表1 Plackett-Burman试验设计因素及水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design
编号 因素水平-1 1 X1X2X3X4X5X6初始pH值发酵温度/℃发酵时间/d乙醇添加量/%最佳碳源质量浓度/（g·L-1）最佳氮源质量浓度/（g·L-1）6 8 32 40 6 1 5 8 3 9 1.25 1.75
Optimization of culture conditions of caproic acid bacteria liquid for production and fermentation of artificial pit mud
我国白酒主要有12种香型，其中浓香型白酒在中国所有白酒香型中产量最大，在市场中的占比在50%以上[1]。浓香型白酒主要风味物质-己酸乙酯的形成离不开窖泥，窖泥中富含的关键微生物群落对浓香型白酒的发酵过程及其风味和品质都具有重要影响[2]。传统窖泥是指利用新鲜黄泥构筑窖池后，在自然酿酒环境下，通过黄泥中微生物的自然接种与逐步驯化，以及微生物与其所处生态环境的共同进化作用形成的复杂产物[3]。传统窖泥的自然老熟是一个十分漫长的过程，由于窖泥自然老熟时间长且窖泥易退化等原因，优质窖泥仍然较少[4]。都说“老窖酿好酒”，想要酿出优质白酒，窖泥的质量好是基础[5]。如何提升窖泥品质以及加速窖泥的老熟是浓香型白酒酿造生产的一大难题。
近年来，人工窖泥的研究和应用取得了显著进展[6-9]。人工窖泥是通过现代生物技术，模拟传统老熟窖泥的生态特征，在黄泥中添加辅料并接种富含酿酒功能的微生物，经过厌氧发酵形成的窖泥[10]。它不仅大幅缩短了窖泥的老熟时间，还成功复制了老窖泥的微生物群落结构，保留了其高品质的酿酒功能[11]。鲁少文等[12]利用新型强化己酸菌培养人工窖泥，与以往产己酸菌不同的是该新型强化己酸菌能利用乳酸产生己酸而非乙醇，使用新型强化己酸菌培养人工窖泥不仅能够显著提高窖泥中己酸乙酯的含量，还能加速窖泥老化，即核心微生物的加入，有利于窖泥微生物群落更快地稳定，从而提高窖泥质量。张健等[13]从老窖泥中筛选了产己酸能力强的细菌制成复合菌液，添加到人工窖泥中，发现在微生物的数量和感官评价方面，添加复合菌液优于添加纯己酸菌液培养的人工窖泥，这为使用混合菌液来提高人工窖泥的质量提供了重要依据。人工窖泥的微生物群落对于浓香型白酒的发酵过程和风味代谢物形成具有重要影响[14]，所以如何高效利用老窖泥中的关键微生物依旧是人工窖泥研究的难点。
己酸菌是人工窖泥发酵过程中的关键微生物菌属[15]，因此寻找己酸菌液的最佳培养条件对于人工窖泥的质量提升至关重要。本研究通过优化己酸菌液的培养条件来提高己酸产量，并以己酸产量作为响应值，通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验对己酸菌液的培养条件进行优化，旨在为人工窖泥的生产质量调控及白酒酒质的稳定提供理论指导和实践意义。
己酸菌液：来自四川某知名酒厂；葡萄糖（分析纯）：天津市密欧化学试剂有限公司；牛肉浸粉、酵母浸粉（均为生化试剂）：华北生物科技有限公司；蛋白胨、可溶性淀粉（均为生化试剂）：南方化学试剂有限公司；黄豆饼粉（生化试剂）、无水乙酸钠、蔗糖、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O（均为分析纯）：西南化学品有限公司；无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
乙醇-乙酸钠培养基：无水乙酸钠5 g/L，酵母膏1 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，K2HPO4 0.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，自然pH值，121 ℃灭菌20 min，体积分数95%乙醇2.0%，灭菌后使用前加入体积分数95%的乙醇2.0%。
