表1 低次烟叶混菌固态发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for mixed solid-state fermentation process optimization of lowgrade tobacco leaves
水平 A 混菌比例 B 发酵温度/℃ C 接种量/%-1 0 1 1∶1 2∶1 5∶1 30 33 36 16 20 24
Optimization of solid-state fermentation process for low-grade tobacco leaves by mixed strains of Bacillus amyloliquefaciens and Saccharomyces cerevisiae
随着人们消费水平的提高，对中高端卷烟的需求量不断增大，卷烟生产企业对优质烟叶的需求量也日益增加。烟叶是一种农产品，其品质受多种因素影响，每年都会生产出25%的低次烟叶，这些烟叶很难用于烟叶配方，这不仅造成了资源浪费，也占用了大量的仓储空间[1]。因此，提高低次烟叶品质以及利用率是烟草行业亟待解决的问题[1-2]。
发酵是改善烟叶吸食品质的重要技术手段。近年来，关于单一菌株应用于烟叶发酵的报道[3-9]已有很多，但针对混合菌株协同发酵烟叶的研究较少。研究表明，混菌发酵的烟叶品质比单菌发酵效果更好，如EDUARDO R B等[10]将阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii）和解淀粉类芽孢杆菌（Paenibacillus amylolyticus）协同发酵烟叶，结果发现烟叶中的香气化合物β-紫罗兰醇和β-紫罗兰酮含量明显增加；薛磊等[11]将功能菌株组合为复合微生物喷施到烟丝进行发酵，结果发现发酵样的烟气更细腻、杂气和刺激性均降低、香味物质含量明显增加；WEN C等[12]利用分别具有降解淀粉和蛋白能力的菌株混菌发酵烟叶，结果发现经混菌发酵的烟叶甜度增加，香气更醇厚，具有独特风味；WU X Y等[13]将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）与高斯芽孢杆菌（Bacillus kochii）共同培养制作成发酵剂进行固态发酵，并与单一菌株发酵结果进行对比，结果发现混菌发酵后烤烟中的美拉德反应产物和萜类代谢物的含量明显增加、香气柔和、刺激性减小。目前，关于混合菌株发酵烟叶的研究中的菌株多数为细菌，少数为酵母，应用细菌与酵母混合发酵的研究更是鲜见报道。
解淀粉芽孢杆菌能够降解淀粉大分子物质，产生还原糖，提高烟叶香气物质含量及烟叶感官品质，还具有降焦减害的作用[13-16]；酵母菌是主要的产香微生物，可利用多种基质产生丰富的香味物质，在烟草中也应用较为广泛[17-21]。本研究尝试以解淀粉芽孢杆菌JL-4与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）PY-1混菌固态发酵低次烟叶，以挥发性致香成分含量为评价指标[22]，通过单因素试验和正交优化试验优化其发酵工艺条件，以期改善低次烟叶普遍存在的刺激性较大、香气不足等问题，为混菌发酵提高低次烟叶品质提供参考。
1.1.1 材料与菌株
低次烟叶：吉林中烟工业有限责任公司提供的复烤烟叶。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）PY-1、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JL-4：郑州轻工业大学烟草生物技术实验室分离筛选。
1.1.2 试剂
无水硫酸钠、氯化钙、无水乙醇、氢氧化钠、聚氧乙烯月桂醚、冰乙酸、葡萄糖（均为分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；对羟基苯甲酸酰肼（分析纯）、支链淀粉（纯度＞99.8%）、直链淀粉（纯度＞99.8%）：上海源叶生物科技有限公司；重铬酸钾（分析纯）：天津市德恩化学试剂有限公司；高氯酸（分析纯）：天津政成化学制品有限公司；盐酸（分析纯）：郑州翼增生物科技有限公司；二氯甲烷（色谱纯）：天津市致远化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
