枇杷[Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl]是我国亚热带地区一种特色水果，种质资源极其丰富。荔波大五星枇杷果大、核小、果肉丰厚，质地细嫩且营养丰富，酸甜可口，风味独特，一直深受人们喜爱[1-3]。其果肉中含有丰富的黄酮类、萜类、酚类、挥发油和苦杏仁苷等活性成分，具有镇咳祛痰、延缓衰老、降血糖、抗氧化、降血脂等功效[4-7]。但枇杷果实采收期多集中在4月～5月，季节性较强，采后在常温条件下极易失水皱皮和腐烂变质；由于果皮薄，储运过程中，易受机械损伤，发生褐变甚至腐败，不耐贮藏，所以很多学者一直高度关注枇杷的精深加工研究[8-11]。
乳酸菌发酵果蔬制品可以延长其保质期，保证其风味品质，因此受到广大消费者的青睐[12-14]。短乳杆菌（Lactobacillus brevis）是乳酸菌中的一种，具有提升食品的营养价值、降低胆固醇、抗衰、调节肠道菌群、提高机体免疫能力等多种功能特性，应用于发酵食品可取得显著效益[15-17]。
目前对枇杷深加工主要集中在果酒和果醋发酵方面[18-20]。随着经济水平的提高和保健意识的增强，消费者不仅看重产品的口感，更注重其营养价值[21-24]，因此，本研究以枇杷汁为原料，通过短乳杆菌发酵制备枇杷发酵液，在单因素试验的基础上利用响应面试验对枇杷发酵液的发酵条件进行优化，并对其品质指标及抗氧化活性进行分析，以期为枇杷的功能性产品开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料与菌株
枇杷：产自贵州省黔南州荔波县；短乳杆菌（Lactobacillus brevis）：上海保藏生物技术中心。
1.1.2 化学试剂
芦丁（纯度＞98%）：成都曼思特生物科技有限公司；无水碳酸钠、碳酸氢钠、抗坏血酸、硝酸铝、无水乙醇、草酸、福林酚：天津永大化学试剂有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、无水乙醇、没食子酸：北京索莱宝科技有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.1.3 培养基
MRS肉汤培养基：青岛海博生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
VORTEX-5旋涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Agilent Cary紫外可见分光光度计：安捷伦科技有限公司；SB25-120DTS变频超声仪：宁波新艺超声设备有限公司；BBS-V1300-X医用洁净工作台：济南鑫贝西生物技术有限公司；HRY-150恒温恒湿培养箱：宁波赛福实验仪器有限公司；GL2004B电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；PHS-320高精度智能酸度计：成都世纪方舟科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 发酵种子液的制备
无菌条件下接种短乳杆菌至MRS肉汤培养基中，在37 ℃条件下培养48 h，5 000 r/min离心10 min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水与菌体混匀，调整菌液浓度，使其菌液浓度为1×109 CFU/mL。
1.3.2 枇杷发酵液的制备工艺流程及操作要点
枇杷→选果→清洗→榨汁→添加白砂糖→灭菌→接种发酵种子液→发酵→离心→过滤→成品
操作要点：
选果：挑选新鲜成熟、圆润饱满、大小适中的枇杷，将其清洗沥干，去核。
榨汁：将去核枇杷与水按1∶2（g∶mL）的料液比混合后，用榨汁机打汁，200目滤网过滤。
灭菌：将枇杷汁添加一定量的白砂糖，于90～95 ℃灭菌处理15 min。
接种及发酵：将灭菌后的枇杷汁置于超净工作台内，待冷却至室温后，将发酵种子液按照一定接种量接入枇杷汁中，摇匀后置于37 ℃恒温培养箱中发酵一定时间后得枇杷发酵液。
1.3.3 枇杷发酵液发酵条件优化单因素试验
按照参考文献[17，25]，固定白砂糖添加量6%，发酵时间72 h，发酵温度37 ℃，接种量6%；改变单一条件，分别考察白砂糖添加量（4%、5%、6%、7%、8%）、发酵时间（48h、60 h、72 h、84 h、96 h）、发酵温度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、接种量（2%、4%、6%、8%、10%）对枇杷发酵液品质的影响。
