传统青稞酒指自酿的青稞酒，将清洗干净的青稞，炒制或蒸煮至熟化，加入适量的酒曲，混匀后装入特制的木桶、陶罐或锅中密封，发酵一定时间后加入适量清水继续发酵1～2 d，酿造而成的低度传统青稞酒[1-2]。传统青稞酒富含多种有机酸、风味物质[3-4]，具有抗氧化、降血压、降血糖[5]等功效。随着西藏旅游事业蓬勃发展，越来越多的企业开始对传统青稞酒进行工业化生产，但受海拔、原料和工艺等因素限制导致口感不一，造成品质差异化。目前传统青稞酒的研究集中在原料[6-7]、贮藏材料[8-9]、质量控制[10]以及传统青稞酒的营养品质和风味分析[11]方面。贾福晨等[12]制备的传统青稞酒风味物质种类增加，显著提高传统青稞口感；祁万军等[13]采用筛选的发酵菌株制备传统青稞酒的出酒率提高2.77%～4.17%。
传统青稞酒在发酵和贮藏期间口感差异大，传统青稞酒发酵工艺中的感官评价受主观因素影响较大[14]，模糊数学感官评价综合考虑所有评定因素，运用数学的矩阵法，使评价结果更加科学、客观和合理[15]。目前主要将模糊数学感官评价法应用于果汁[16]、饮料[17]和调味酱[18]等工艺优化，但模糊数学感官评价优化传统青稞酒的发酵工艺鲜有提及。
本研究以青稞（“藏青2000”）为原料，以酒曲为糖化发酵剂制备传统青稞酒。以酒精度和感官评价为评价指标，通过模糊数学感官评价和响应面法优化传统青稞酒的发酵工艺条件，并对其理化指标进行分析。以期为西藏传统青稞酒的开发与贮藏提供依据，为传统青稞酒的工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青稞（藏青2000）、酒曲：西藏自治区农牧科学院；无水乙醇、氢氧化钠（均为分析纯）：西陇科学有限公司；五水和硫酸铜（分析纯）：天津市科密化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LRH-250生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；ST180-A苏格电磁炉：广东艾诗凯奇智能科技有限公司；0～100酒精度计：河间市振岩仪器仪表厂；LS173色度仪：深圳市林上科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 传统青稞酒加工工艺流程及操作要点[19]
青稞→挑选、浸泡→蒸粮→接种酒曲→糖化→发酵→离心→灌装、灭菌→成品
操作要点：挑选颗粒完整且饱满的青稞，清洗后浸泡于水中并没过水面。将浸泡好的青稞均匀平整地铺在蒸屉上，大火至蒸锅冒水蒸气后，每隔30 min在青稞上均匀撒水以使青稞更好地受热糊化，蒸煮4 h后摊凉至室温，添加2.0‰酒曲搅拌均匀，使酒曲与青稞充分接触，采用容器密封后放入恒温培养箱中于28 ℃条件下糖化12 h。在糖化好的酒醅中按照料水比1∶1（g∶mL）加入灭菌后的水，搅拌均匀后密封，于28 ℃条件下发酵2.0 d，发酵液不再产气时停止发酵。将发酵好的青稞酒离心（3 000 r/min、5 min），取上清液，进行灌装、灭菌（65 ℃、30 min）获得传统青稞酒成品。
1.3.2 传统青稞酒发酵条件优化
单因素试验：在上述工艺流程基础上，分别考察酒曲添加量（2.0‰、4.0‰、6.0‰、8.0‰、10.0‰）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL））、发酵温度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃）、发酵时间（1.0 d、1.5 d、2.0 d、2.5 d、3.0 d）对成品酒酒精度、感官评分的影响。
响应面试验：在单因素试验结果的基础上，选择酒曲添加量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）为自变量，以感官评分（Y）为响应值，设计3因素3水平响应面试验，响应面试验因素与水平见表1。
表1 传统青稞酒发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for optimization of fermentation technology of traditional highland barley wine
水平 A 酒曲添加量/‰ B 发酵温度/℃ C 发酵时间/d-1 0 1 2 4 6 24 28 32 1.5 2.0 2.5
1.3.3 分析检测
总糖、非糖固形物、酒精度、总酸、氨基酸态氮的检测：分别参照GB/T 13662—2018《黄酒》中廉爱农法、重量法、仪器法、滴定方法；细菌总数：GB 4789.2—2022 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定；大肠菌群：GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。
1.3.4 传统青稞酒的感官评价