IFA-110-8强制对流通用型培养箱：杭州诺丁科学器材有限公司；BSC-1300ⅡB2生物安全柜：苏州赛鸿泰净化科技有限公司；Eppendorf 5804R台式低温高速离心机：北京阿拉斯加科技有限公司；HYL-C组合式多功能摇床：太仓市强乐验设备有限公司；SX-700E全自动高压灭菌锅：日本Tomy Digital Biology公司；ME204E型电子天平：梅特勒-托利多仪器（山海）有限公司；HP-INNOWax 毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、GCMS-QP2020NX气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）：日本岛津有限公司。
1.3.1 己酸菌液扩培[16]
将己酸菌液以10%的接种量接种至乙醇-乙酸钠培养基中，按90%装液量分装于50 mL灭菌后的离心管，密封后于37 ℃培养7 d。
1.3.2 己酸菌液培养条件优化单因素试验
（1）初始pH值：将乙醇-乙酸钠培养基的初始pH值分别调整为5、6、7、8、9，固定发酵温度为37 ℃、发酵时间为7 d，进行培养，以己酸菌液中的己酸产量为评价指标，比较不同pH值对己酸产量的影响。
（2）发酵温度：在乙醇-乙酸钠培养基的基础上，分别将发酵温度设置为29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃、45 ℃，固定初始pH值为7、发酵时间为7 d，进行培养，以己酸菌液中的己酸产量为评价指标，比较不同发酵温度对己酸产量的影响。
（3）发酵时间：在乙醇-乙酸钠培养基的基础上，分别将发酵时间设置为5 d、6 d、7 d、8 d、9 d，固定初始pH值为7、发酵温度为37 ℃，进行培养，以己酸菌液中的己酸产量为评价指标，比较不同发酵时间对己酸产量的影响。
（4）乙醇添加量：在乙醇-乙酸钠培养基的基础上，分别将乙醇添加量设置为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，固定初始pH值为7、发酵温度为37 ℃、发酵时间为7 d，进行培养，以己酸菌液中的己酸产量为评价指标，比较不同乙醇添加量对己酸产量的影响。
（5）碳源种类及最佳碳源质量浓度：在乙醇-乙酸钠培养基的基础上，分别添加5 g/L可溶性淀粉、葡萄糖、无水乙酸钠、蔗糖为碳源，固定初始pH值为7、发酵温度为37 ℃，比较不同碳源对己酸菌液中己酸产量的影响，以确定最佳碳源种类。确定最佳碳源种类后，分别将碳源的质量浓度设置为1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L，固定初始pH值为7、发酵温度为37 ℃、发酵时间为7 d，进行培养，以己酸菌液中的己酸产量为评价指标，比较碳源质量浓度对己酸产量的影响。
（6）有机氮源种类及碳源质量浓度：在乙醇-乙酸钠培养基的基础上，分别添加1 g/L蛋白胨、牛肉浸粉、黄豆饼粉、酵母浸粉为有机氮源，固定发酵温度为37 ℃、初始pH值为7、发酵时间为7 d，比较不同有机氮源对己酸菌液中己酸产量的影响，以确定最佳有机氮源种类。确定最佳有机氮源种类后，分别将有机氮源的质量浓度设置为0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L、1.50 g/L、1.75 g/L，固定发酵温度为37 ℃、初始pH值为7、发酵时间为7 d，以己酸菌液中的己酸产量为评价指标，比较有机氮源质量浓度对己酸产量的影响。
1.3.3 Plackett-Burman试验
在单因素试验的基础上，以初始pH值（X1）、发酵温度（X2）、发酵时间（X3）、乙醇添加量（X4）、最佳碳源质量浓度（X5）、最佳氮源质量浓度（X6）等6个因素作为自变量，以己酸菌液中己酸产量（Y）为响应值，采用Plackett-Burman试验设计，筛选出对己酸产量具有显著影响的因子，试验因素及水平见表1。
表1 Plackett-Burman试验设计因素及水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design
编号 因素水平-1 1 X1X2X3X4X5X6初始pH值发酵温度/℃发酵时间/d乙醇添加量/%最佳碳源质量浓度/（g·L-1）最佳氮源质量浓度/（g·L-1）6 8 32 40 6 1 5 8 3 9 1.25 1.75
