Optimization of fermentation technology and anti-fatigue characteristics of sea buckthorn-passion fruit compound beverage
沙棘（Hippophae rhamnoides）是胡颓子科沙棘属，在我国青海省大量种植[1-2]。沙棘果含有丰富的营养物质和活性物质，特别是维生素C的含量高达800～1 100 mg/100 g，是猕猴桃的2～3倍，素有维生素C之王的称号[3-5]，具有抗菌消炎、抗疲劳、降低胆固醇、抗氧化等[6-8]功效。百香果（Passiflora edulis）是西番莲科西番莲属多年生攀援藤本植物[9]，是我国新进引入并列为广东名优稀水果品种[10]。百香果富含包括人体必需的8种氨基酸在内的17种氨基酸和多种维生素，具有消除疲劳、降脂降压、延缓衰老等[11-14]功效。目前沙棘果和百香果常用于饮料或酸奶的生产[15-16]，因其具有特殊的香气从而收到消费者的喜爱，但鲜有酿酒酵母和乳酸菌混合发酵的饮料。
乳酸菌是一种能够利用可发酵性糖转化产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的统称，是人体肠道中的益生菌，常见的乳酸菌有植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）等[17-18]。尤其是植物乳杆菌具有维持肠道微生态平衡、转化营养大分子物质、促进胃肠对营养物的吸收、提高机体免疫力等功效，目前已被广泛应用于果蔬、乳制品、肉类、酒类等食品的发酵加工[19-20]。酿酒酵母发酵过程中能产生多种酶类和香气，增加发酵产品的营养，常用于面制品、乳制品、果熟制品的生产[17]。已有报道关于乳酸菌和酿酒酵母混合发酵在馒头、食用菌、马铃薯渣、果酒等产品中的应用[21-22]，所以混菌发酵可以用于复合果汁的生产。
本研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）（1∶1）为发酵菌种制备沙棘百香果复合饮料。以感官评定和力竭跑步时间为指标，采用单因素和响应面试验优化其发酵工艺，并对其抗疲劳特性进行研究。旨在促进沙棘和百香果深加工，为抗疲劳饮料的开发提供理论依据。
1.1.1 材料和菌株
沙棘、百香果、木糖醇、安琪酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：购于电商；植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）（GenBank No.MN784485）：保藏于农产品精深加工河南省工程技术研究中心；无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级小鼠[（20±2）g/只，实验动物生产许可证号SCXK（豫）2023-0006）]：安阳市源首生物药业有限责任公司。
1.1.2 试剂
牛磺酸（颗粒剂型）（纯度99%）：广州华钰生物科技有限公司；肝/肌糖原检测试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）检测试剂盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司。
1.1.3 培养基
MRS液体培养基、MRS固体培养基、麦芽汁琼脂培养基：美国赛默飞公司。
CHDY-B恒温摇床：杭州川恒实验仪器有限公司；ZH-PT/5S动物实验跑台：安徽正华生物仪器设备有限公司；B28恒温生化培养箱：宾德环境试验设备（上海）有限公司；TDLX-500螺旋榨汁机：曲阜同达机械设备有限公司；HJ-6DS恒温水浴锅：常州金坛良友仪器有限公司；KJZ-A均质机：广东汇京智能装备有限公司。
1.3.1 植物乳植杆菌及酿酒酵母的活化
将保存的植物乳植杆菌用稀释涂布平板法对菌株进行初步筛选，选择形态正常的菌落接种到MRS固体培养基中，置于37 ℃下恒温培养24 h至菌落生成，从MRS固体培养基中挑出单菌落放入MRS液体培养基中，以37 ℃恒温培养18～20 h，完成植物乳植杆菌活化[23]。
酿酒酵母的活化：将干酵母溶于无菌水中，置于35 ℃搅拌溶解，静置15 min，酵母开始乳化，再次搅拌，静置15 min，完成酿酒酵母活化。
1.3.2 沙棘百香果复合饮料的加工工艺流程及操作要点
操作要点：
沙棘汁、百香果汁制备：分别挑选完好无损的沙棘果和百香果，沙棘果洗净，百香果去壳分别置于榨汁机中榨汁，过滤除去籽粒得到沙棘汁和百香果汁。
均质：按照一定的比例混合沙棘、百香果汁，得到复合果汁。在复合果汁中添加6%的木糖醇，加热至70 ℃，在40 MPa条件下进行均质。