LB液体培养基[9]：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基[23]：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
DLSB-5/20C低温冷却液循环泵：郑州长城科工贸有限公司；HZQ-211C落地恒温振荡器、DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；7890B-5975B气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：美国Agilent公司；烟叶固态发酵反应舱[24]：郑州轻工业大学烟草生物技术实验室自主研发；G3砂芯烧结玻璃漏斗：泰玻玻璃股份有限公司；SB-3200DT超声波清洗机：宁波新芝生物科技有限公司；AA3连续流动分析仪：水尔分析仪器（上海）有限公司；400Y多功能粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司。
1.3.1 低次烟叶的混菌固态发酵工艺
采用接种针挑取解淀粉芽孢杆菌JL-4与酿酒酵母PY-1分别接种至100 mL LB液体培养基与YPD培养基，分别在37 ℃、180 r/min和30 ℃、180 r/min条件下培养24 h，得到种子液。将种子液在4 ℃、4 000 r/min条件下离心15 min，弃上清，添加适量无菌水制备成菌体浓度为1×108 CFU/mL的菌悬液。按照20%的接种量将菌悬液（解淀粉芽孢杆菌JL-4∶酿酒酵母PY-1菌悬液=1∶1）接种于低次烟叶中，33 ℃条件下发酵48 h。以同等条件下喷施等量的无菌水、解淀粉芽孢杆菌JL-4菌悬液、酿酒酵母PY-1菌悬液为对照。
1.3.2 低次烟叶混菌固态发酵工艺优化
（1）单因素试验
在方法1.3.1的基础上，分别考察混菌比例（解淀粉芽孢杆菌JL-4∶酿酒酵母PY-1）（0∶1、1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、1∶0）、发酵温度（27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃）及接种量（8%、12%、16%、20%、24%）对低次烟叶挥发性致香成分含量的影响。
（2）正交试验
在单因素试验的基础上，选取混菌比例（A）、发酵温度（B）、接种量（C）3个因素为考察因素，以挥发性致香成分含量为评价指标，采用3因素3水平的L9（33）正交表设计正交试验优化低次烟叶混菌固态发酵工艺条件，试验因素与水平见表1。
表1 低次烟叶混菌固态发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for mixed solid-state fermentation process optimization of lowgrade tobacco leaves
水平 A 混菌比例 B 发酵温度/℃ C 接种量/%-1 0 1 1∶1 2∶1 5∶1 30 33 36 16 20 24
1.3.3 挥发性致香成分分析
采用同时蒸馏萃取法结合GC-MS法测定低次烟叶中的挥发性致香成分[20]。
样品前处理：将发酵前、后的低次烟叶在40 ℃条件下烘干，粉碎后过40目筛，准确称取25 g发酵前（后）低次烟叶粉末样品、30 g氯化钠和200 mL去离子水放入同时蒸馏萃取装置一端的500 mL圆底烧瓶中，装置另一端放入60 mL二氯甲烷，在60 ℃条件下水浴加热，同时蒸馏萃取150 min。萃取完成后，二氯甲烷萃取液用无水硫酸钠干燥，4 ℃条件下静置过夜，用滤纸过滤，加入1 mL的内标物（0.2 g/L二氯甲烷溶液），将萃取液在60 ℃水浴加热浓缩，用二氯甲烷定容至1 mL，过0.22 μm滤膜于2.0 mL的色谱瓶中，立即进行上机检测。