1.3.4 最陡爬坡试验
根据单因素试验及Plackett-Burman试验结果，选择对己酸产量具有显著影响的因素进行最陡爬坡试验，依据Plackett-Burman试验获得的回归系数确定因素的步移方向和步长进行最陡爬坡试验，以确定响应面的中心点。
1.3.5 Box-Behnken试验
根据Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验结果，确定无水乙酸钠质量浓度（A）、乙醇添加量（B）、初始pH值（C）为影响己酸产量的3个主要因素，以己酸产量（Y）为响应值，采用Box-Behnken试验设计3因素3水平的响应面试验，试验设计因素及水平见表2。
表2 Box-Behnken试验设计因素及水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
编号 因素-1水平0 1 ABC无水乙酸钠质量浓度/（g·L-1）乙醇添加量/%初始pH值516 727 938
1.3.6 己酸产量测定
己酸菌液中的己酸采用GC-MS进行测定，样品的前处理及测定条件参考郭莹等[17]的方法。
1.3.7 数据处理
使用Excel 2021进行数据整理，使用SPSS 27.0软件统计试验数据，采用one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，并用Duncan氏法进行组间多重比较，使用Origin 2024软件制图，利用Design-Expert 13.0进行Plackett Burman和Box-Behnken试验设计和分析。
不同培养条件对己酸产量的影响见图1。pH值对细菌的影响是多方面的，包括酶的活性、细胞的通透性和电荷状态、营养物质的解离和吸收、细菌的形态和代谢途径以及生存和繁殖等方面[18]。选择合适的初始pH值来促进细菌的生长和代谢是培养条件优化的关键环节之一。
图1 不同培养条件对己酸菌液中己酸产量的影响
Fig.1 Effect of different culture conditions on production of caproic acid in caproic acid bacteria liquid
由图1（A）可以看出，低初始pH值下的己酸产量较低，这可能是因为过酸的环境不适合菌株生长。在初始pH值为3～7时，己酸产量随pH值的升高而增加；当pH值达到7时，己酸产量达到最大值3.54 g/L。然而，初始pH值＞7时，己酸产量会随之降低。因此，最适初始pH值被确定为7。
发酵温度对微生物的影响是多方面的，这些影响直接关系到微生物的生长、代谢合成以及发酵过程的整体效率[19]。不同微生物的最适生长温度都不同，适宜的发酵温度有利于微生物生长繁殖[20]。由图1（B）可知，当发酵温度为12～44 ℃时，己酸产量随发酵时间的上升而逐渐升高，当发酵温度为36 ℃时，己酸产量最高，为3.56 g/L；当发酵温度＞36 ℃时，己酸产量随温度的升高而逐渐下降。因此，最适发酵温度为36 ℃。
发酵时间对己酸菌的影响显著，不同发酵时间会影响己酸菌的生长、代谢以及最终产物产量，适当地延长发酵时间有助于提高乙醇或己酸的产量[21]。由图1（C）可知，随着发酵时间进行，在发酵前3天己酸产量上升缓慢，发酵3～4 d，己酸产量第一次迅增，4～5 d己酸产量缓慢增加，发酵5～7 d己酸产量第二次迅增并在第7天达到最大值3.46 g/L；而后随着发酵时间的增加，己酸产量趋于稳定。因此，最适发酵时间为7 d。
乙醇在己酸菌培养基中起到了重要的营养作用。乙醇不仅是己酸菌生长所需的营养成分之一，还能在一定浓度条件下促进己酸菌的生长[22]。过高的乙醇浓度可能导致细胞死亡，因此，虽然乙醇对己酸菌的生长有益，但必须控制在适宜的浓度范围内，以避免对己酸菌造成不利影响[23]。由图1（D）可知，随着乙醇添加量的升高，己酸产量迅速上升，并在乙醇添加量为2%时达到最大值3.49 g/L，而后随着乙醇添加量的增加己酸产量逐渐下降。因此，最适乙醇添加量为2%。
