紫山药（purple Dioscorea oppositifolia L.）是薯蓣科薯蓣属多年生草本植物，又称“紫人参”、脚板薯[1]。不仅富含大量蛋白质、维生素、氨基酸[2]，还含有抗氧化能力较强的花青素、薯蓣皂苷、尿囊素、酚酸、凿族皂角苷等微量功能性成分[3]，因而有降血压、滋肺益肾、增强免疫力、促进新陈代谢、抗肿瘤突变等多种功能。紫山药虽营养丰富，但其储存条件较为严格，一旦储存不当，容易降低其营养价值，更严重的会造成腐烂发芽，因此适时开展紫山药加工技术研究尤为迫切。迄今为止，国内外关于紫山药的深加工产品开发较少，通常将紫山药作为辅料在日常食品中添加，如制作面包[4]、饼干[5-6]、酸奶[7]等食物，通过利用紫山药所含的营养成分，增强食品的附加值。
紫山药酒是以紫山药为原料，采用果酒加工工艺，经过微生物发酵酿造而成的发酵酒。其酿造是一个复杂的微生物代谢过程，品质受原料、菌种和发酵环境的影响，菌种是其中一关键因素[8]。传统植物类发酵多采用单一菌种，由此造成发酵液口感和风味相对单调[9-10]。为提高发酵液品质，近年来，许多研究者采用两种或两种以上微生物混合发酵植物原料，希望通过利用菌种间的协同增效作用，尽可能的改善发酵液的营养与风味等属性。通过研究发现，某些非酿酒酵母能够分泌更多如葡萄糖苷酶、果胶酶等胞外酶[11-12]，除此之外，这类非酿酒酵母还通过对果汁中营养底物的竞争消耗，产生多种风味物质，如醇类、酯类、酸类物质[13-14]。曾朝珍等[15]研究发现，德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合发酵的苹果酒中，β-葡萄糖苷酶和果胶酶酶活性值较单菌发酵均有显著的升高。刘宜睿等[16-17]均研究发现，相较于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）单菌发酵，非酿酒酵母的加入显著增加了挥发性物质的种类和含量，使果酒香气和口感更为丰富。然而，目前用非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵紫山药酒的应用研究尚少见。
该研究以紫山药为原料，在加入酿酒酵母的基础上再加入德尔布有孢圆酵母混合发酵制备紫山药酒，通过不同菌种的协同作用，以期提高发酵酒样中酯类、高级醇及有机酸含量，并增强抗氧化能力。旨在为下一步紫山药酒的产业化生产提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫山药：江西贵溪市售；蔗糖（分析纯）；高温α-淀粉酶（4×104 U/g）、糖化酶（5×105 U/g）：江苏博立生物制品有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）：国家菌种资源库；亚硫酸（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（纯度＞98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、没食子标准品、芦丁标准品（纯度均＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；羟自由基清除能力检测试剂盒、超氧阴离子自由基清除能力检测试剂盒：苏州格锐思生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
L18-P501破壁机：九阳股份有限公司；酒精计：武强县新林仪器仪表有限公司；752N型紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；Multiskan spectrum全波长酶标仪：美国赛默飞世尔科技公司；TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪仪器有限公司；1260高效液相色谱仪：美国Agilent科技有限公司；450GC-320MS气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）仪：美国布鲁克仪器公司。
1.3 方法
1.3.1 紫山药酒制备工艺流程及操作要点
紫山药挑选、清洗→蒸煮糊化→打浆→液化→糖化→调整成分→发酵→离心、陈酿→澄清→过滤→灭菌→紫山药酒
