Preparation and antioxidant activity in vitro of Fortunella margarita and black tea wine
金桔（Fortunella margarita）又名金橘、金柑、金弹、金枣，属芸香科金橘属植物的果实，其体型小，呈卵球形，在中国有着悠久的栽种历史[1-2]。金桔的营养价值较高，含有黄酮、挥发油、多糖、有机酸、维生素、微量元素及氨基酸等多种营养功能成分[3]。《中华本草》中记载，金桔性温，味甘、酸，具有解郁、理气、化痰、消食、解酒醉的功用[4]。现代药理学表明，金桔具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗癌、调节机体免疫、降血糖等多种特殊功效[5-8]。
红茶是全发酵茶的一种，其主要特点是红汤、红叶及滋味醇厚[9-10]。红茶中的生物活性物质较为丰富，包括茶多酚、茶红素、茶黄素、咖啡碱、茶多糖、维生素、氨基酸、矿物质和微量元素等[11-12]。这些物质具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖、保护心血管、肝脏保护等生理功能[13-14]。目前，红茶及其化合物也被广泛用作功能性食品或膳食补充剂，具有广阔的应用价值[14]。
近年来，发酵果酒因其在发酵过程中能够较好保留水果的风味和营养物质，越来越受到消费者的喜爱[15]。然而，果酒产品也面临着消费者需求不断提高的现实问题。茶叶作为一种营养价值丰富又能与水果协调搭配的原料，在果酒开发方面具有很大前景。将水果和茶叶这两种原料复配开发出新的果酒产品既能融合水果和茶叶的风味，又能使它们的营养价值叠加[16]。目前，已有许多利用水果辅以茶叶进行融合制酒的尝试，如以水蜜桃和信阳毛尖为原料研制出的水蜜桃绿茶酒[17]，以猕猴桃和红茶为原料研制出的猕猴桃红茶酒[18]等，不仅如此，研究人员们还通过各种分析手段证明了这种新型果酒特殊的融合香气以及抗氧化活性[18-19]。因此，本研究采用金桔与红茶为主要原料，采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY为菌种，研制出一款兼具金桔和红茶风味与营养的金桔红茶酒。通过单因素试验和响应面试验对金桔红茶酒的发酵条件进行优化，并对其功能性成分含量和体外抗氧化活性进行测定，探索金桔和红茶融合的新途径新工艺，丰富我国酒类产品的种类，满足广大消费者的新需求。
1.1.1 材料
融安金桔（糖度16～20°Bx）：广西壮族自治区柳州市；金骏眉红茶：武夷山九州星生态茶业有限公司；白砂糖（食品级）：成都云糖耿马糖业有限公司；安琪葡萄酒·果酒专用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（30 000 U/g）、柠檬酸（分析纯）、焦亚硫酸钾（分析纯）：河南高宝实业有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2 化学试剂
亚硝酸钠、九水合硝酸铝、氢氧化钠、L（+）抗坏血酸、七水合硫酸亚铁、水杨酸（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；芦丁（纯度≥98%）：西安汇林生物科技有限公司；没食子酸（纯度≥99%）：福州飞净生物科技有限公司；30%过氧化氢（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海易恩化学技术有限公司。
JD300-3分析天平：沈阳龙腾电子有限公司；JYL-Y912高速破壁调理机：九阳股份有限公司；HH·B11-BS-II电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；PHS-320 pH计：成都世纪方舟科技有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；L2S紫外分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司。
1.3.1 金桔红茶酒发酵工艺及操作要点[17-19]
操作要点：
金桔汁的制备：参考曾霖霖[20]的方法，将金桔清洗后，按料水比1∶2打浆得到金桔果浆，加入80 mg/L果胶酶和80 mg/L焦亚硫酸钾，50 ℃酶解50 min。酶解结束后在85 ℃条件下灭酶5min，采用120目过滤袋过滤后冷却得到金桔汁。
茶汤的制备：称取红茶茶叶，冷水清洗后，按照茶水比1∶40添加热水，密封后，在80 ℃条件下浸提30 min，再用120目过滤袋趁热过滤，冷却，得到茶汤。