GC条件：HP-5MS毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为280 ℃；载气为高纯氦气（He）；升温程序为起始温度50 ℃保持1 min，以4 ℃/min升至148 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至172 ℃保持1 min，以4 ℃/min升至280 ℃保持5 min；分流比为5∶1；流速为3.0 mL/min。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV；质量扫描范围为35～550 amu。
定性、定量分析：采用美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）14谱库检索定性；采用内标法进行定量分析。
1.3.4 理化指标的测定
淀粉含量的测定：参考烟草行业标准YC/T 216—2013《烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法》[25]；总糖、还原糖含量的测定：参考YC/T 159—2019《烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》[26]。
1.3.5 感官评吸
由7人组成的专业评吸小组，根据YC/T 138—1998《烟草及烟草制品感官评价方法》[27]中的方法对烟叶进行感官评吸。
1.3.6 数据处理
每个试验重复测定3次，采用Excel 2016、Origin 2022以及SPSS 22.0对试验数据进行处理和分析，结果以“平均值±标准差”表示。
2.1.1 混菌比例对低次烟叶挥发性致香成分含量的影响
混菌比例对低次烟叶挥发性致香成分含量的影响见图1。由图1可知，解淀粉芽孢杆菌JL-4与酿酒酵母PY-1单菌株发酵的低次烟叶中挥发性致香成分含量分别为514.08 μg/g、505.56 μg/g。随着混菌比例的变化，挥发性致香成分的含量呈先升高后下降的趋势，当混菌比例为2∶1时，发酵后低次烟叶中的挥发性致香成分含量最高，达到559.67 μg/g，分析原因可能是，其中一种菌株含量较多时会抑制另一种菌的生长，只有混合菌株比例协调时，才能共同发挥各自的优点[28]。综合考虑，确定最佳混菌比例为2∶1。
图1 混菌比例对低次烟叶挥发性致香成分含量的影响
Fig.1 Effect of mixed strains ratio on volatile aromatic components content in low-grade tobacco leaves
2.1.2 发酵温度对低次烟叶挥发性致香成分含量的影响
发酵温度对低次烟叶挥发性致香成分含量的影响见图2。由图2可知，随着发酵温度的升高，挥发性致香成分的含量呈先升高后下降的趋势，当发酵温度达到33 ℃时，低次烟叶中的挥发性致香成分含量达到最高，为553.23 μg/g。分析原因可能是，发酵温度过低，菌株活性不足，影响菌体生长，随着发酵温度的升高，菌株新陈代谢速度逐渐加快[29-30]，发酵后低次烟叶中的挥发性致香成分含量逐渐升高；但发酵温度过高时，微生物代谢能力受到抑制，从而影响菌株发酵效果[31]。综合考虑，确定最佳发酵温度为33 ℃。
图2 发酵温度对低次烟叶挥发性致香成分含量的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on volatile aromatic components content in low-grade tobacco leaves
2.1.3 接种量对低次烟叶挥发性致香成分含量的影响
接种量对低次烟叶挥发性致香成分含量的影响见图3。由图3可知，随着接种量的升高，挥发性致香成分的含量呈先升高后下降的趋势，当接种量为20%时，低次烟叶中的挥发性致香成分含量最高，达到553.31 μg/g。分析原因可能是，接种量较低时，菌株生长缓慢，发挥作用时间较长[29]；接种量过高时，菌株生长速度过快，菌群数量过多，影响烟叶本身微生物群落及代谢[20]。综合考虑，确定最佳接种量为20%。
图3 接种量对低次烟叶挥发性致香成分含量的影响
Fig.3 Effect of inoculum on volatile aromatic components content in low-grade tobacco leaves