操作要点：挑选新鲜、完整无霉变紫山药，用水清净后去皮、切片。蒸制50～60 min后，将紫山药与饮用水按照质量比1∶3进行打浆。在浆料中加入α-淀粉酶（23 U/g），在pH=5.5，75 ℃的酶解条件下液化70 min后，冷却至50 ℃。用柠檬酸将pH调至4.5，再添加糖化酶（240 U/g）在55 ℃条件下糖化1 h。在糖化后的紫山药原浆中加入15%的白砂糖，并添加柠檬酸调整初始pH值为4.0～4.5。然后按1 mL/L的量加入6%亚硫酸后，接种酿酒酵母和德尔布有孢圆酵母至紫山药原浆中，接种量均为8%（悬浮液活菌数为107CFU/mL）。于23 ℃发酵10 d，离心（8 000 r/min）10 min后放置在8 ℃条件下陈酿2个月。再加入1%壳聚糖-3%皂土对紫山药酒进行澄清，过滤后80 ℃杀菌20 min即得到成品。
1.3.2 紫山药酒发酵工艺优化单因素试验
设置基础条件为蔗糖添加量15%，发酵温度23 ℃，发酵时间10 d。设置酿酒酵母接种量为2%、4%、6%、8%、10%，通过单因素试验优化后得出酿酒酵母的最适接种量后，依次考察德尔布有孢圆酵母接种量（1.6%、3.2%、4.8%、6.4%、8%）、蔗糖添加量（10%、15%、20%、25%、30%）、发酵温度（20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃）、发酵时间（6 d、8 d、10 d、12 d、14 d）对紫山药酒感官评分及酒精度的影响。
1.3.3 紫山药酒发酵工艺优化正交试验
在单因素试验基础上，以德尔布有孢圆酵母接种量（A）、蔗糖添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）4个因素作为考察因素，以酒精度和感官评分为考察指标进行4因素3水平正交试验，分析制备紫山药酒的最佳发酵条件，试验因素与水平见表1。
表1 紫山药酒发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for purple yam wine fermentation process optimization
水平 A 德尔布有孢圆酵母接种量/%B 蔗糖添加量/%C 发酵温度/℃D 发酵时间/d 1 2 3 4.8 6.4 8.0 15 20 25 23 26 29 8 10 12
1.3.4 紫山药酒感官评价
参照NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》制定紫山药酒的感官评分标准。挑选10名受过相关培训且具有感官评价经验的人员对外观、香气、口味三个方面进行评分，满分100分，结果取平均分。感官评分标准见表2。
表2 紫山药酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of purple yam wine
指标 评价标准 感官评分/分外观（30分）香气（30分）紫红色，清澈透明，有光泽玫红色至紫红色，略有浑浊，光泽度一般，稍微暗沉暗红色，悬浮物多，浑浊无光泽有典型的紫山药香气，酒香浓郁紫山药味突出，酒香较淡不协调紫山药特征香气不浓郁、有异味21～30 11～20 0～10 21～30 11～20 0～10
续表
指标 评价标准 感官评分/分口味（40分）酒体饱满、回味绵长，紫山药味协调平和口味较薄、无异味、有紫山药特征香气酸涩，有杂味26～40 10～25 0～10
1.3.5 紫山药酒理化指标的测定
酒精度：酒精计法测定；pH值测定：pH计法测定；总酸、总糖、总二氧化硫：分别采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法、指示剂法、氧化法测定；甲醇：采用GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》中的方法测定；花青素含量：参照DB22/T 2529—2016《紫穗玉米花青素测定分光光度法》中的方法测定；总多酚含量：参照王炬等[18-19]的方法测定。
1.3.6 紫山药酒抗氧化性的测定
取未发酵前紫山药原浆、酿酒酵母单菌发酵与混菌发酵的紫山药酒分别进行抗氧化性的测定；DPPH自由基清除率的测定：参照周映君等[20]的方法；羟基自由基（·OH）与超氧阴离子自由基清除能力测定：均使用试剂盒根据说明书进行测定。
1.3.7 紫山药酒有机酸成分分析
参照陈秋竹等[21]的测定方法，使用高效液相色谱法分析比较酿酒酵母单菌发酵与混菌发酵的紫山药酒中各有机酸的含量。
1.3.8 紫山药酒挥发性成分测定
挥发性成分测定采用气相色谱质谱联用仪，参照何静静等[22]的样品前处理方法，季明月等[23]的测定条件进行测定。
1.3.9 数据处理