复合茶汤：按照茶汤与金桔汁体积比1∶1混匀得到复合茶汤。
调配成分：添加白砂糖调整复合茶汤初始糖度为20°Bx，添加柠檬酸调整pH至4.5～5.0。
酵母活化、接种：以1∶10的质量比将安琪葡萄酒·果酒专用酿酒酵母SY加入32 ℃的无菌水中，用玻璃棒搅拌均匀后在32 ℃水浴活化20 min。将活化后的酿酒酵母按接种量0.3%（以加入酿酒酵母SY的质量占接种后复合茶汤总质量的百分比来计算）加入复合茶汤中。
发酵：将发酵瓶放入28 ℃恒温培养箱中避光发酵，发酵过程中液面有大量泡沫，根据发酵液无小气泡从底部产生判断发酵达到终点，发酵7 d时液体逐渐澄清，此时发酵接近终点。
过滤、澄清：采用300目过滤袋过滤发酵液，过滤后置于4 ℃冰箱中静置24 h，将上层清液转移至新的容器。
灭菌：将酒体中心温度加热至70 ℃，并在此温度下保持20 min进行灭菌，即得金桔红茶酒成品。
1.3.2 金桔红茶酒发酵工艺优化单因素试验
在1.3.1的基础上，采用单因素轮换法依次考察茶水质量比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）、红茶汤与金桔汁体积比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、酿酒酵母SY接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、初始糖度（16°Bx、18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx）对金桔红茶酒感官评分以及酒精度、残糖量的影响。
1.3.3 金桔红茶酒发酵工艺优化响应面试验
根据单因素试验结果，选择对结果影响较大的红茶汤与金桔汁体积比（A）、酿酒酵母SY接种量（B）、初始糖度（C）为考察因素，以感官评分为响应值（Y），采用Design-Expert 13.0软件设计3因素3水平的响应面优化试验，试验因素与水平见表1。
表1 金桔红茶酒发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of Fortunella margarita and black tea wine
水平 A 红茶汤与金桔汁体积比C 初始糖度/°Bx-1 B 酿酒酵母SY接种量/%01 3∶1 2∶1 1∶1 0.2 0.3 0.4 20 22 24
1.3.4 分析检测
酒精度的测定：参考GB 5009.225—2023《食品安全国家标准酒和食用酒精中乙醇浓度的测量》；糖度的测定：采用手持折光仪；pH的测定：采用pH计；总黄酮含量的测定：参考王定美等[21]的方法，以芦丁为标准品进行测定；总酚含量的测定：参考程宏桢等[22]的方法，以没食子酸为标准品进行测定；OH自由基清除能力的测定：参考程宏桢[22]等的测定方法；DPPH自由基清除能力的测定：参考吴均等[23]的测定方法；菌落总数的测定：参考GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》；大肠菌群的测定：参考GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。
感官评定：参考GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官评价方法，由一个10名评委组成的小组从外观、香气、口感和典型性方面对金桔红茶酒进行感官评价，具体感官评价标准见表2。
表2 金桔红茶酒的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Fortunella margarita and black tea wine
项目 评价标准 分值/分外观（20分）香气（30分）口感（40分）澄清透明，有光泽，无悬浮物，具有原红茶、金桔汤色澄清透明，无明显悬浮物，具有原红茶、金桔汤色澄清，稍有悬浮物，与原红茶、金桔汤色略有不同浑浊，色泽暗淡，无原红茶、金桔汤色红茶香、金桔香、酒香协调浓郁，清香怡人红茶香或金桔香偏淡，酒香浓郁红茶香、金桔香、酒香单薄，但无不良气味有不良气味口感丰富，口味协调，红茶和金桔味适中，回味柔顺口感较为舒适，有红茶和金桔味，稍有苦涩或酸味口感一般，偏苦或偏酸，无茶味，无不良口味口感寡淡，苦涩味重，或酸味重典型性（10分）典型完美，风格独特有典型性缺少典型性18～20 15～17 11～14 0～10 25～30 20～25 15～19 0～15 36～40 30～35 21～29 0～20 8～10 5～7 0～5
1.3.5 数据处理与统计分析
每个试验重复3次，使用SPSS 27.0.1进行数据处理，结果用“平均值±标准差”表示。采用Origin 2021绘图。