在单因素试验的基础上，选取混菌比例（A）、发酵温度（B）、接种量（C）3个因素为考察因素，以挥发性致香成分含量为评价指标，采用3因素3水平的L9（33）正交表设计正交试验优化低次烟叶混菌固态发酵工艺条件，结果与分析见表2，方差分析见表3。
表2 低次烟叶混菌固态发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for mixed solid-state fermentation process optimization of low-grade tobacco leaves
试验号 A 混菌比例 B 发酵温度/℃C 接种量/%挥发性致香成分含量/（μg·g-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 518.28±1.21 552.13±2.25 522.68±1.19 538.26±2.07 565.47±1.25 518.39±1.86 515.52±1.23 520.33±1.99 512.37±1.52 K2 K3 k1 k2 k3极差R 1∶1 1∶1 1∶1 2∶1 2∶1 2∶1 5∶1 5∶1 5∶1 1 593.09 1 622.12 1 548.22 531.03 540.71 516.07 24.63 30 33 36 30 33 36 30 33 36 1 572.06 1 637.93 1 553.44 524.02 545.98 517.81 28.16 16 20 24 20 24 16 24 16 20 1 557.00 1 602.76 1 603.67 519.00 534.25 534.56 15.56
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
因素 离差平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABC误差452.116 462.070 656.896 237.383 19.160 23.597 24.116 34.285 12.389 0.041 0.040 0.028 0.075***合计2 712.698 924.141 1 313.791 474.766 38.320 2 751.018 622228
由表2可知，通过极差R分析可知，对低次烟叶中挥发性致香成分含量影响的主次顺序为B＞A＞C，即发酵温度＞混菌比例＞接种量。通过k值可知，低次烟叶的最佳混菌固态发酵条件组合为A2B2C3，即混菌比例（JL-4∶PY-1）2∶1、发酵温度33 ℃、接种量24%，在此条件下，低次烟叶中的挥发性致香成分含量最高，达到565.47 μg/g。因此，确定低次烟叶的最佳固态发酵条件为混菌比例（JL-4∶PY-1）2∶1、发酵温度33 ℃、接种量24%。
由表3可知，混菌比例、发酵温度对挥发性致香成分含量影响显著（P＜0.05），而接种量对挥发性致香成分含量的影响不显著（P＞0.05）。
采用同时蒸馏萃取技术结合GC-MS从4种固态发酵低次烟叶样品中共检出218种挥发性致香成分，包括32种醇类、59种醛酮类、13种酸类、19种酯类、49种烯烃类、15种杂环类、9种酚类和22种其他类。其中，菌株JL-4与PY-1混菌固态发酵的低次烟叶中检出14种特有挥发性物质，包括二十六碳醇、5-羟甲基糠醛、异植物醇、巴伦西亚橘烯、母菊兰烯、β-石竹烯、3,4-二甲基茴香醚、4-乙氧基苯甲醛、2-甲基二十四（碳）烷、β-榄香烯、3,7,7-三甲基双环[4.1.0]庚烯、全反-2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-廿四碳六烯、2,3-二氢-1,1,5,6-四甲基-1H-茚、2,3,6-三甲基-1,4-萘醌。不同固态发酵低次烟叶样品中挥发性致香成分的总含量具有显著差异（P＜0.05），其中，混菌固态发酵低次烟叶中的挥发性致香物质总含量最高，为565.47 μg/g，相较于无菌水、菌株JL-4和菌株PY-1固态发酵低次烟叶分别提高了30.44%、9.94%、12.42%。4种固态发酵低次烟叶样品中的主要挥发性致香成分[32-34]见表4。