碳源是微生物生长代谢所必需的营养物质之一，它不仅为微生物提供了生命活动所需的能量，还构成了细胞的框架[24]。微生物通过各种代谢途径，将碳源转化为丙酮酸、草酰乙酸等中间产物，进而合成蛋白质和氨基酸[25]。不同种类的碳源可以显著影响微生物的生长速度、细胞产量以及代谢产物的多样性[26]。由图1（E）可知，当以可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖为碳源时，己酸产量处于较低水平，当以无水乙酸钠为碳源时，己酸产量最高，为3.38 g/L，显著高于其他3种碳源（P＜0.05）。因此，确定无水乙酸钠为己酸菌液的最优碳源。微生物的生长离不开适量的碳源与氮源，这些营养物质若含量过低会阻碍微生物的生长，而含量过高又可能触发反馈抑制机制，影响生长效果[27]。通过观察图1（F）可知，在无水乙酸钠的质量浓度介于1～7 g/L的区间内，己酸的产量呈现逐步增长的趋势；当无水乙酸钠质量浓度为7 g/L时，己酸产量最高，为4.52 g/L；当无水乙酸钠质量浓度继续升高时，己酸产量开始降低。因此，最适无水乙酸钠质量浓度为7 g/L。
氮源作为微生物生长与代谢活动中不可或缺的关键要素，其种类与品质深刻影响着微生物的增殖速率及代谢过程的复杂性[28]。具体而言，有机氮源，诸如蛋白质与肽类，因富含多样化的营养物质，能够向微生物提供更为全面且均衡的营养支持，从而促进其生长与代谢活动的蓬勃进行。相较之下，无机氮源，如铵盐、硝酸盐等，尽管能够满足微生物的基本氮素需求，但在特定条件下，其营养供给的丰富度与有效性可能不及有机氮源，从而在一定程度上限制了微生物的生长潜力和代谢效率[29]。不同的氮源对微生物的生长和代谢产生不同的影响。如图1（G）所示，当以蛋白胨作为氮源时，己酸产量较低；而使用牛肉浸粉和黄豆饼粉时，己酸产量分别为3.36 g/L和3.24 g/L。使用酵母浸粉作为氮源时，己酸产量为3.65 g/L，显著高于酵母浸粉和黄豆饼粉（P＜0.05）。因此，最佳氮源为酵母浸粉。从图1（H）可以看出，当酵母浸粉质量浓度在0.25 g/L至1.50 g/L之间时，己酸产量随着浓度的增加而上升；在1.50 g/L时，己酸产量达到最高，为3.62 g/L。然而，超过1.50 g/L后，己酸产量开始下降。因此，最适酵母浸粉质量浓度为1.50 g/L。
为了从多个因子中筛选出对己酸产量影响显著的因子，在单因素试验的基础上，进行Plackett-Burman试验，试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments
试验号 X1 X2 X3 X4 X5 X6 己酸产量/（g·L-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1-1 1-1 1-1-1-1 1 1 --1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 -1 1 1 --1-1-1-1 1 1 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1-1-1 11 12 1 1-1-1 1 1 1 -1 1 1 -1-1-1 1-1-1-1-1 2.06 2.56 0.95 1.34 2.32 0.76 2.26 1.46 1.58 0.84 1.92 1.04
表4 Plackett-Burman试验方差分析结果
Table 4 Variance analysis results of Plackett-Burman experiments
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。下同。
编号 因素 低水平水平 系数 F 值 P 值 显著性高重要性排序模型初始pH值发酵温度/℃发酵时间/d乙醇添加量/%无水乙酸钠质量浓度/（g·L-1）酵母浸粉质量浓度/（g·L-1）32.99 7.39 1.37 6.15 44.18 133.80 5.03 0.000 7 0.041 9 0.294 5 0.055 8 0.001 2 0.000 1 0.075 0**X1 6 8 X2 32 40 X3 X4 X5 61 5 83 9** *X6 1.251.75 0.114 2 0.049 2 0.104 2-0.279 2 0.485 8 0.094 2 3642 1 5