2.1.1 茶水质量比对金桔红茶酒品质的影响
茶水质量比对金桔红茶酒品质的影响见图1。由图1可知，随着茶水质量比的减小，金桔红茶酒的感官评分呈现出先升高后降低的趋势，但变化趋势较为平缓；酒精度和残糖量变化不明显。当茶水质量比为1∶50时，感官评分最高，为（69.37±0.40）分，酒精度和残糖量分别为（10.73±0.12）%vol、（6.60±0.20）°Bx。当茶水质量比过高时，金桔红茶酒红茶香气浓郁，但是红茶过多造成了口感较为苦涩；当茶水质量比过低，金桔红茶酒的红茶香气变得略微淡薄，整体香气不够协调。因此，确定最佳茶水质量比为1∶50。
图1 茶水质量比对金桔红茶酒品质的影响
Fig.1 Effect of tea and water mass ratio on the quality of Fortunella margarita and black tea wine
2.1.2 茶汤与金桔汁体积比对金桔红茶酒品质的影响
茶汤与金桔汁体积比对金桔红茶酒品质的影响见图2。由图2可知，随着金桔汁体积占比的增加，金桔红茶酒的感官评分呈现出先升高后降低的趋势，酒精度和残糖度变化不明显。当茶汤与金桔汁体积比为2∶1时，感官评分最高，为（72.03±0.45）分，此时，酒精度和残糖量分别是（10.47±0.23）%vol、（6.73±0.12）°Bx。当茶汤与金桔汁体积比过高时，金桔红茶酒红茶香气浓郁，但是红茶过多造成了口感较为苦涩，且金桔汁的体积占比较少，导致果香降低；当金桔汁体积的占比逐渐升高时，金桔红茶酒的口感开始变酸，且红茶的香气逐渐淡薄，导致整体香气不够协调。因此，确定茶汤与金桔汁的最佳体积比为2∶1。
图2 红茶汤与金桔汁体积比对金桔红茶酒品质的影响
Fig.2 Effect of black tea broth and Fortunella margarita juice volume ratio on the quality of Fortunella margarita and black tea wine
2.1.3 酿酒酵母SY接种量对金桔红茶酒品质的影响
酿酒酵母SY接种量对金桔红茶酒品质的影响见图3。由图3可知，随着酿酒酵母SY接种量的增加，金桔红茶酒的感官评分呈先升高后降低的趋势，酒精度和残糖量分别呈升高和降低趋势。当酿酒酵母SY接种量为0.3%时，感官评分最高，为（71.83±0.38）分，酒精度和残糖量分别为（10.87±0.12）%vol、（6.67±0.12）°Bx。酵母接种量与茶酒的品质密切相关[24]，当酿酒酵母SY接种量过高时，酵母数量增多，导致底物糖的消耗加快和大量副产物代谢产生，酒体的酒精度升高，残糖量下降，进而使得酒体入口越烈，果香茶香味降低；当酿酒酵母SY接种量过低时，会导致发酵速率变得缓慢，发酵不充分，酒精转换量降低，糖度消耗降低，从而使酒香寡淡，风格缺失[25]。因此，确定最佳酿酒酵母SY接种量为0.3%。
图3 酿酒酵母SY接种量对金桔红茶酒品质的影响
Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiae SY inoculum on the quality of Fortunella margarita and black tea wine
2.1.4 初始糖度对金桔红茶酒品质的影响
初始糖度对金桔红茶酒品质的影响见图4。由图4可知，随着初始糖度的升高，金桔红茶酒的感官评分呈先上升后下降的趋势，酒精度和残糖量呈升高趋势。当初始糖度为22°Bx时，感官评分最高，为（86.67±0.50）分，酒精度和残糖量分别为（11.33±0.12）%vol、（8.20±0.20）°Bx。糖是酵母在发酵过程中重要的能源物质，决定了酵母新陈代谢的快慢，能够影响整个发酵进程及酒精生产[18]。当初始糖度过低时，基质中的糖分不足，从而使酒精度较低，酒香单薄，且残糖量低，会使得酒体口感苦涩；但初始糖度过高，不仅会影响酒的整个感官品质，导致金桔红茶酒口味过于甜腻，失去了作为酒的风格，且基质中糖度过高可能会导致微生物产生不良影响。因此，确定最佳初始糖度为22°Bx。
图4 初始糖度对金桔红茶酒品质的影响
Fig.4 Effect of initial sugar contents on the quality of Fortunella margarita and black tea wine
2.2.1 响应面试验设计及结果
