谱联用仪、Vanquish UHPLC色谱仪、Q ExactiveTM HF-X质谱仪、Hypesil Gold C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）：美国赛默飞世尔科技公司；DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）：安捷伦科技（中国）有限公司；D3024R低温离心机：美国Scilogex公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME/GC-MS分析条件

HS-SPME提取条件：称取1 mL样品放入20 mL的顶空瓶内，加入2.00 g氯化钠和7 mL的纯净水，再加入10 μL环己酮（20 μg/mL）作为内标物，并用聚四氟乙烯隔膜紧密覆盖。使用已老化的50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS萃取头在40 ℃下振摇并提取180 min。提取完成后，立即将SPME纤维插入进样端口，并在230 ℃下解吸分离5 min[14]。

气相色谱条件：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），高纯氦气（99.999%）为载气，流速为1.0 mL/min，无分流模式。升温程序：在40 ℃下保持5 min，然后以5 ℃/min的速率上升到150 ℃，保持3 min，最后以5 ℃/min的速率升至240 ℃，保持5 min。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，传输线温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，在50～450 amu的范围内采集数据，速率为1 scan/s[14]。

定性定量方法：数据采集后与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）数据库对比，保留匹配度＞800的化合物；采用内标法对挥发性代谢物进行半定量。

1.3.2 LC-MS/MS分析条件

样品前处理：取100 μL样本置于EP管中，加入400 μL的80%甲醇水溶液；涡旋振荡，冰浴静置5 min，15 000×g、4℃离心20min；取一定量的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为53%；15 000×g、4 ℃离心20 min，收集上清液，进样LC-MS进行分析。

液相色谱条件：HypesilGoldC18色谱柱；柱温40℃；流速：0.2 mL/min；正模式：流动相A：0.1%甲酸；流动相B：甲醇；负离子模式：流动相A：5 mmol/L醋酸铵，pH 9.0，流动相B：甲醇。色谱梯度洗脱程序：0～1.5 min，98%A、2%B；1.5～3 min，98%～15%A、2%～85%B；3～10 min，15%～0%A、85%～100%B；10～10.1 min，0%～98% A、100%～2% B；10.1～12 min，98%A、2%B。

质谱条件：扫描范围：100～1 500 m/z；电喷雾电离（electro-spray ionization，ESI）源；喷雾电压：3.5 kV；鞘气流速：35 L/min；辅助气流速：10 L/min；离子传输管温度：320 ℃；辅助气加热器温度：350 ℃；MS/MS二级扫描为数据依赖性扫描（data-dependent scans）。

代谢物鉴定：将下机数据文件导入CD3.1搜库软件中进行处理，根据质量偏差5 ppm、信号强度偏差30%、信噪比3、最小信号强度、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，用blank样本去除背景离子，将原始定量结果依据公式：样本原始定量值/（样本代谢物定量值总和/质量控制（quality control，QC）样本代谢物定量值总和），进行标准化处理，得到相对峰面积；并将QC样本中相对峰面积的变异系数（coefficient of variation，CV）大于30%的化合物删除，最后得到代谢物的鉴定和相对定量结果。

利用SPSS 26.0对数据进行方差分析，采用单因素方差分析确定差异显著性（P＜0.05），数据用“平均值±标准差”来表示。使用TBtools 2.147和SPSS 25.0软件绘制热图，SIMCA 14.1软件进行主成分分析和偏最小二乘法判别分析模型分析，数据绘图使用Origin 2022。维恩图绘图使用https：//www.chiplot.online/网站绘制。

2 结果与分析

2.1 3种白酒中挥发性风味物质分析

2.1.1 挥发性风味物质组成

不同糯米、小米分别与高粱混合酿造白酒的挥发性风味物质的含量测定结果见表1。由表1可知，在相同分析条件下，3种白酒挥发性风味物质的组成及含量存在一定差异。3种白酒中共检出91种挥发性风味物质，NMJ、HNMJ和XMJ中分别检测出挥发性风味物质69种、62种及67种，含量依次为5 043.44 μg/kg、5 453.32 μg/kg和6 653.04 μg/kg。XMJ和HNMJ中酯类和醛类含量较高，NMJ中醇类、酸类和酚类含量较高，3种白酒中酮类物质含量差异不大，醋酸仅在NMJ中检测到，这与前人的研究结果一致，醋酸是以糯米为原料的酒的唯一检测出的挥发性酸[16]。酯类在3种白酒的挥发性风味物质中占据主导地位，这与唐平等[17]的研究结果一致。