表4 固态发酵后低次烟叶中主要挥发性致香成分含量GC-MS分析结果
Table 4 Results of main volatile aromatic components contents in low-grade tobacco leaves after solid-state fermentation analyzed by GC-MS μg/g
序号 种类 化合物 无菌水固态发酵低次烟叶1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0醇类11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 3-呋喃甲醇苯甲醇芳樟醇苯乙醇α-松油醇（1S,2E,4R,7E,11E）-2，7,11-西柏三烯-4-醇2-甲基-1-苯基-1-丁醇3,5-二甲基苯甲醇木香醇香叶基香叶醇香茅醇植物醇糠醇γ-谷甾醇环己醇镰叶芹醇金合欢醇异植物醇总计4,7,9-巨豆三烯-3-酮醛酮类糠醛5-羟甲基糠醛大马士酮香叶基丙酮螺岩兰草酮苯乙醛β-紫罗酮2.63±0.12c 2.20±0.19c 1.02±0.20b 2.15±0.19b 0.57±0.04c 1.53±0.13d-6.75±0.26b-1.09±0.08c 0.59±0.03a 0.22±0.10d 0.72±0.02c 2.28±0.19c 0.23±0.04c 0.34±0.03b 0.19±0.05b-22.51±0.18d 15.59±0.82c 7.81±0.17b-12.31±0.15c 8.41±0.24a 6.32±0.36b 0.29±0.07b 4.67±0.06c菌株JL-4固态发酵低次烟叶2.87±0.20c 2.74±0.17b 0.84±0.05b 2.83±0.11a 0.84±0.09a 2.40±0.15c-7.14±0.19b-1.55±0.08b 0.64±0.04a 0.65±0.04b 0.88±0.05b 3.73±0.08a--0.37±0.05a-27.48±0.31c 17.68±0.7b 10.28±0.41a-17.53±0.43a 8.67±0.39a 7.02±0.12ab 1.06±0.1b 4.86±0.15bc菌株PY-1固态发酵低次烟叶4.81±0.10b 3.15±0.15a 1.13±0.10b 2.46±0.12b 0.70±0.03b 2.75±0.11b 1.85±0.02a 9.77±1.00a 1.79±0.06a 1.96±0.13a 0.66±0.05a 0.43±0.04c 0.65±0.05c 3.16±0.24b 0.47±0.10b 1.25±0.05a 0.26±0.05ab-37.25±1.06b 16.38±0.56bc 8.24±0.28b-13.16±0.59c 9.24±0.5a 7.13±0.35ab 1.02±0.07b 5.24±0.24ab混菌固态发酵低次烟叶5.73±0.13a 3.14±0.16a 1.89±0.14a 3.04±0.22a 0.79±0.07ab 5.39±0.14a 1.25±0.10b 10.29±0.52a 1.81±0.15a 2.08±0.14a 0.67±0.06a 1.65±0.11a 1.43±0.10a 1.06±0.05d 1.13±0.12a 1.26±0.09a 0.31±0.07ab 0.57±0.07 43.49±0.42a 20.94±1.36a 10.16±0.52a 3.25±0.22 14.29±0.6b 9.12±0.32a 7.31±0.49a 3.61±0.35a 5.48±0.23a
续表