组织10位经过培训的食品专业评审员从色泽、风味、口感与酒体4个方面对传统青稞酒先进行一级感官评分，再进行二级感官评分。其感官评价标准参照国标GB/T 13662—2018《黄酒》中传统型黄酒感官要求制定，具体见表2。
表2 传统青稞酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation criteria of traditional barley wine
感官指标一级指标 二级指标评价 等级（得分/分）色泽 颜色；透明度风味 香气；异味口感 甜味；酒味酒体 均一性；沉淀性淡黄色；清澈透亮黄褐色；有轻微的浑浊红色；透明度低，有明显浑浊黑褐色；悬浮状液体酒香突出；无异味酒香略淡；略有酒曲味稍有酒香；酒曲味明显或有臭味无酒香；明显的臭味绵甜爽洌；清香纯正，口感醇厚细腻酸甜适度；有青稞香，口感尚细腻酸甜适度；口感寡淡，细腻酸甜失调；有酸败味，苦涩无酒味静置无分层；无沉淀静置略微分层；略微沉淀静置有分层；沉淀明显静置分层明显；沉淀呈现大颗粒状好（15～20）较好（10～14）一般（5～9）差（0～4）好（15～20）较好（10～14）一般（5～9）差（0～4）好（20～30）较好（10～19）一般（5～9）差（0～5）好（20～30）较好（10～19）一般（5～9）差（0～5）
1.3.5 模糊数学感官评价的建立[20-21]
根据传统青稞酒感官评价标准，对响应面优化条件下的传统青稞酒的感官指标进行模糊数学综合评价，并建立数学模型。
（1）因子集、评语集与权重集的建立
评价因子集U1=｛u11，u12，u13，u14｝，u11～u14依次代表评价传统青稞酒的4个一级评价因素，即U1=｛色泽，风味，口感，酒体｝，评价因子集U2=｛u21，u22，u23，u24，u25，u26，u27，u28｝，u21～u28依次代表评价传统青稞酒的8个二级评价因素，即U2=｛透明度，香气，异味，甜味，酒味，均一性，沉淀性｝，评价因子集u21=｛u1，u2，u3，u4｝，u1～u4依次代表评价传统青稞酒的4个等级，即u21=｛好，较好，一般，差｝。
评价得分集V=｛v1，v2，v3，v4｝，依次代表好、较好、一般、差，对应的分值为95、85、65、15，即V=｛95，85，65，15｝。
对一级权重集和二级权重集进行投票计算，经计算一级权重集A=｛a1，a2，a3，a4｝=｛0.23，0.28，0.26，0.23｝，二级权重集B=｛b11，b12，b21，b22，b31，b32，b41，b42｝=｛0.500，0.500，0.500，0.500，0.333，0.667，0.667，0.333｝。计算综合权重WIJ=ai×bij，其中i=1，2，3，4；j=1，2。则W=｛w11，w12，w21，w22，w31，w32，w41，w42｝=｛0.115，0.115，0.140，0.140，0.087，0.173，0.153，0.077｝。
（2）模糊矩阵的建立及评价结果的确定
10位经过培训的食品专业评审员从色泽、风味、口感与酒体4个方面对传统青稞酒先进行一级感官评分，再进行二级感官评分，评价之后可统计各个因素在各个等级中的票数，然后根据所得的票数结果得传统青稞酒的感官评价模糊关系矩阵Rk。
其中，k=1，2，3，…17为样品编号，S为评价因素，m=1，2，3，4为一级评价因素的编号，n=1，2，3，…8为二级评价因素的编号。里面的每一行都代表每一个因素的评价结果。根据传统青稞酒模糊数学评价模型Tk=W×Rk（其中，T为评价集，W为权重系数，R为模糊矩阵）。
1.3.6 数据处理
本研究中所有试验和检测均重复进行3次，数值以“平均值±标准差”表示。采用IBM SPSS 15.01版统计软件对数据进行显著性分析，P＜0.05认为数值间存在显著性差异。使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行数据绘图。使用Design Expert 13.0软件进行响应面试验设计和数据处理。
2 结果与分析
2.1 传统青稞酒单因素试验结果
2.1.1 酒曲添加量对传统青稞酒的影响
酒曲有糖化、酒化和增香的作用[22]，酒曲接种量影响传统青稞酒的品质。由图1可知，随着酒曲添加量在2‰～4‰范围内的增加，感官评分及酒精度逐渐增加；当酒曲添加量为4‰时，感官评分、酒精度分别为（70.48±0.95）分、（3.66±0.23）%vol；当酒曲添加量＞4‰之后，酒精度趋于平稳，而感官评分有所下降。这是因为当酒曲添加量过多时，霉菌大量繁殖，糖化的速度过大，造成酸味和酵母味道过重，且底物减少导致酒精度增加缓慢[23]。因此，确定最适酒曲添加量为4‰。
图1 酒曲添加量对传统青稞酒感官评价和酒精度的影响
Fig.1 Effect of Jiuqu addition on the sensory evaluation and alcohol content of traditional highland barley wine
2.1.2 料液比对传统青稞酒的影响