酯类物质是白酒中花香和果香的主要来源，对酒风味的典型性有重要影响。由表1可知，辛二酸二乙酯和癸酸异戊酯是NMJ中独有的酯类物质，NMJ中含量较高的酯类有月桂酸乙酯（300.86 μg/kg）、癸酸乙酯（324.65 μg/kg）和乙酸苯乙酯（481.18 μg/kg）。月桂酸乙酯、苯乙酸乙酯、正己酸乙酯是HNMJ和XMJ中主要的酯类物质，含量分别是373.28 μg/kg、199.79 μg/kg、138.96 μg/kg和723.55 μg/kg、233.78 μg/kg、242.70 μg/kg。酯类主要由葡萄糖和氨基酸产生的醇和酸的酯酶催化反应产生[18]，但也有一部分来源于原料中的脂肪，例如月桂酸乙酯是脂肪氧化产生的月桂酸与乙醇酯化生成的高级脂肪酸乙酯[18]。XMJ中的月桂酸乙酯含量远远高于NMJ和HNMJ，因为原料中的脂肪含量小米＞糯米＞红糯米[19-21]。YANG Q等[22]研究发现，增加大豆味酒中脂肪的含量可以促进酯类物质的产生，增加总酯含量。其它含量较低的酯类物质丰富白酒的香气和口感，癸酸异戊酯产生菠萝、香蕉、甜水果味[23]；丁二酸二乙酯主要由苹果酸乳酸发酵产生[24]，赋予酒体酒香、苹果香和花香[25]；癸酸乙酯具有脂肪香，醋香和白兰地酒香[26]；乙酸苯乙酯则呈现浓郁的玫瑰花香和蜜甜香气。

醇类物质是白酒中醇香味和助香剂的重要来源，也是酯类物质的前驱物质[27]。由表1可知，苯乙醇仅在NMJ中检测到，相对含量最高的醇类物质（460.22 μg/kg），是苯丙氨酸在芳香族氨基酸的转氨和苯丙酮酸脱羧酶的脱羧反应下生成[28]。聂元皓等[29]通过比较5种不同原料的白酒中苯丙氨酸含量，发现以糯米原料为底物进行发酵时苯丙氨酸含量要远高于其他原料。且苯乙醇在以往的研究中已被确定为糯米酒中重要的香气化合物[30]，赋予酒体强烈果香和玫瑰香[31]。XMJ和HNMJ中含量较高的醇类则是正己醇，分别是95.16 μg/kg和33.11 μg/kg。正己醇是由蛋白质分解产生的氨基酸通过降解代谢途径或者糖代谢合成途径产生[32]。有研究发现，原料中的蛋白质含量和天然氨基酸是影响酒中高级醇含量的主要因素[33]，小米是3种米中的蛋白质含量最高的，为14.3%，因此XMJ中的正己醇含量远高于其他两种酒。

醛酮类物质在白酒中起到助香呈味的作用，协调香气的释放[34]。由表1可知，糠醛存在于3种酒中且相对含量较高，苯甲醛则仅在XMJ和HNMJ中相对含量较高。这与ZHOU C等[35]的研究结论一致，发现苯甲醛和糠醛对小米酒风味有巨大贡献。苯甲醛由苯甲醇氧化形成，也可由微生物对芳香族氨基酸或苯基乙酸和对羟基苯甲酸底物的活性形成[36]，是XMJ和HNMJ中杏仁香和焦糖香的主要来源[37]。糠醛具有焦香、杏仁味，其闻香强度在呋喃类化合物中最高[38]，由多缩戊糖或戊糖在酸性高温条件下转化形成[39]。同时糠醛也被证实对酱酒风味有巨大贡献[40]。