1.3.4 枇杷发酵液发酵条件优化响应面试验
在单因素试验的基础上，选取白砂糖添加量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）、接种量（D）为4个考察因素，以枇杷发酵液感官评分（Y）为响应值，利用Design-Expert 13.0软件设计4因素3水平响应面试验对枇杷发酵液的发酵条件进行优化，响应面试验因素与水平见表1。
表1 枇杷发酵液发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of loquat fermentation broth
水平 A 白砂糖添加量/% B 发酵时间/h C 发酵温度/℃ D 接种量/%-1 0 1 5 6 7 60 72 84 35 37 39 4 6 8
1.3.5 测定方法
感官评价：参考GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》设计感官评分标准，挑选10名经过培训的人员对枇杷发酵液进行感官评分，以枇杷发酵液的色泽、香气、口感、整体可接受性4个方面作为评分项目[20]，取10人平均分，满分100分。枇杷发酵液的感官评分标准见表2。
表2 枇杷发酵液感官评分标准
Table 2 Sensory score standards of loquat fermentation broth
指标 评价标准 分值色泽（25分）气味（25分）口感（25分）整体可接受性（25分）澄清，透明，呈现黄色或浅黄色无悬浮物，呈现黄色或浅黄色色泽偏深或偏浅，含少量悬浮物色泽偏深或偏浅，液体浑浊枇杷的芳香气味和正常发酵香气，香气浓郁枇杷的芳香气味和发酵香气稍淡枇杷的芳香气味和发酵香气淡，有少许杂味无枇杷芳香气味和发酵香气，杂味严重枇杷滋味和发酵风味浓郁，酸甜可口枇杷滋味和发酵风味较浓郁，口感较好口感一般，过淡、过酸或过甜，有轻微涩味口感差，没味道，涩味重，难以下咽比较喜欢、非常喜欢、极其喜欢可接受、有点喜欢比较不喜欢、有点不喜欢极其不喜欢、非常不喜欢19～25 13～18 7～12 1～6 19～25 13～18 7～12 1～6 19～25 13～18 7～12 1～6 19～25 13～18 7～12 1～6
总黄酮含量测定：参考刘英等[26]的方法，采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法；维生素C含量测定：参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》；总酸含量测定：参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》；总酚含量测定：参考赵金梅等[24]的方法，采用福林-酚比色法；pH值测定：用PHS-320高精度智能酸度计进行测定。
SOD活性测定：按照SOD试剂盒说明书，使用可见分光光度法进行测定。
1.3.6 统计分析
每个试验均重复3次取平均值。Box-Behnken响应面试验设计采用Design-Expert 13.0软件，数据处理和分析采用Excel 2016和SPSS 23.0软件，并使用origin 2022对试验数据绘图。
2 结果与分析
2.1 枇杷发酵液发酵条件优化单因素试验结果与分析
2.1.1 白砂糖添加量对枇杷发酵液品质的影响
由图1可知，随着白砂糖添加量的增加，枇杷发酵液总黄酮含量与感官评分均呈先升高后降低的趋势。当白砂糖添加量为6%时，枇杷发酵液感官评分达到最高值90.20分，此时枇杷发酵液的总黄酮含量为8.43 mg/100 mL。适宜的糖含量既可以为微生物提供营养物质，又能提高产品的风味，但白砂糖添加量过高则会导致枇杷发酵液的口感过甜[23]，且总黄酮的含量也逐渐下降。因此，选取最佳白砂糖添加量为6%。
图1 白砂糖添加量对枇杷发酵液总黄酮含量和感官评分的影响
Fig.1 Effect of sugar addition on total flavonoids content and sensory score of loquat fermentation broth
2.1.2 发酵时间对枇杷发酵液品质的影响