料液比可以提高出酒率，调整酒的口感[24]。由图2可知，随着料液比在1∶1～1∶5（g∶mL）范围内的增加，酒精度逐渐下降。随着料水比在1∶1～1∶2（g∶mL）范围内的增加，感官评分逐渐增加，酒精度逐渐降低；当料液比为1∶2（g∶mL）时，感官评分、酒精度分别为（71.00±1.06）分、（3.78±0.09）%vol；当料液比为1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）时，感官评分逐渐下降。这是因为当水的比例过多时，会稀释酒精，使传统青稞酒寡而无味。因此，确定最适料液比为1∶2（g∶mL）。
图2 料液比对传统青稞酒感官评价和酒精度的影响
Fig.2 Effect of feed to liquid ratio on sensory evaluation and alcohol content of traditional highland barley wine
2.1.3 发酵温度对传统青稞酒的影响
发酵温度影响菌种酶活和细胞结构，导致底物的利用率不同，进而影响酒中挥发性香气成分，产生和口感上的差异[25]。由图3可知，随着发酵温度在20～28 ℃范围内增加，感官评分及酒精度逐渐增加；当发酵温度为28 ℃时，感官评分、酒精度分别为（79.66±0.65）分、（4.85±0.31）%vol；当发酵温度＞28 ℃之后，感官评分及酒精度均逐渐下降。其原因可能是，温度过低抑制酒曲中微生物的酶活性降低导致发酵不完全，从而影响部分糖类物质转化为酒精；而温度过高会使乙醇和乙酸乙酯挥发，影响生物体内蛋白质脱氧核糖苷酸、核糖核酸及细胞膜结构变化，抑制微生物的生长[26]。因此，确定最适发酵温度为28 ℃。
图3 发酵温度对传统青稞酒感官评价和酒精度的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation and alcohol content of traditional highland barley wine
2.1.4 发酵时间对传统青稞酒的影响
由图4可知，随着发酵时间在1～2 d范围内的增加，感官评分及酒精度逐渐增加；当发酵时间为2 d时，感官评分、酒精度分别为（81.12±0.98）分、（4.85±0.31）%vol；当发酵时间＞2 d之后，感官评分、酒精度有所下降。其原因可能是，随着发酵时间的增加底物被大量消耗，还原糖含量降低，微生物开始衰败，导致产生酵母味[27]。因此，确定最适发酵时间为2 d。
图4 发酵时间对传统青稞酒感官评价和酒精度的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation and alcohol content of traditional highland barley wine
2.2 模糊数学感官评价
10位经过培训的食品专业评审员对17组样品进行感官评价打分，各项指标票数统计结果见表3。将表3数据建立模糊评价矩阵，将每个样品的各自影响因素的得票数除以总参与人数10，即可得到各个模糊矩阵R1～R17。以1号样品为例，评价因子集u21的投票结果中好、较好、一般、差的投票人数分别为0，3，5，2，所以u21=｛u1，u2，u3，u4｝=（0，3，5，2），同理，u22=（2，5，3，0），u23=（5，5，0，0），u24=（1，7，1，1），u25=（0，3，7，0），u26=（0，4，1，5），u27=（0，8，2，0），u28=（0，3，6，1）。将以上8个因素的感官评定票数转换为矩阵，其余试验组的矩阵同理计算。根据综合评价结果的计算公式Ti=W×Ri，其中i=1，2，…，n，n=17。可以得出试验组Y1=W×Ri={0.115，0.115，0.140，0.140，0.087，0.173，0.153，0.077}×R1=（0.107，0.500，0.261，0.131 2）。将综合评价结果乘以评语集对应的等级分值并求和，得出每个成品最终的综合评价值Ti，即传统青稞酒的模糊感官评分。则T1=（0.107，0.500，0.261，0.131）×（95，85，65，15）=71.67。用同样的方法，可以得到其他样品的模糊数学感官评分。
表3 传统青稞酒感官评分投票结果
Table 3 Voting results of traditional barley wine sensory evaluation
u11 u21序号u22 u12 u23 u24 u13 u25 u26 u14 u27 u28 u1 u2 u3 u4 u4 u4 u4 u4 u4 u4 u1 u2 u3 u1 u2 u3 u1 u2 u3 u1 u2 u3 u1 u2 u3 u1 u2 u3 u1 u2 u3 u4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 6 4 6 0 1 0 4 9 9 0 3 4 4 4 5 0 3 1 1 7 5 0 1 0 2 0 2 0 0 0 2 0 1 0 3 0 1 0 0 3 2 6 1 7 3 1 0 3 1 5 6 3 5 4 1 0 9 0 5 2 6 3 2 0 4 0 1 5 3 1 3 0 