由表3及表4可知，模型极显著（P＜0.01），决定系数R2=0.975 4，调整决定系数R2adj=0.945 8，预测决定系数R2pre=0.858 1，表明该模型的拟合度较好。各因素对己酸菌液中己酸产量的影响不同，由各因素的P值可知，影响的先后顺序为X5＞X4＞X1＞X3＞X6＞X2。其中X5（无水乙酸钠质量浓度）、X4（乙醇添加量）、X1（初始pH值）对己酸产量影响显著（P＜0.05），且X4对己酸产量的影响是负效应，X1、X5对己酸产量的影响是正效应。因此，选择X1、X4和X5进行最陡爬坡试验，其他非显著因素以单因素试验结果确定最佳水平，即发酵温度36 ℃，发酵时间7 d，酵母浸粉质量浓度1.5 g/L。
为了接近最佳的碳源质量浓度、乙醇添加量和初始pH的响应中心点，基于Plackett-Burman试验所得结果，设计了最陡爬坡试验，具体的设计方案及试验结果见表5。由表5的可知，在试验号2所设定的培养条件下，己酸的产量达到了峰值，为4.98 g/L。故以试验号2的培养条件为深入优化的中心点。
表5 最陡爬坡试验设计及结果
Table 5 Design and results of the steepest climbing experiment
试验号无水乙酸钠质量浓度/（g·L-1）乙醇添加量/%初始pH值己酸产量/（g·L-1）123 579 321 678 1.68 4.98 3.21
2.4.1 模型建立及显著性检验
在Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验的基础上，以己酸产量（Y）为响应值，无水乙酸钠质量浓度（A）、乙醇添加量（B）及初始pH（C）为考察因素，设计Box-Behnken试验，其采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析以寻求最优工艺参数，试验设计方案及结果见表6。试验共有17个试验点，其中试验号1～12为析因试验，13～17为中心试验，重复5次，用以估计试验误差。
表6 Box-Behnken试验设计及结果
Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments
试验号A 无水乙酸钠质量浓度/（g·L-1）B 乙醇添加量/%C 初始pH值Y 己酸产量/（g·L-1）1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 59595959777777777 11332222131322222 77776688668877777 2.69 3.49 2.31 2.71 1.89 2.38 2.39 3.19 2.54 2.14 2.95 2.16 5.11 4.89 4.94 4.97 5.02
利用Design-Expert软件对表6结果进行多元回归拟合分析，得到己酸产量（Y）对无水乙酸钠质量浓度（A）、乙醇添加量（B）和初始pH（C）的多元二次回归方程：Y=-85.400 98+3.781 175A+5.152 95B+20.281 2C-0.050AB+0.038 75AC-0.099BC-0.271 2A2-1.100 8B2-1.438 3C2。
由表7可知，模型的显著性非常高（P＜0.01），而失拟项则不显著（P＞0.05），这表明模型具有可靠性。决定系数R2为0.994 6，调整后的决定系数R2adj为0.987 6，预测决定系数R2pre为0.930 9，调整决定系数与预测决定系数的差值小于0.2，说明模型的精确度高且误差小，预测值与实际值之间的拟合度良好，能够有效预测菌液中的己酸产量。根据P值，影响结果的显著因素包括一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2（P＜0.05），而交互项AB、AC、BC则不显著（P＞0.05）。根据F值，影响菌液中己酸产量的因素主次顺序为A（无水乙酸钠质量浓度）＞B（乙醇添加量）＞C（初始pH值）。