序号 种类 化合物 无菌水固态发酵低次烟叶27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 1-（对甲氧基苯基）-1,3-丁二酮5-甲基呋喃醛脱氢二氢-β-紫罗兰酮4-环戊烯-1,3-二酮苯甲醛4-乙氧基苯甲醛甲基庚烯酮2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮5-甲基呋喃醛2,2,6-三甲基-1,4-环己二酮β-环柠檬醛茄酮1,3,7,7-四甲基-2-氧杂双环[4.4.0]-5-葵烯-9-酮金合欢基丙酮3,4-二甲基苯甲醛5-己基二氢-2（3H）-呋喃酮0.78±0.04b 0.14±0.02b 0.71±0.04d 1.00±0.07c 0.13±0.02c-0.48±0.04c 0.32±0.05b-- -21.5±1.18b-0.66±0.22d--45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 0.21±0.06c 0.09±0.03d 81.42±1.37c 0.97±0.04c 1.33±0.08c 1.36±0.07b 0.64±0.05b-0.51±0.04c 0.26±0.04c 0.51±0.03c烯烃类--61 62 63 64酸类65 66 67酯类（+）-香茅醛法尼基丙酮总计苯乙烯长叶烯西松烯（+）-香橙烯巴伦西亚橘烯香树烯（十）-γ-古芸烯（Z）-石竹烯β-石竹烯母菊兰烯正二十烷角鲨烯1-十九碳烯新植二烯（-）-罗汉柏烯3-甲基十七烷总计棕榈酸肉豆蔻酸丁酸亚麻酸总计二氢猕猴桃内酯邻苯二甲酸二正丁酯亚麻酸乙酯总计0.60±0.06c 0.37±0.05b 0.34±0.04b 225.16±2.01b 1.56±0.05a 0.80±0.08c 234.41±2.04b 7.32±0.16d 3.55±0.16c 0.13±0.02c 1.94±0.05c 12.94±0.38d 2.68±0.31c 0.91±0.06b 0.07±0.03b 3.66±0.36c菌株JL-4固态发酵低次烟叶0.65±0.06c 0.18±0.03b 1.05±0.08c 1.27±0.08b 0.48±0.04a-0.53±0.06c 0.30±0.04b 0.83±0.05c 0.18±0.05b 0.25±0.02b 28.47±2.95a 0.07±0.02b 1.52±0.13c--0.64±0.08b 0.32±0.02c 103.84±3.46b 1.16±0.11b 2.89±0.19a 1.99±0.08a 1.12±0.11a-1.42±0.08a 0.51±0.1b 0.77±0.04c--1.48±0.06a 0.80±0.08a-237.57±3.85a 1.75±0.15a-251.46±4.05a 9.45±0.11b 3.95±0.32bc-3.83±0.08a 17.23±0.12b 3.30±0.06b 0.90±0.12b 0.15±0.02ab 4.25±0.29b菌株PY-1固态发酵低次烟叶-0.19±0.04b 1.39±0.12b 2.11±0.10a 0.50±0.06a-0.96±0.06b 0.20±0.02b 1.51±0.05b--25.30±1.26a-2.43±0.06b 0.28±0.04b 0.12±0.02b 1.23±0.09a 0.57±0.06b 97.20±1.82b 1.66±0.08a 2.03±0.06b 1.42±0.08b--1.06±0.11b 0.53±0.05b 0.42±0.03b--0.63±0.08c 0.29±0.02b-226.85±3.92b 1.26±0.06b 2.87±0.06a 239.02±4.01b 9.02±0.28c 4.40±0.13a 0.82±0.06b-14.24±0.48c 4.90±0.27a 0.84±0.05b 0.08±0.02b 5.82±0.20a混菌固态发酵低次烟叶2.62±0.26a 1.43±0.11a 2.78±0.21a 2.01±0.17a 0.32±0.03b 1.27±0.10 1.88±0.17a 1.26±0.15a 1.74±0.07a 1.08±0.09a 1.31±0.09a 26.09±1.17a 1.99±0.06a 3.61±0.05a 2.76±0.09a 1.51±0.04a 1.33±0.03a 1.04±0.06a 130.19±4.57a 1.73±0.07a 1.06±0.05d 1.12±0.04c-0.01±0.00 0.36±0.01c 0.74±0.04a 1.19±0.09a 4.17±0.06 3.04±0.13 1.33±0.07b 0.15±0.02c 0.65±0.05a 238.13±0.36a 1.68±0.09a 1.47±0.16b 256.83±1.02a 13.51±0.18a 4.10±0.13ab 1.10±0.15a 3.37±0.07b 22.08±0.52a 4.50±0.08a 1.26±0.08a 0.26±0.09a 6.02±0.16a