由图2可知，随着发酵时间的延长，枇杷发酵液总黄酮含量与感官评分均呈先升高后降低的趋势。当发酵时间为72 h时，枇杷发酵液感官评分和总黄酮含量均达到最高值，分别为90.10分、10.53 mg/100 mL。发酵时间会对乳酸菌的产酸量和产品口感造成影响，在发酵初期，可能由于乳酸菌活力较低，乳酸菌产酸较少，导致枇杷发酵液几乎无发酵风味，当发酵时间过长，则会使乳酸菌产酸过多，从而使口感过酸，营养成分流失，影响产品风味[27]。因此，选取最佳发酵时间为72 h。
图2 发酵时间对枇杷发酵液总黄酮含量和感官评分的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on total flavonoids content and sensory score of loquat fermentation broth
2.1.3 发酵温度对枇杷发酵液品质的影响
由图3可知，随着发酵温度的不断升高，枇杷发酵液总黄酮含量与感官评分均呈先升高后降低的趋势。当发酵温度为37 ℃时，枇杷发酵液感官评分达到最高值90.00分，此时总黄酮含量为8.94 mg/100 mL。乳酸菌活性的高低跟温度有很大关系，温度过高或者过低都会使乳酸菌的繁殖速度受到影响，从而影响产品品质[14]。因此，选取最佳发酵温度为37 ℃。
图3 发酵温度对枇杷发酵液总黄酮含量和感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on total flavonoids content and sensory score of loquat fermentation broth
2.1.4 接种量对枇杷发酵液品质的影响
由图4可知，随接种量的增加，枇杷发酵液总黄酮含量与感官评分均呈先升高后降低的趋势。当乳酸菌接种量为6%时，枇杷发酵液感官评分和总黄酮含量均达到最高值，分别为90.00分、10.12 mg/100 mL。接种量的高低会影响枇杷发酵液口感，接种量过低会使乳酸菌产酸量不足易被杂菌污染，产品品质下降，影响其口感；接种量过高，则会使乳酸菌产酸过多，乳酸大量增加，口感过酸，感官评分下降[28]，因此，选择最佳接种量为6%。
图4 接种量对枇杷发酵液总黄酮含量和感官评分的影响
Fig.4 Effect of inoculum on total flavonoids content and sensory score of loquat fermentation broth
2.2 枇杷发酵液发酵条件优化响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面试验设计结果与方差分析
枇杷发酵液发酵条件优化响应面试验设计与结果见表3。
表3 枇杷发酵液发酵条件优化响应面试验设计与结果
Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization of loquat fermentation broth
试验号 A B C D Y 感官评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 0 -1 0 -1 1 -0 0 0 0 1 0 0 1 0 -1-1 1 0 1 1 0 -1 0 0 1 0 --1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 1 -0 1 1 1 0 0 1 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 -1 1 0 0 0 0 -1 0 1 0 --1-1 0 0 -1 0 0 0 0 -0 0 0 0 1 1 0 -1 1 --1 0 1 0 0 0 1 0 1 -1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 -1-1-1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 78 72 72 77 77 74 81 68 87 70 81 69 78 90 72 86 76 68 92 81 91 75 74 61 72 75 71 90 91