根据单因素试验结果，选取红茶汤与金桔汁体积比（A）、酿酒酵母SY接种量（B）、初始糖度（C）为考察因素，以感官评分（Y）为响应值，采用Design-Expert 13软件设计3因素3水平的响应面优化试验，试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 金桔红茶发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of Fortunella margarita and black tea wine
试验号A 红茶汤与金桔汁体积比B 酿酒酵母SY接种量/%C 初始糖度/°Bx Y 感官评分/分123 456 7891 0 11 12 13 14 15 16 17 2∶1 1∶1 3∶1 1∶1 3∶1 2∶1 2∶1 2∶1 1∶1 2∶1 2∶1 2∶1 2∶1 2∶1 1∶1 3∶1 3∶1 0.3 0.3 0.3 0.2 0.4 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.2 22 24 24 22 22 20 24 22 22 22 22 24 20 22 20 20 22 85.3 84.6 84.0 77.5 75.1 66.5 83.4 88.3 75.2 86.7 87.2 81.4 70.3 86.6 68.3 69.5 79.1
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型**ABCA B***AC BC A2 B2 C2 850.10 0.551 2 8.20 432.18 0.722 5 0.810 0 8.41 83.29 134.29 140.30 911111 1111 94.46 0.551 2 8.20 432.18 0.722 5 0.810 0 8.41 83.29 134.29 140.30 79.47 0.463 8 6.90 363.59 0.607 8 0.681 4 7.08 70.07 112.98 118.04＜0.000 1 0.517 8 0.034 1＜0.000 1 0.461 1 0.436 3 0.032 5＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1*******
续表
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著
（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性残差失拟项纯误差总差8.32 3.61 4.71 858.42 7341 6 1.19 1.20 1.18 1.02 0.471 1 不显著
采用Design-Expert 13软件对表3数据进行多元二次回归拟合分析，得到响应值Y与A、B、C变量的二次多元回归方程：Y=86.82+0.262 5A-1.01B+7.35C-0.425 0AB-0.45AC+1.45BC-4.45A2-5.65B2-5.77C2。
由表4可知，模型P＜0.000 1，极显著；失拟项P=0.471 1＞0.05，不显著，说明模型可靠。相关系数R2=0.990 3，调整决定系数R2Adj=0.924 1，表明该模型与实际情况较为吻合，能够用于金桔红茶酒发酵工艺优化试验的预测和分析。信噪比为25.392 2＞4，表示感官分析模型精度较高，能够用于实际操作。由P值可知，一次项C及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项B及交互项BC对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05），由F值可知，各因素对金桔红茶酒感官评分的影响的主次顺序为C＞B＞A，即初始糖度＞酿酒酵母接种量＞茶汤与金桔汁体积比。
2.2.2 响应面交互作用分析
响应曲面坡面的陡峭程度与等高线的形状能够反映各因素间交互作用对感官评分影响的显著程度，坡度越大，等高线形状越接近椭圆，表明交互项之间的影响越明显。酿酒酵母SY接种量与初始糖度间交互作用对金桔红茶酒感官评分影响的响应面及等高线见图5。由图5可知，响应面坡度较陡，等高线呈椭圆，说明酿酒酵母SY接种量与初始糖度间交互作用对金桔红茶酒感官评分的影响较大，这与方差分析结果一致。
图5 酿酒酵母SY接种量与初始糖度间交互作用对金桔红茶酒感官评分影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plot and contour lines of effect of interaction between Saccharomyces cerevisiae SY inoculum and initial sugar contents on sensory score of Fortunella margarita and black tea wine