表7 回归模型方差分析
Table 7 Variance analysis of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型**ABCA B AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和22.87 0.775 0 0.688 0 0.381 1 0.040 0 0.024 0 0.039 2 4.95 5.10 8.71 0.124 9 0.096 6 0.028 3 22.99 911 11111117341 6 2.54 0.775 0 0.688 0 0.381 1 0.040 0 0.024 0 0.039 2 4.95 5.10 8.71 0.017 8 0.032 2 0.007 1 142.41 43.44 38.56 21.36 2.24 1.35 2.20 277.72 285.98 488.21 0.000 1 0.000 3 0.000 4 0.002 4 0.178 0 0.283 9 0.181 8 0.000 1 0.000 1 0.000 1*** ******
2.4.2 因素间交互作用对己酸产量的影响
根据回归分析结果，各因素及因素相互之间的交互作用对己酸产量的影响见图2。
图2 各因素间交互作用对己酸菌液中己酸产量影响的响应面和等高线
Fig.2 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the yield of caproic acid in caproic acid bacteria liquid
由图2可知，己酸产量在同一椭圆形区域内保持一致，其中椭圆中心的产量最高，向边缘扩散时产量逐渐降低[30]。此外，等高线的形状能够揭示因素间交互效应的强弱程度：具体而言，若等高线呈现椭圆形，则意味着两个因素之间的交互作用较为显著；相反，若等高线接近圆形，则表明这两个因素之间的交互作用不显著[31]。随着各因素水平的增加，产量的变化趋势也随之变化。己酸产量先上升后下降，拟合曲线均为凸形，有最大值。无水乙酸钠质量浓度和乙醇添加量（AB）的交互作用对己酸产量影响最大、最佳碳源质量浓度和初始pH（AC）的交互作用影响其次，乙醇添加量和初始pH（BC）的交互作用对己酸产量影响最弱，但各因素交互作用对己酸产量的影响均不显著，与表7的方差结果一致。
2.4.3 培养条件优化及模型验证
利用Design-Expert 13.0软件对多元二次回归方程进行求解，以确定己酸菌液产生己酸的最佳培养条件，最终得出的优化结果为：无水乙酸钠质量浓度8.16 g/L、乙醇添加量1.83%、初始pH值为7.10，基于上述条件，预测己酸的产量理论值可达4.84 g/L。为了便于实际操作，将培养条件调整为无水乙酸钠的质量浓度8 g/L，乙醇的添加量2%，初始pH值为7.0。在此培养条件下，重复进行了3次平行验证试验，测得己酸的平均实际产量为4.90 g/L，该数值与预测值非常接近，从而验证了该模型的可行性和准确性。
本研究以己酸菌液为试验材料，以己酸产量为考察指标，通过单因素试验对己酸菌液的初始pH值、培养温度、培养时间、乙醇添加量和碳、氮源种类及其最佳碳、氮源质量浓度进行初步优化。然后通过Plackett-Burman试验设计，从6个单因素试验中筛选出显著影响己酸产量的3个因素，分别为初始pH值、乙醇添加量、无水乙酸钠质量浓度，同时也确定了对己酸产量无显著影响的3个培养条件。再利用最陡爬坡试验确定这3个显著影响因素的最大响应区域，通过Box-Behnken试验确定己酸菌液的最佳培养条件为：无水乙酸钠8.0 g/L，酵母浸粉1.5 g/L，乙醇添加量2%，初始pH 7，发酵温度36 ℃，发酵时间7 d。在此优化条件下，己酸产量能达到4.90 g/L，是优化前的1.40倍。后续将该菌液应用于人工窖泥的培养中，研究该菌液对人工窖泥品质的影响，将生产的人工窖泥应用于酿酒过程中，以研究其对白酒品质的影响，从而为提升人工窖泥的质量和改善白酒品质提供理论支持和实践依据。
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