灭菌：将沙棘百香果复合果汁加热至85 ℃，灭菌15 min。
接菌发酵：在均质灭菌后复合果汁中接入试验所需体积的活化植物乳植杆菌和酿酒酵母（1∶1），置于一定温度恒温发酵试验所需时间，当复合果汁中不产生气体即可判定发酵结束。
灭菌：将复合果汁过滤后加热至85 ℃灭菌15 min。
灌装：灭菌后复合果汁无菌灌装，即得沙棘百香果复合饮料成品。
1.3.3 沙棘百香果复合饮料发酵工艺优化（1）单因素试验
发酵温度的确定：以沙棘百香果复合果汁体积为基准，混菌接种量5%，木糖醇添加量6%，沙棘果汁与百香果汁体积比1∶1，发酵时间14 h，分别考察发酵温度28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃对沙棘百香果复合饮料感官评分和小鼠力竭跑步时间的影响。
发酵时间的确定：以沙棘百香果复合果汁体积为基准，混菌种量5%，木糖醇添加量6%，沙棘果汁与百香果汁体积比1∶1，发酵温度34 ℃，考察发酵时间10 h、12 h、14 h、16 h、18 h对沙棘百香果复合饮料感官评分和小鼠力竭跑步时间的影响。
混菌接种量的确定：以沙棘百香果复合果汁体积为基准，木糖醇添加量6%，沙棘果汁与百香果汁体积比1∶1，发酵时间14 h，发酵温度34 ℃，考察混菌（1∶1）接种量3%、4%、5%、6%、7%对沙棘百香果复合饮料感官评分和小鼠力竭跑步时间的影响。
沙棘果汁与百香果汁体积比的确定：以沙棘百香果复合果汁体积为基准，混菌接种量5%，木糖醇添加量6%，发酵时间14 h，发酵温度34 ℃，考察沙棘果汁与百香果汁体积比1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1对沙棘百香果复合饮料感官评分和小鼠力竭跑步时间的影响。
（2）响应面试验
在单因素试验基础上，选择对结果影响较大的发酵温度（A）、混菌接种量（B）、沙棘果汁与百香果汁体积比（C）为自变量，以沙棘百香果复合饮料感官评分（Y1）和小鼠力竭跑步时间（Y2）为响应值，进行3因素3水平响应面试验，Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation technology optimization
水平 A 发酵温度/h B 混菌接种量/% C 沙棘果汁与百香果汁体积比-1 0 1 31 34 47 4 5 6 1∶2 1∶1 2∶1
1.3.4 感官评价
沙棘百香果复合饮料感官评价参照GB 7101—2022《食品安全国家标准饮料》和GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》，再结合沙棘和百香果本身感官特性、乳酸菌发酵风味，从色泽、香气、口感、组织状态4方面进行评价，满分100分，感官评分标准见表2。
表2 沙棘百香果复合饮料感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of sea buckthorn-passion fruit compound beverage
项目 评价标准 评分/分色泽（20分）香气（30分）口感（35分）组织状态（15分）橙黄色，色泽均匀，有光泽淡黄色，色泽均匀，带有少量浑浊颜色偏深或偏浅，不透明，有浑浊具有酵母和乳酸菌发酵香味，沙棘和百香果香味突出具有酵母和乳酸菌发酵香味，香气稍淡，稍有杂味有刺激味，有令人不悦气味口感较好，细腻柔和，酸甜适中，有沙棘和百香果滋味口感较好，较为细腻，偏酸或偏甜，不协调口感粗糙，无发酵酸味，有明显异味质地均匀细腻，没有杂质，没有分层质地较均匀细腻，略稀，有少许沉淀组织粗糙，略稀，分层严重15～20 10～14 0～9 20～30 10～19 0～9 25～35 11～24 0～10 10～15 5～9 0～4
1.3.5 小鼠饲养及试验分组
取120只体质量为（20±2）g SPF小鼠在室温23～25 ℃，相对湿度50%～60%的条件下常规饮食饲养一周。然后将小鼠随机分为40组，每组3只，分别是空白组、对照组（3 g/L牛磺酸溶液）、验证组、试验组（37组，其中20组用于单因素试验，17组用于响应面试验）。空白组灌胃蒸馏水，其他组按照0.1 mL/（10 g小鼠体质量）对小鼠进行连续灌胃，对照组灌胃牛磺酸，验证组和试验组灌胃沙棘百香果复合果汁饮料，每天固定时间喂食1次，连续喂食30 d[24-26]。此外，每天对小鼠进行30 min适应性跑步训练。
1.3.6 力竭跑步试验
采用动物实验跑台对不同组别喂食30 d后的小鼠进行力竭跑步试验，条件设置如下：跑速20 m/min，电击耐受时间3 s，刺激电流1.5 mA，试验台设置难度为中，记录小鼠力竭跑步所用时间[27]。小鼠力竭跑步时间越长，说明其抗疲劳活性越强。