2 0 3 0 0 2 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 2 1 0 8 4 5 4 6 5 5 0 3 0 2 4 0 0 0 0 1 0 5 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 7 3 8 4 9 0 5 8 0 7 3 3 2 4 1 5 5 2 5 1 0 3 0 1 0 5 0 0 5 11 12 13 14 15 16 17 4 5 9 3 5 1 7 1 2 1 2 5 6 3 3 3 0 4 0 3 0 2 0 0 1 0 0 0 6 4 9 5 2 0 6 0 3 1 5 3 3 4 3 3 0 0 5 4 0 1 0 0 0 0 3 0 3 6 9 2 0 0 6 5 4 1 8 4 5 4 2 0 0 0 6 5 0 0 0 0 0 0 0 0 7 4 6 6 4 5 6 3 6 4 3 6 3 4 0 0 0 0 0 2 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 5 5 5 1 1 0 5 5 8 0 3 5 4 5 3 0 0 5 2 6 7 0 1 0 3 0 5 0 0 2 0 0 0 0 3 0 0 0 0 2 0 5 5 7 0 0 2 1 4 5 3 3 3 1 0 6 5 5 4 1 0 4 4 9 4 1 0 6 9 0 2 0 4 0 1 0 2 0 4 0 5 0 0 0 5 0 0 0 3 0 1 0 0 1 0 0 9 2 8 8 4 5 5 3 0 5 1 3 2 2 0 0 0 2 0 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 5 0 0 0 0 3 7 3 1 0 3 5 4 1 3 0 7 3 7 0 6 1 1 0 2 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 5 5 9 8 6 4 2 5 5 1 2 4 3 8 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 0 7 4 8 2 3 3 2 2 6 2 2 5 2 8 1 0 0 6 0 5 0 0 0 0 0 2 0 0 7 3 0 3 2 3 5 2 3 1 0 2 2 3 4 1 3 0 5 5 3 1 0 1 0 0 1 1 0 1 2 9 3 4 6 4 5 5 1 3 5 2 4 3 3 0 6 1 2 1 1 0 0 0 0 0 1
2.3 传统青稞酒发酵工艺条件优化响应面试验结果
采用软件Design-Expert 13.0软件中的Box-Behnken试验进行分析，以酒曲添加量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）为自变量，以感官评分（Y）为响应值，进行3因素3水平响应面试验，响应面试验设计及结果见表4，方差分析见表5。
表4 传统青稞酒发酵工艺条件优化响应面试验设计及结果
Table 4 Design and results of response surface tests for optimization of fermentation process conditions of traditional highland barley wine
试验号A 酒曲添加量/‰ B 发酵温度/℃ C 发酵时间/d Y 感官评分/分1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 4.00 2.00 2.00 4.00 6.00 4.00 6.00 4.00 4.00 2.00 2.00 4.00 4.00 4.00 6.00 6.00 4.00 32.00 28.00 28.00 28.00 32.00 28.00 28.00 28.00 28.00 24.00 32.00 24.00 28.00 24.00 28.00 24.00 32.00 1.50 2.50 1.50 2.00 2.00 2.00 1.50 2.00 2.00 2.00 2.00 1.50 2.00 2.50 2.50 2.00 2.5 71.67 89.54 82.70 91.42 70.29 93.13 73.00 91.97 90.05 79.08 84.34 85.34 92.03 82.85 80.01 76.63 88.77