采用SPSS 22.0和Excel 2013软件进行数据分析，Origin 8.5软件作图。每组试验均平行测定3次，结果用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 紫山药酒发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 酿酒酵母接种量的确定
由图1可知，随着接种量在2%～10%范围内的逐渐增大，紫山药酒的酒精度和感官评分呈先上升后下降的趋势，在接种量为8%时达到最高值，分别为10.4%vol和87.5分。当酿酒酵母接种量过少时，酵母生长繁殖时间延长，导致酒精度较低且易被污染；当酿酒酵母接种量＞8%之后，会消耗较多的糖用于自身生长繁殖，导致酒精产量降低，风味与口感下降。因此，确定酿酒酵母最佳接种量为8%。
图1 酿酒酵母接种量对紫山药酒品质的影响
Fig.1 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on the quality of purple yam wine
2.1.2 德尔布有孢圆酵母接种量的确定
由图2可知，当德尔布有孢圆酵母接种量逐渐增加时，感官评分先上升再下降，在接种量为6.4%时达到了最大值，为88.53分。而酒精度先不变后下降，且相对于酿酒酵母单菌发酵而言整体有所下降。当德尔布有孢圆酵母接种量较低时，由于酵母间营养物的竞争和酵母间的接触机制，使德尔布有孢圆酵母的生长受到抑制，对紫山药酒增香效果不大，因而感官评分不高。随着德尔布有孢圆酵母接种量的增加，感官评分逐渐升高，在德尔布有孢圆酵母接种量为6.4%时达到最大，但继续增加接种量后，德尔布有孢圆酵母会使酿酒酵母的生长受到抑制且会消耗部分糖类用于自身生长代谢，导致紫山药酒酒精度降低。因此，确定德尔布有孢圆酵母最佳接种量为6.4%。
图2 德尔布有孢圆酵母接种量对紫山药酒品质的影响
Fig.2 Effect of Torulaspora delbrueckii inoculum on the quality of purple yam wine
2.1.3 蔗糖添加量的确定
由图3可知，随着蔗糖添加量在10%～30%范围内的增加，紫山药酒的酒精度和感官评分呈先上升后下降的趋势，在蔗糖添加量为20%时到达最高值，分别为10.7%vol和86.9分。紫山药酒中的酒精主要是由糖类发酵转化而成，当蔗糖添加量过低时，会造成酒精量不足，口感不佳；而蔗糖添加量过高时，一方面会使发酵液渗透压过高，从而抑制酵母生长活性，另一方面会导致糖类过剩，发酵液口感偏甜，品质降低。因此，确定蔗糖最佳添加量为20%。
图3 蔗糖添加量对紫山药酒品质的影响
Fig.3 Effect of sucrose addition on the quality of purple yam wine
2.1.4 发酵温度的确定
由图4可知，随着发酵温度在20～32 ℃范围内的逐渐升高，紫山药酒的酒精度和感官评分呈先上升后下降的趋势，在发酵温度为26 ℃时到达最高值，分别为10.7%vol和86.11分。当发酵温度过低时，酵母生长繁殖受到抑制，造成酒精量不足，发酵液风味不协调；随着发酵温度的上升，酵母生长旺盛，当发酵温度＞26 ℃时，会使醇类、酯类等香气成分挥发，造成风味物质损失。因此，选择最佳发酵温度为26 ℃。
图4 发酵温度对紫山药酒品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of purple yam wine
2.1.5 发酵时间的确定
由图5可知，随着发酵时间在6～14 d的逐渐增长，紫山药酒的酒精度和感官评分呈先上升后下降的趋势，发酵时间为10 d时，感官评分取得最大值，为87.89分。而当发酵时间为12 d时，酒精度最高为9.2%vol，但此时紫山药酒口感轻微酸涩发苦。发酵时间太短，会导致糖类发酵不完全，发酵液口感发甜，紫山药风味不明显，且酒精度较低；发酵时间太长，酵母过度代谢产生不良风味，造成口感发酸发苦味。因此，选择最佳发酵时间为10 d。
图5 发酵时间对紫山药酒品质的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on the quality of purple yam wine
2.2 紫山药酒发酵工艺优化正交试验结果与分析
在单因素试验基础上，固定酿酒酵母接种量为8%，以德尔布有孢圆酵母接种量（A）、蔗糖添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为考察因素，以果酒感官评分为评价指标，进行L9（34）正交试验，试验结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 紫山药酒发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for purple yam wine fermentation process optimization