1.3.7 疲劳相关指标测定
疲劳相关指标包括糖原、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等[28-29]，测定方法参照检测试剂盒说明进行操作。
1.3.8 数据分析
试验结果以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 22.0软件进行方差分析，P＜0.05表示差异显著。
各因素对沙棘百香果复合饮料感官评价及小鼠力竭跑步时间的影响结果见图1。
图1 发酵温度（a），发酵时间（b），接种量（c）及沙棘果汁与百香果汁体积比（d）对沙棘百香果复合饮料感官评分和小鼠力竭跑步时间的影响
Fig.1 Effects of fermentation temperature (a), time (b), inoculum (c)and volume ratio of sea buckthorn juice and passion fruit juice (d) on sensory scores of sea buckthorn-passion fruit compound beverage and mice exhaustion running time
由图1a可知，发酵温度为28～34 ℃时，随着发酵温度的升高，感官评分和小鼠力竭跑步时间逐渐升高；当发酵温度为34 ℃时，感官评分、小鼠力竭跑步时间达到最大值，分别为83分和132 s；当发酵温度＞34 ℃之后，导致饮料产生不良风味，感官评分开始下降，小鼠力竭跑步时间趋于平稳。因此，选择最适发酵温度为34 ℃。
由图1b可知，发酵时间为10～14 h时，随着发酵时间的延长，感官评分和小鼠力竭跑步时间随之逐渐升高和延长；当发酵时间为14 h时，感官评分和小鼠力竭跑步时间较高，分别为86分和131 s；当发酵时间＞14 h之后，感官评分和小鼠力竭跑步时间逐渐下降，但整体变化趋势不明显。因此，选择最适发酵时间为14 h。
由图1c可知，当接种量为3%～5%时，随着接种量的增加，感官评分和小鼠力竭跑步时间随之逐渐升高和延长；当接种量为5%时，感官评分和小鼠力竭跑步时间达到最大值，分别为85分和135 s；当接种量＞5%之后，感官评分和小鼠力竭跑步时间趋于平稳。因此，选择最适接种量为5%。
由图1d可知，沙棘果汁和百香果汁体积比为1∶3～3∶1时，随着沙棘果汁体积增加，感官评分和小鼠力竭跑步时间逐渐升高和延长；当沙棘果汁和百香果汁体积比为1∶1时，感官评分和小鼠力竭跑步时间达到最大值，分别为86分和132 s；当沙棘果汁体积继续增加，感官评分和小鼠力竭跑步时间均有降低的趋势。因此，选择最适沙棘果汁和百香果汁体积比为1∶1。
2.2.1 响应面设计及回归模型建立
根据单因素试验结果，发酵时间对感官评分和小鼠力竭跑步时间影响较小，因此，固定发酵时间为14 h，以发酵温度（A）、接种量（B）、沙棘果汁与百香果汁体积比（C）为自变量，以感官评分（Y1）和小鼠力竭跑步时间（Y2）为响应值，进行3因素3水平响应面优化试验。响应面试验结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization
试验号 A B C Y1感官评分/分Y2小鼠力竭跑步时间/s 1234567891 0 0 0 0 -1 1 -0 1 0 -0 1 0 0 -1 1 1 0 -1 00 --1 0-1 11 12 13 14 15 16 17 1 0 0 0 1 1 0 0 -1 1100 0-1 1 0 0 -10 0 -11 101010 86.11±4.92 73.60±4.51 87.14±3.56 73.52±4.12 77.71±3.34 79.86±4.52 71.44±2.15 79.97±2.87 75.61±4.34 89.28±5.41 88.26±4.82 81.94±3.45 68.22±3.48 73.57±2.76 85.06±3.44 75.63±3.65 71.24±2.82 126.1±4.6 108.6±5.3 129.4±4.2 107.6±4.8 116.2±6.2 121.5±3.7 95.2±5.9 120.4±5.1 111.6±2.6 138.5±4.3 136.7±3.1 125.2±3.8 92.3±5.2 108.2±4.2 124.6±6.3 112.2±5.8 96.5±6.4