续表
注：同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。“-”表示未检出。
序号 种类 化合物 无菌水固态发酵低次烟叶68 69 70 71 72 73 74杂环类75 76 77酚类78 79 80 81其他2-（1-甲基吡咯烷-2-基）吡啶5-环己基-2,3-二氢-2-甲基苯并呋喃2,3-二氢-2-甲基苯并呋喃尼古丁1-乙酰吲哚2-乙酰基吡咯5-吲哚总计2-甲氧基-4-乙烯苯酚2,2'-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）2,6-二异丙基苯酚总计2-乙基对二甲苯3,4-二甲基茴香醚1,3,5-三甲基-2-（2-丁烯基）苯2,3-二氢-1,1,5,6-四甲基-1H-茚总计0.09±0.03b 1.88±0.12c 0.88±0.03c 1.41±0.14a 0.23±0.04d 1.06±0.07c 2.17±0.07c 7.72±0.13d 2.64±0.08d 0.41±0.06b 1.26±0.05c 4.31±0.18c 0.38±0.04b-0.47±0.06c-0.85±0.10c菌株JL-4固态发酵低次烟叶1.29±0.06a 2.05±0.05c 1.55±0.08a 1.37±0.09a 0.60±0.04c 2.93±0.08a 3.68±0.15a 13.47±0.09a 3.03±0.08c 0.52±0.05b 1.82±0.12b 5.37±0.16b 0.32±0.05b-0.88±0.08b-1.29±0.08b菌株PY-1固态发酵低次烟叶-3.61±0.10b 1.07±0.06b 1.35±0.09a 0.83±0.05b 1.39±0.05b 2.39±0.10b 10.64±0.04c 4.26±0.16a 1.70±0.10a 2.32±0.12a 8.28±0.22a 0.39±0.04b-0.78±0.09d-1.17±0.11b混菌固态发酵低次烟叶1.39±0.06a 4.82±0.05a 1.67±0.07a 1.38±0.05a 1.09±0.07a 1.27±0.09b 0.42±0.02d 12.04±0.09b 3.94±0.09b 1.67±0.07a 2.35±0.11a 7.96±0.06a 1.74±0.08a 1.44±0.10 1.21±0.06a 1.41±0.03 5.80±0.21a
由表4可知，与无菌水和单菌固态发酵低次烟叶相比，混菌固态发酵低次烟叶中的主要香气成分含量得到了提升，这有助于提高烟叶的品质。新植二烯是烟草中重要的挥发性致香物质，其降解过程可以产生有益的香味成分，从而提升烟叶的香气和口感，并增强烤烟烟气的丰满度[22]，与无菌水和单菌固态发酵低次烟叶相比，混菌固态发酵低次烟叶中的新植二烯含量（238.13 μg/g）升高，说明混菌发酵能够促进新植二烯的产生。与无菌水固态发酵低次烟叶相比，在醇类化合物中，混菌固态发酵低次烟叶中的3-呋喃甲醇、苯甲醇、芳樟醇、香叶基香叶醇、金合欢醇等重要香气物质的含量也有所增加，这些成分为卷烟增添了清甜的香韵[35]。其中，苯甲醇、3,5-二甲基苯甲醇是芳香族苯丙氨酸类降解产物，能够增加烟叶的花香和果香香气[36]，而芳樟醇作为链状萜烯醇类物质，是类胡萝卜素降解产物，能够为烟叶增加玫瑰木香气，使卷烟的烟气更加细腻[37]。在醛酮类化合物中，大多数物质为类胡萝卜素降解产物，其中，混菌固态发酵低次烟叶中的4,7,9-巨豆三烯-3-酮、大马士酮、香叶基丙酮、螺岩兰草酮、β-紫罗酮等含量均有所提高，特别是金合欢基丙酮和甲基庚烯酮的含量，比无菌水固态发酵低次烟叶分别提高了447%和291%，这增加了烟叶的清甜香和烤烟香[38]，大马士酮的含量相较于菌株JL-4固态发酵低次烟叶有所降低，这可能与接种量的不同或混菌发酵过程中该化学物质受到抑制有关；茄酮为类西柏烷类降解产物，其含量相对于无菌水固态发酵低次烟叶提高了21.34%，这进一步丰富了烟叶的草香及青香香气，使烟气更醇和且细腻[39]；醛酮类化合物中还含有较多的美拉德反应产物，如糠醛和苯乙醛，其在混菌固态发酵低次烟叶中的含量极大提高，可以掩盖烟草的苦涩味道，提升抽吸口感[40]。