试验号 A 德尔布有孢圆酵母接种量/%B 蔗糖添加量/%C 发酵温度/℃D 发酵时间/d感官评分/分123456789k1 1（4.8）11 1（15）2（20）3（25）1（23）2（26）3（29）1（8）2（10）3（12）2（6.4）22 3（8）33 123123 231312 312231 85.8 90.3 86.6 78.1 86.2 84.7 82.8 88.3 80.5 k2 k3极差R主次顺序最佳组合87.57 83.00 83.87 4.6 82.23 88.27 83.93 6.0 86.27 82.97 85.20 3.3 84.17 85.93 84.33 1.8 B＞A＞C＞D A1B2C1D2
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results
因素 偏差平方和 自由度 F 比 F 临界值 显著性ABCD误差35.296 58.069 17.016 5.709 5.71 22222 6.183 10.171 2.981 1.000 9.000 9.000 9.000 9.000显著
由表3可知，各因素对紫山药酒影响的主次顺序为B＞A＞C＞D，即蔗糖添加量＞德尔布有孢圆酵母接种量＞发酵温度＞发酵时间，最佳发酵工艺为A1B2C1D2。即德尔布有孢圆酵母接种量4.8%，蔗糖添加量20%，发酵温度23 ℃，发酵时间10 d。由表4可知，因素B（蔗糖添加量）对感官评分影响显著（P＜0.05），这与直观分析结果是吻合的。在最佳条件下对试验结果进行验证，结果表明酿造的紫山药酒感官评分为92.0分，故确定最佳发酵工艺组合为A1B2C1D2。
2.3 紫山药酒理化指标检测结果
优化条件下制备的紫山药酒，酒液澄清透明，具有鲜亮的紫红色，无明显悬浊物与沉淀，且滋味醇香，有紫山药的特殊风味。由表5可知，紫山药酒各项理化指标均符合NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》要求，果酒花青素含量为185.00 mg/L，总酚含量达508.00 mg/L。
表5 紫山药酒理化指标测定结果
Table 5 Determination results of physicochemical indexes of purple yam wine
理化指标 检测结果 标准要求酒精度/%vol总糖/（g·L-1）总酸/（g·L-1）pH值总二氧化硫/（mg·L-1）甲醇/（g·L-1）花青素/（mg·L-1）总酚/（mg·L-1）10.30±1.05 22.00±0.89 4.93±0.13 4.03±0.02 101.81±0.92未检出（按100%酒精度折算）185.00±1.86 508.00±1.33 7～18 12.1～50（半甜型果酒）4.0～9.0≤250≤0.4
2.4 抗氧化性检测结果
由图6可知，经过发酵后紫山药酒各个自由基清除能力均有很大提升，其中超氧阴离子自由基清除率提高最多，与未发酵相比，单菌发酵与混菌发酵后分别提高了41.1%和52.3%。并且混菌发酵的DPPH自由基清除率（93.4%）与超氧阴离子自由基清除率（81%）均显著高于单菌发酵（88.5%与69.8%）（P＜0.05）；而混菌发酵的羟基自由基清除率（91.8%）与单菌发酵（90%）无显著差异（P＞0.05）。说明添加了非酿酒酵母德尔布有孢圆酵母后，紫山药酒的DPPH自由基及超氧阴离子自由基清除活性提高，导致抗氧化活性提高。这可能与非酿酒酵母在发酵前期分泌的胞外酶或一些蛋白质物质有关，这些物质能促进抗氧化物质的形成和积累[24]。
图6 紫山药酒抗氧化性测定结果
Fig.6 Determination results of antioxidant activity of purple yam wine
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.5 紫山药酒有机酸成分分析结果
有机酸是果酒中重要的基质成分，是丰富果酒口感的呈味基础[25]。由表6可知，混菌发酵紫山药酒中这几种有机酸含量均高于单菌发酵，其中乳酸和柠檬酸含量分别升高了0.43 g/L和0.08 g/L，明显高于酿酒酵母单菌发酵，这可能是由于发酵过程中德尔布有孢圆酵母代谢产生了有机酸[26]。