运用Upset图对3种白酒中挥发性风味物质的重叠情况进行可视化，结果见图1。

将在3种米混高粱白酒中共同存在的物质定义为“骨架成分”，仅在某一种白酒中存在的物质定义为“特征性成分”[41]。结果表明，3种白酒中共鉴定出44种“骨架成分”，包括酯类23种、醇类10种、酮类2种、醛类2种、脂肪酸类3种、烷烃类2种、酚类及其他类化合物各1种。NMJ中的“特征性成分”最多，有20种，以苯乙醇含量最高[（460.22±20.42）μg/kg]；其次是XMJ 6种，以肉豆蔻脑酸甲酯含量最高[（18.72±4.09）μg/kg]，最后是HNMJ仅有1种为乙酸丁酯[（6.40±1.36）μg/kg]。乔世玉等[42]探究了贵州不同地区的糯米酒风味差异，鉴定出苯乙醇是糯米酒中的主要醇类物质。胡晶红等[43]利用气相色谱质谱在马皮脂肪中鉴定到了肉豆蔻脑酸甲酯，但是在酒中对风味的贡献还未有报道。综上，不同原料的米混高粱酒的挥发性风味物质在组成上存在差异。

2.1.2 基于挥发性风味物质不同糯米、小米与高粱混合酿造白酒的主成分分析及偏最小二乘-判别分析

利用主成分分析和偏最小二乘法判别分析判定3种酒间挥发性风味物质是否存在差异。由图2a可知，在95%置信区间内，PC1和PC2方差贡献率分别为70.4%和21.2%的信息，两主成分方差贡献率之和大于90%，表明两个主成分能较好地代表样品中的风味特征[44]。从图2a中可以直观看出XMJ和HNMJ同时位于主坐标轴右侧，NMJ单独位于左侧分布，且3组样品之间能通过PCA进行明显区分。R2X和R2Y表示模型对X和Y的解释率，Q2Y表示模型的预测能力[45]。由图2b可知，PLS-DA模型显示，所有R2X、R2Y和Q2Y大于0.90，表明模型中的这些样本具有良好的辨别力和可预测性[46]，XMJ和HNMJ位于一侧，NMJ单独位于一侧，表明PLS-DA能有效区别3种白酒。

2.1.3 差异挥发性组分的聚类分析

VIP值反映了变量对模型的整体拟合度和分类能力的贡献大小，一般认为VIP＞1的变量对模型特别重要，P值是衡量观察到的数据与原假设一致性的概率值，其值＜0.05时，通常意味着处理组与对照组之间存在显著性差异[47]。基于VIP＞1和P＜0.05共筛选出48种差异挥发性风味化合物，包括酯类17种、醇类12种、酮类4种、醛类4种、有机酸类6种，酚类1种及其他类化合物4种。利用聚类分析热图探究这48种主要显著差异挥发性风味物质在3种酒中的分布规律和含量差异，结果见图3。

由图3可知，不同原料对米混高粱白酒中挥发性风味物质有一定的影响。XMJ的风味物质种类和含量最高，HNMJ次之，最后是NMJ。NMJ中主要的风味物质有月桂酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、正癸酸、月桂酸和糠醛；HNMJ中主要的风味物质有月桂酸乙酯、苯乙酸乙酯、正己酸乙酯、正癸酸、糠醛和苯甲醛；而XMJ中主要的风味物质有月桂酸乙酯、苯乙酸乙酯、正己酸乙酯、正己醇、正癸酸、糠醛和苯甲醛。通过风味物质和聚类分析，可以进一步判断HNMJ和XMJ两种酒样风味更加相似，与NMJ有一定的差异。

2.2 3种米混高粱酒代谢物组成分析

2.2.1 差异代谢物的筛选

利用非靶向代谢组学技术分析酒中的代谢物组成。通过对原始数据的标准化和筛选，鉴定出364种主要代谢物，其代谢物分析结果见图4。364种主要代谢物可以分为8个大类（图4a），脂质及其衍生物是3种米混高粱酒中主要代谢产物，分别是NMJ（91.5%）、HNMJ（93.2%）和XMJ（89.7%）。唐佳代等[47]利用非靶向组学探究酱香型白酒原料中的代谢物组成，发现脂质是主要的代谢产物，与该研究结果一致。由图4b和4c可知，3种米混高粱酒的代谢物可以通过PCA和PLS-DA分离，样品间存在明显差异。