表5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B*********AC BC A2 B2 C2 60.64 96.38 5.89 61.15 20.32 4.363E-0.03 57.94 142.66 112.28 21.64＜0.000 1＜0.000 1 0.045 7 0.000 1 0.002 8 0.949 2 0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.002 3********残差失拟项绝对误差总和903.65 159.58 9.75 101.25 33.64 7.225E-0.03 95.94 236.21 185.92 35.84 11.59 5.56 5.03 915.24 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 100.41 159.58 9.75 101.25 33.64 7.225E-0.03 95.94 236.21 185.92 35.84 1.66 2.19 1.26 1.74 0.296 5
对表4试验结果进行二次多项回归拟合，获得传统青稞酒感官评分与各因素间的二次多项回归方程为：
Y1=91.72-4.47A-1.10B+3.56C-2.90AB+0.043AC+4.90BC-7.49A2-6.65B2-2.92C2
由表4可知，模型显著（P值＜0.05），失拟项不显著（P值=0.296 5＞0.05），决定系数R2=98.73%，调整决定系数R2adj=97.77%，表明模型建立有效。由F值可知，影响感官评分的主次顺序为酒曲添加量（A）＞发酵时间（C）＞发酵温度（B）。由P值可知，一次项A、C，交互项AB、BC，二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项B对结果影响显著（P＜0.05）。
根据交互作用的响应面及等高线能够更加直观地体现各因素对感官评价的影响趋势及变化范围，响应面越陡峭，等高线越趋于椭圆，表明两因素交互作用越显著；响应面坡面越平缓，等高线越趋于圆形，两因素交互作用越不显著[30]。各因素间交互作用对感官评分影响的响应曲面及等高线见图5。
图5 各因素间交互作用对感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on sensory score
由图5可知，酒曲添加量（A）、发酵温度（B）间交互作用，发酵温度（B）、发酵时间（C）间交互作用响应曲面坡度陡峭，等高线接近椭圆形，对感官评分影响极显著（P＜0.05），这与方差分析结果一致。
2.4 验证试验
通过Design-Expert 13.0软件分析得出最优的发酵工艺条件为：酒曲添加量3.61‰、发酵温度28.23 ℃、发酵时间2.41 d。在此条件下传统青稞酒的感官评分理论值为（93.39±0.34）分。考虑到试验可操作性，将传统青稞酒最佳发酵工艺条件修正为：酒曲添加量3.6‰、发酵温度28 ℃，发酵时间2 d。在此优化条件下，感官评分实际值为（93.16±0.59）分，酒精度为（6.50±0.31）%vol，表明传统青稞酒发酵工艺准确可靠。
2.5 传统青稞酒的理化结果
传统青稞酒的理化指标检测结果见表6。由表6可知，传统青稞酒的酒精度、酸度、非糖固形物、氨基酸态氮分别为（6.95±0.16）%vol、（3.42±0.21）g/L、（14.66±0.02）g/L、（0.17±0.06）g/L，符合GB/T 13662—2018《黄酒》中清爽型半干黄酒的理化要求，但总糖含量为（5.50±0.42）g/L，低于黄酒，这可能与原料和酒曲有关，黄月等[28]将脱皮与未脱皮的青稞发酵成黄酒，其总糖含量分别为0.33 g/L、0.38 g/L，远远低于标准，这是因为青稞中的主要的糖类物质为β-葡聚糖，在发酵过程中被酒曲中的微生物大量消耗[29]，导致总糖含量低于黄酒。此外，传统青稞酒的微生物指标均符合相关标准。
表6 传统青稞酒的理化及卫生指标检测结果
Table 6 Determination results of physiochemical and health indexes of traditional highland barley wine
理化指标 传统青稞酒 GB/T 13662—2018《黄酒》是否符合标准酒精度/%vol酸度/（g·L-1）总糖/（g·L-1）非糖固形物/（g·L-1）氨基酸态氮/（g·L-1）细菌总数/（CFU·mL-1）大肠杆菌总数/（MPN·100 mL-1）6.95±0.16 3.42±0.21 5.50±0.42 14.66±0.02 0.17±0.06≤50≤4≥6.0 2.5～7.0 15.1～40.0≥10.5.≥0.16≤50≤4是是否是是是是
3 结论
本研究通过模糊数学感官评价和响应面法优化传统青稞酒的发酵工艺，确定最优的发酵工艺条件为添加酒曲量为3.6‰，发酵温度为28 ℃，发酵时间2 d，料液比1∶2（g∶mL）。得到传统青稞酒的酒精度为6.50%vol，感官评分为93.16分，酒体微黄透亮，酒香突出，绵甜爽洌，醇厚细腻。酸度、总糖、非糖固形物、氨基酸态氮分别为3.42 g/L、5.5 g/L、014.66 g/L、0.17 g/L。工业化生产传统青稞酒可以有效促进西藏的经济发展，为工业化生产传统青稞酒奠定理论基础。
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