2.2.3 验证试验
通过Design-Expert 13.0软件预测得到金桔红茶酒的最佳发酵工艺为：红茶汤与金桔汁体积比1.989∶1、酿酒酵母SY接种量0.281%、初始糖度23.242°Bx，感官评分预测值为88.751分。为便于实际操作，将最优发酵工艺修订为红茶汤与金桔汁体积比2∶1、酿酒酵母SY接种量0.3%、初始糖度23°Bx。在此条件下进行3次验证试验，金桔红茶酒的外观呈黄色，澄清透明，有光泽；具有协调的金桔果香气和红茶茶香气、酒香和谐；口感较为柔和，酸度适宜；酒体较协调，具有果酒的典型风格，平均感官评分实际值为88.620，与预测值相近，说明模型合理可靠。
按最优发酵工艺制作金桔红茶酒，其酒精度为（11.83±0.12）%vol，残糖量为（9.07±0.23）°Bx，pH为3.26±0.04，总黄酮含量为（0.71±0.04）mg/mL，总多酚含量为（0.25±0.01）mg/mL；菌落总数和大肠杆菌未检出，其理化和微生物指标均符合NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》标准要求。
2.4.1 OH自由基清除能力
活性氧（reactive oxygen species，ROS）广泛存在于人的机体内和自然环境中，如果人体内的自由基过多将会对人体的机能造成损伤，OH自由基是活性氧中一种具有强氧化性的自由基[25]。金桔红茶酒对OH自由基的清除率见图6。由图6可知，随着金桔红茶酒用量的增加，金桔红茶酒的OH自由基清除率逐渐升高，但其抗氧化能力增长相对于维生素C（vitamin C，VC）较平缓，当金桔红茶酒用量＜0.8 mL时，OH自由基清除率大于0.2%VC；当金桔红茶酒用量为0.8 mL时，OH自由基清除率为（68.65±0.66）%，与0.2%VC的OH自由基清除率相当；当金桔红茶酒用量＞0.8 mL时，OH自由基清除率不及0.2%VC；当金桔红茶酒用量为1.8 mL时，OH自由基清除率最高，为（84.45±1.15）%。
图6 金桔红茶酒的羟自由基清除能力测定结果
Fig.6 Determination results of hydroxyl radical clearance capacity of Fortunella margarita and black tea wine
2.4.2 DPPH自由基清除能力测定结果
DPPH与抗氧化物质反应后，颜色会逐渐由深紫色变成淡紫色或黄色，颜色变化越明显表示物质的抗氧化能力越强，测量反应体系的吸光值后，通过计算DPPH自由基清除率来反映抗氧化活性的强弱[26]。金桔红茶酒对DPPH自由基的清除率见图7。由图7可知，金桔红茶酒与0.2%VC溶液清除DPPH自由基能力较强，均在90%以上，但金桔红茶酒的DPPH自由基清除率略低于0.2%VC。随着金桔红茶酒用量的增加，金桔红茶酒的DPPH自由基清除率逐渐增加，但增加速率较为缓慢。当金桔红茶酒用量为1.4 mL时，金桔红茶酒DPPH清除率最高，为（92.14±0.62）%。
图7 金桔红茶酒的1,1-二苯基-2-苦肼基自由基清除能力测定结果
Fig.7 Determination results of 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical clearance capacity of Fortunella margarita and black tea wine
本研究以金桔和红茶为原料，采用酿酒酵母SY发酵研制兼具金桔和红茶风味与营养的金桔红茶酒。通过单因素和响应面优化试验获得金桔红茶酒的最佳发酵工艺参数为红茶汤与金桔汁体积比2∶1、酿酒酵母SY接种量0.3%、初始糖度23°Bx。在此条件下研制出的金桔红茶酒外观呈黄色，澄清透明，有光泽；具有协调的金桔果香气和红茶茶香气、酒香和谐；口感较为柔和，酸度适宜；酒体较协调，具有果酒的典型风格，感官评分达到88.62分，酒精度为11.83%vol、残糖量为9.07°Bx、pH值为3.26、总黄酮含量为0.71 mg/mL、总多酚含量为0.25 mg/mL；菌落总数和大肠杆菌未检出，其理化和微生物指标均符合相关标准要求。金桔红茶酒的羟自由基清除率为84.45%，DPPH自由基清除率为92.14%，说明其具有一定的抗氧化活性。综上，金桔红茶酒成品不仅融合了金桔和红茶的风味与营养价值，而且抗氧化活性较强，其不仅丰富了金桔与红茶搭配的相关产品，还为复合果酒产业融合创新发展开辟了新途径。
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