在烯烃类化合物中，巴伦西亚橘烯和母菊兰烯是混菌固态发酵低次烟叶中特有的物质，前者能够赋予卷烟的特征果香香味[41]，而后者则使卷烟香气更加丰富细腻[42]。在酸类化合物中，混菌固态发酵低次烟叶中的棕榈酸含量升高，其能够增强烟气的丰满度，并降低卷烟刺激性[43]。在酯类化合物中，混菌固态发酵低次烟叶中的二氢猕猴桃内酯、邻苯二甲酸二正丁酯等含量升高，其中，二氢猕猴桃内酯为重要香味物质、邻苯二甲酸二正丁酯可增加芳香气味、亚麻酸乙酯可使烟气醇和[44]。
4种固态发酵低次烟叶的理化指标见表5。由表5可知，与无菌水、菌株JL-4和PY-1固态发酵低次烟叶相比，混菌固态发酵低次烟叶中的淀粉含量（4.31%）显著降低（P＜0.05），分别降低31.04%、5.27%、30.71%；水溶性糖总含量（34.64%）显著升高（P＜0.05），分别升高14.85%、6.55%、9.07%；而还原糖含量（22.73%）差异不显著（P＞0.05）。与无菌术固态发酵低次烟叶相比，菌株JL-4固态发酵低次烟叶中淀粉含量降低27.20%，菌株PY-1固态发酵低次烟叶中淀粉含量无明显变化（P＞0.05），说明混菌固态发酵低次烟叶中淀粉含量显著降低可能与菌株JL-4有关。
表5 固态发酵低次烟叶样品的理化指标
Table 5 Physicochemical indexes of low-grade tobacco leaves samples by solid-state fermentation
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
样品 淀粉含量/% 水溶性糖总含量/% 还原糖含量/%无菌水固态发酵低次烟叶菌株JL-4固态发酵低次烟叶菌株PY-1固态发酵低次烟叶混菌固态发酵低次烟叶6.25±0.04a 30.16±0.51c 21.72±0.64ab 4.55±0.06b 32.51±0.34b 23.14±0.09a 6.22±0.13a 31.76±0.39b 21.37±0.85b 4.31±0.11c 34.64±0.73a 22.73±0.66ab
4种固态发酵低次烟叶的感官评吸结果见图4。由图4可知，与其他3组对照组相比，混菌固态发酵低次烟叶的香气质、香气量得到明显提升，伴有一定花香味，余味有所改善，刺激性和杂气减轻，整体品质提高。混菌固态发酵低次烟叶的感官评吸得分（28分）高于其他试验组，比无菌水、菌株JL-4和PY-1固态发酵低次烟叶的感官评吸得分分别提高51.35%、12.00%、16.67%，表明混菌发酵能够改善烟叶的吸食品质。
图4 固态发酵低次烟叶样品的感官评吸雷达图
Fig.4 Sensory evaluation radar map of low-grade tobacco leaves samples fermented by solid-state
本研究以挥发性致香成分含量为评价指标，通过单因素试验和正交优化试验优化得到解淀粉芽孢杆菌JL-4和酿酒酵母PY-1混菌固态发酵低次烟叶的最佳工艺条件为解淀粉芽孢杆菌JL-4∶酿酒酵母PY-1配比为2∶1、发酵温度33 ℃、接种量24%。在此条件下，混菌发酵后低次烟叶的挥发性致香成分含量最高，为565.47 μg/g，与无菌水、菌株JL-4和PY-1固态发酵低次烟叶相比，混菌固态发酵低次烟叶中的挥发性致香成分含量分别提高30.44%、9.94%、12.42%，淀粉含量分别降低31.04%、5.27%、30.71%，水溶性糖总含量分别增加14.85%、6.55%、9.07%，感官评吸得分分别提高51.35%、12.00%、16.67%，吸食品质大幅改善，香气质和香气量提升、余味更佳、刺激性和杂气减轻。本研究结果为烟叶的不同菌种混合发酵技术开发提供了一定的技术支撑。
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