表4 以感官评分和小鼠力竭跑步时间为响应值的回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model using sensory evaluation and mice exhaustion running time as response values
注：*为显著差异（P＜0.05）；**为极显著差异（P＜0.01）。下同。
方差来源模型ABCA B AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总异变Y1/Y2平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性686.77/2 845.09 10.79/80.01 11.28/62.72 55.49/227.91 0.220 9/16.81 0.003 0/0.90 0.000 9/0.36 310.05/1 317.99 235.82/1 007.34 15.22/4.27 13.90/173.92 2.69/17.67 11.22/156.25 700.68/3 019.02 9/9 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 7/7 3/3 4/4 16/16 76.31/316.12 10.79/80.011 11.28/62.72 55.49/227.91 0.220 9/16.81 0.003 0/0.90 0.000 9/0.36 310.05/1 317.99 235.82/1 007.34 15.22/4.27 1.99/24.85 0.895 1/5.89 2.80/39.06 38.42/12.72 5.43/3.22 5.68/2.52 27.94/9.17 0.111 2/0.67 0.001 5/0.04 0.000 5/0.01 156.12/53.04 118.74/40.54 7.66/0.17＜0.000 1/0.001 0 0.052 6/0.115 8 0.048 6/0.156 1 0.001 1/0.019 1 0.748 5/0.437 8 0.970 0/0.854 2 0.983 6/0.907 5＜0.000 1/0.000 1＜0.000 1/0.000 3 0.027 8/0.690 7**/*****/***/****/***0.319 2/0.15 0.812 4/0.923 9不显著/不显著
通过Design-Expert 8.0.6软件分析表3数据，分别得到以感官评价和小鼠力竭跑步时间为响应值的多元二次回归方程如下：
由表4可知，模型P值＜0.01，该模型极显著，失拟项P值＞0.05，表明该模型方程与实际值拟合度良好，模型决定系数R2分别为0.980 2、0.942 4，调整决定系数R2adj分别为0.954 6、0.868 3。由P值可知，一次项C，二次项A2、B2对感官评分影响极显著（P＜0.01），一次项B、二次项C2对感官评分影响显著（P＜0.05），其他项对感官评分影响不显著（P＞0.05）。二次项A2、B2对小鼠力竭跑步时间影响极显著（P＜0.01），一次项C对小鼠力竭跑步时间影响显著（P＜0.05），其他项影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对感官评分影响顺序为沙棘果汁与百香果汁体积比（C）＞接种量（B）＞发酵温度（A）；各因素对小鼠力竭跑步时间影响程度为沙棘果汁与百香果汁体积比（C）＞发酵温度（A）＞接种量（B）。
2.2.2 各因素交互作用对结果影响的响应面分析
各因素交互作用对感官评价和小鼠力竭跑步时间影响的响应面及等高线见图2。由图2可知，两因素交互作用对结果影响的响应面坡度越陡峭，等高线越接近椭圆形，表明二者交互作用对结果影响越显著；反之，两因素交互作用对结果影响的响应面坡度越平缓，等高线越接近圆形，表明二者交互作用对结果影响越不显著。由图2可知，发酵温度与接种量交互作用对感官评分和小鼠力竭跑步时间影响均最强，但各因素交互作用对结果影响均不显著。这与表4方差分析结果一致。
图2 各因素交互作用对感官评分（A）和小鼠力竭跑步时间（B）影响的响应面及等高线
Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory score (A) and mice exhaustion running time (B)
2.2.3 最佳发酵工艺确定