表6 紫山药酒有机酸成分测定结果
Table 6 Determination results of organic acids of purple yam wine
含量/（g·L-1）单菌发酵 混菌发酵有机酸 味觉特点酒石酸苹果酸乳酸柠檬酸柑橘味，酸感强烈、粗糙、味感生硬绿苹果味、青草味，稍有刺激感、苦涩感酸味微弱、柔和、圆润、稍有涩感鲜宜人的柑橘味，酸味清爽、口感爽快1.60 0.51 0.87 0.43 1.60 0.52 1.30 0.51
2.6 紫山药酒挥发性风味成分分析
由表7可知，混菌发酵的紫山药酒中检出28种香气成分，而单菌发酵的紫山药酒中仅检出11种。混菌发酵的紫山药酒中醇类有3种，在总香气成分中占比最多，有64.57%，其中异戊醇、苯乙醇有玫瑰等花香[27]；酯类有12种，占总香气成分的15.41%，其中辛酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸乙酯、棕榈酸乙酯等有梨子、荔枝和橙子等各种水果香味[28]；醛类有3种，占总香气成分的8.40%，其中癸醛、2,4-二叔丁基苯酚分别具有水果香和花香[29]；酸类有4种，在总香气成分中占比最少，有1.90%；其他化合物有6种，占比为9.72%。相比之下，单菌酿造的紫山药酒酯类仅有5种，醛类及酸类几乎没有，其香气成分大部分为醇类，有79.65%。由此可见，混菌发酵赋予了使紫山药酒更多的香气成分，使其风味更为复杂丰富，有效提升了紫山药酒的品质。
表7 紫山药酒挥发性香气成分分析及香气特征
Table 7 Analysis of volatile aroma components and aroma characteristics of purple yam wine
注：-表示未检出。
种类化合物 香气特征相对含量/%单菌发酵混菌发酵1234567891 0微带果香的酒香具有芳香的肉桂味橙子香呈菠萝和蓝僖似香气呈微弱蜡香、果爵和奶油香气略有芳香气味10.50 4.35 0.97-3.19 1.71--酯类乙酸乙酯肉桂酸异戊酯乙酸异戊酯3-甲基-戊酸乙酯棕榈酸乙酯邻苯二甲酸二异丁酯棕榈酸甲酯丁二酸二乙酯辛酸乙酯胡莫柳酯水杨酸辛酯邻苯二甲酸二丁酯醇类乙醇苯乙醇异戊醇酸类硬脂酸吡啶-2-丙烯酸1,2,4-苯三羧酸棕榈酸醛类2,4-二叔丁基苯酚癸醛2,4-二甲基苯甲醛其他化合物6-甲基环三硅氮烷8-甲基环四硅氧烷正十七烷2,3-二甲基-2,3-二苯基丁烷正十五烷正十六烷有特殊气味梨子香、荔枝香、百合花香轻度薄荷醇微带芳香气味微具芳香气味0.16 11 12-- - -13 14 15特殊、愉快的香味玫瑰花香气苹果白兰地、水果香、花香79.65 40.15 22.52 16.97 16 17 18 19微带牛油气味-- - - -20 21 22花香具有甜香、柑橘香、蜡香、花香温和，甜的，苦杏仁气味23 24 25 26 27 28 0.33-0.33-9.63 5.46 4.16具有特殊的气味-- - -15.41 6.42 4.14 0.99 0.88 0.87 0.68 0.67 0.44 0.29 0.01 0.01 0.01 64.57 30.34 29.91 4.32 1.90 1.04 0.52 0.24 0.10 8.40 4.55 3.41 0.45 9.72 3.75 2.19 1.87 1.05 0.48 0.38
3 结论
本研究采用单因素结合正交试验的方法确定紫山药酒发酵的最优工艺参数为：酿酒酵母接种量8%，德尔布有孢圆酵母接种量4.8%，蔗糖添加量20%，发酵温度23 ℃，发酵时间10 d。在此优化条件下酿造的紫山药酒澄清透明，具有鲜亮的紫红色，无明显悬浊物与沉淀，滋味醇香，柔谐优美，有紫山药的典型风味，且富含花青素和总酚，感官评分达到92分，各项理化指标均符合NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》要求。检测紫山药酒的抗氧化能力发现，相比于酿酒酵母单菌发酵，混菌发酵有助于提高紫山药酒的抗氧化能力，其超氧阴离子自由基、DPPH自由基与羟基自由基清除率分别提高了11.2%、4.9%与2.8%。混菌发酵提升了紫山药酒中各有机酸含量，其中乳酸和柠檬酸提高最多。混菌发酵较单菌发酵酒增加了17种香气成分，主要是酯类种类与含量的提升，赋予了紫山药酒各种水果香与花香，使其风味更为复杂丰富。综上所述，德尔布有孢圆酵母的加入大大提升了紫山药酒的品质，为酿造兼具营养和风味的高品质紫山药酒提供了技术支持。
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