2.2.2 差异代谢物的聚类分析

基于VIP＞1.0和P＜0.05共筛选注释出125种显著差异代谢物质，在相对含量前40的代谢物中，氨基酸及其衍生物、有机酸及其衍生物、脂肪酸及其衍生物和核苷酸及其衍生物是影响3种白酒滋味的主要代谢物。利用聚类分析对相对含量较高的前40种代谢物进行可视化分析，结果见图5。

由图5可知，NMJ中的氨基酸及其衍生物、有机酸及其衍生物、脂肪酸及其衍生物明显高于XMJ和HNMJ，核苷酸及其衍生物则与之相反。氨基酸本身能呈现出甜、鲜、苦等味道，对白酒口感及香气有重要影响[48]。小米、糯米和红糯米的蛋白质含量略有差异，导致酒样中的游离氨基酸也存在差异[49]。谷氨酸、氨基颉草酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、L-叔亮氨酸、蛋氨酸、L-犬尿氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸、L-脯氨酸和氨基戊二酸在NMJ中的含量均高于其余两个酒样，HNMJ中只有天冬门氨酸高于其余两个酒样。牛磺酸和β-丙氨酸在3种米混高粱白酒中也有较高的相对含量。牛磺酸和β-丙氨酸都是非蛋白质氨基酸[50-51]，在缓解疲劳，改善身体机能和抗焦虑等方面有巨大贡献[52-53]。此外，氨基酸与某些风味物质的形成有关，如谷氨酸可与2,3-丁二醇生成香味物质四甲基吡嗪[54]；亮氨酸参与异戊二醇和乙酸盐的合成[55]。

有机酸类及其衍生物不仅对白酒的香气以及口感有着重要作用，同时也是白酒中酯类物质香气的前体[56]。在三种酒中共有14种有机酸，其中在三种酒中相对含量最高的是乙酰磷酸，其次是丁二酸。乙酰磷酸是磷酸与乙酸的混合酸酐，高能磷酸酯之一，能分解成乙酸和磷酸。乙酸具有奶酪味和甜味，是酱香型白酒中的主要有机酸[57]。丁二酸具有酸味和咸苦味[58]，参与酒味形成，在陈酿阶段有助于形成更丰富的酯类物质[59]。

综上，3种白酒代谢物种类差异较小，代谢物中以脂质及其衍生物为主。3种白酒中的主要代谢物是牛磺酸、β-丙氨酸、天冬门氨基酸、乙酰磷酸、丁二酸、十一烷酸和水杨醛。通过聚类分析可以看出，XMJ和HXMJ被聚为一类，NMJ单独为一类，与挥发性风味结果一致。

3 结论

为了探究不同原料的米混高粱酒的风味差异，利用HS-SPME/GC-MS和LC-MS/MS技术分析NMJ、HNMJ和XMJ在挥发性风味和代谢物的成分和相对含量差异。通过HS-SPME/GC-MS技术并基于VIP＞1.0和P＜0.05共筛选出48种差异挥发性风味化合物，XMJ的风味物质种类和相对含量是最高的，HNMJ次之，最后是NMJ。月桂酸乙酯、苯乙酸乙酯、正己酸乙酯、正癸酸、糠醛是3种酒中主要的挥发性风味物质。通过聚类分析发现，HNMJ和XMJ被聚为一类，NMJ单独一类。利用LC-MS/MS技术并基于VIP＞1.0和P＜0.05共鉴定出125种显著差异代谢物，3种白酒中的主要代谢产物是脂质及其衍生物，主要代谢物有牛磺酸、β-丙氨酸、天冬门氨酸、谷氨酸和乙酰磷酸。聚类分析结果与挥发性风味物质一致。

综上，NMJ的风味物质成分和含量与XMJ和HNMJ差异较大，而代谢物成分差异较小，含量略有差异。XMJ和HNMJ的风味物和代谢物在成分和含量上都更加相似。本研究为米混高粱酒的风味提供了理论支持，后续将进一步对米混高粱酒风味形成机制做进一步研究和分析。

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