利用Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析得到沙棘百香果复合饮料最佳发酵工艺条件为：发酵温度33.74 ℃，接种量4.91%，沙棘果汁与百香果汁体积比1∶1。在此条件下感官评分预测值为87.98分，小鼠力竭跑步时间预测值为137.8 s。为方便实际操作，将发酵工艺条件修正为发酵温度34 ℃，接种量5%，沙棘果汁与百香果汁体积比1∶1。在此优化条件下，进行3次平行验证试验，感官评分实际值为（87.65±3.12）分，小鼠力竭跑步时间实际值为（138.1±3.5）s，与预测值较为接近。因此，利用该模型优化沙棘百香果复合饮料发酵工艺可行。
糖原是肌肉的主要能量来源，当糖原不足时，会在运动过程中降低身体多余能量和脂肪的消耗，而且延缓肌肉修复时间，增加肌肉疲劳的产生[30]。沙棘百香果复合发酵饮料对力竭跑步小鼠肌糖原和肝糖原含量的影响结果见图3。由图3可知，对照组和验证组力竭跑步小鼠肌糖原和肝糖原含量显著高于空白组（P＜0.05），肌糖原含量分别提高了58.9%和58.7%，肝糖原含量分别提高了53.18%和43.11%。验证组和对照组相比，力竭跑步小鼠肌糖原含量的影响不显著（P＞0.05），但对肝糖原含量的影响显著（P＜0.05）。结果表明，沙棘百香果复合发酵饮料能显著提高力竭跑步小鼠力肌肉和肝脏组织中的糖原含量，从而提高其机体的抗疲劳能力。
图3 沙棘百香果复合饮料对力竭跑步小鼠肌肉和肝脏糖原积累的影响
Fig.3 Effects of sea buckthorn-passion fruit compound beverage on glycogen accumulation in muscle and liver of exhausted running mice
当机体进行高强度的运动时，肌肉会产生大量的乳酸引起疲劳反应，乳酸脱氢酶（LDH）可以将乳酸转化为能量，起到清除血液中乳酸的作用，从而减缓疲劳的产生，而过氧化氢酶（CK）会在高强度运动时释放到血液中，增加血清中CK活性，因此，CK活性越高说明机体越处于疲劳状态[31]。由图4可知，对照组和验证组力竭跑步小鼠LDH活性均显著高于空白组（P＜0.05），分别提高了64.7%和58.2%，对照组和验证组力竭跑步小鼠LDH活性有显著差异（P＜0.05）。对照组和验证组CK活性均显著低于空白组（P＜0.05），分别降低了49.5%和48.8%，但对照组和验证组相比CK活性无显著差异（P＞0.05）。结果表明，沙棘百香果复合发酵饮料能显著提高力竭跑步小鼠LDH活性，降低CK活性，加快乳酸的清除，使力竭跑步小鼠的抗疲劳能力得到提高。
图4 沙棘百香果复合饮料对力竭跑步小鼠乳酸脱氢酶和过氧化氢酶活性的影响
Fig.4 Effects of sea buckthorn-passion fruit compound beverage on lactate dehydrogenase and catalase activities of exhausted running mice
SOD、CAT、GSH-Px是评价肝脏抗氧化的主要指标[32]。沙棘百香果复合发酵饮料对力竭跑步小鼠肝脏抗氧化指标影响结果见图5。由图5可知，对照组和验证组SOD、CAT和GSH-Px活性均显著高于空白组（P＜0.05），活性分别提高了54.9%、55.9%；133.3%、138.8%；81.1%、88.2%，但对照组和验证组之间无显著差异（P＞0.05）。结果表明，沙棘百香果复合发酵饮料具有较强的抗氧化活性，能够提高力竭跑步小鼠抗疲劳能力。
图5 沙棘百香果复合饮料对力竭跑步小鼠肝脏抗氧化指标的影响
Fig.5 Effects of sea buckthorn-passion fruit compound beverage on liver antioxidant indexes of exhausted running mice
本研究以沙棘和百香果为原料，利用酿酒酵母和植物乳杆菌混合（1∶1）发酵制备沙棘百香果复合饮料。通过单因素和响应面试验得出最佳发酵工艺为：发酵温度34 ℃，混菌接种量5%，沙棘果汁与百香果汁体积比1∶1，发酵时间14 h，木糖醇添加量6%。在此优化发酵工艺条件下，沙棘百香果复合饮料色泽均匀透亮，香气浓郁，具有沙棘和百香果的复合香气，酸甜可口，感官评分为（87.65±3.12）分，小鼠力竭跑步时间为（138.1±3.5）s。沙棘百香果复合饮料喂食力竭跑步小鼠后体内肌糖原和肝糖原含量分别提高了58.7%和43.1%，乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性均提高50%以上，肌酸激酶活性降低了48.8%，从而提高小鼠疲劳恢复速度，具有较强的抗疲劳能力。但关于沙棘百香果复合发酵饮料抗疲劳有效成分及其抗疲劳机制未进行深入研究，仍需进一步阐明。
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