通过Design-Expert 13软件对表3中得到的结果进行统计分析，得到枇杷发酵液感官评分的二次多项回归方程式为：Y=90.80+3.42A-1.08B+1.83C+1.50D+5.25AB+0.50AC-2.00AD-0.50BC+1.00BD-7.00CD-9.32A2-11.57B2-6.69C2-4.44D2，对枇杷发酵液感官评分的回归方程进行方差分析，结果见表4。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14 ABCDA B***********AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总和1 840.79 140.08 14.08 40.33 27.00 110.25 1.00 16.00 1.00 4.00 196.00 563.03 867.81 290.45 127.97 30.38 27.58 2.80 1 871.17 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 60.59 64.55 6.49 18.58 12.44 50.80 0.460 8 7.37 0.460 8 1.84 90.31 259.43 399.87 133.84 58.96＜0.000 1＜0.000 1 0.023 2 0.000 7 0.003 3＜0.000 1 0.508 3 0.016 7 0.508 3 0.196 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1*131.48 140.08 14.08 40.33 27.00 110.25 1.00 16.00 1.00 4.00 196.00 563.03 867.81 290.45 127.97 2.17 2.76 0.70**********10 4 28 3.94 0.099 2
由表4可知，感官评分模型的F值为60.59，P＜0.001，表明该模型极显著；该模型的失拟项的F值为3.94，P＞0.05，不显著；模型的决定系数R2=0.9838，校正决定系数R2为0.967 5，说明该模型拟合度较高，试验方法可靠，可用于分析预测。根据F值大小可得，各响应因素对枇杷发酵液感官评分的影响程度为A＞C＞D＞B，即白砂糖添加量＞发酵温度＞接种量＞发酵时间，感官评分的回归模型中一次项B和交互项AD对枇杷发酵液感官评分的影响显著（P＜0.05），一次项A、C、D，交互项AB、CD以及二次项A2、B2、C2、D2对枇杷发酵液感官评分的影响极显著（P＜0.01），其余项不显著（P＞0.05）。
2.2.2 响应面因素间交互作用分析
运用Design-Expert 13.0软件得到响应面图和等高线图，二者可以反映出各交互作用对枇杷发酵液感官评分的影响，各响应因素间交互作用对枇杷发酵液感官评分影响的响应面图和等高线图见图5。
图5 各因素间交互作用对枇杷发酵液感官评分影响的响应曲面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the sensory score of loquat fermentation broth
由图5可知，4个响应因素对感官评分的影响均表现为显著（P＜0.05），随着4个响应因素的增大，感官评分均表现出先上升后下降的趋势。通过等高线图可看出AD线呈现近似椭圆形状，说明发酵时间和接种量交互作用显著（P＜0.05）；AB和CD线呈现椭圆形状，则说明白砂糖添加量和接种量、乳酸菌发酵温度和接种量交互作用极显著（P＜0.01），而BC和AC、BD线呈现近似圆形形状，说明发酵时间和发酵温度、白砂糖添加量和发酵温度交互作用不显著（P＞0.05）。
2.2.3 响应面试验结果验证
运用Design-Expert 13.0软件对枇杷发酵液的发酵条件进行优化，得到枇杷发酵液的最佳发酵条件为白砂糖添加量6.18%，发酵时间71.91 h，发酵温度37.26 ℃，接种量6.05%。此优化条件下，枇杷发酵液感官评分预测值为91.25分。结合实际操作情况，将枇杷发酵液的最佳发酵条件调整为白砂糖添加量6%，发酵时间72 h，发酵温度37 ℃，接种量6%。在此条件下进行3次平行验证试验，得到枇杷汁发酵液感官评分实际值为91.00分，与模型预测值基本一致，说明优化结果可靠，工艺可行。
2.3 枇杷发酵液品质测定结果
枇杷富含人体所需的多种营养成分[29]，如总黄酮、总酚、维生素C、SOD等，营养价值高，但这些营养成分不稳定，在发酵过程中易受环境因素的影响，从而导致营养成分流失[30-32]。在优化后的发酵工艺条件下，枇杷发酵液澄清透明，酸甜可口，具有独特的枇杷发酵风味，感官评分为91分，总黄酮含量为8.90 mg/100 mL，而未发酵枇杷汁感官评分为78分，总黄酮含量为6.85 mg/100 mL，说明枇杷发酵液的整体品质优于未发酵枇杷汁，同时维生素C含量为1.05mg/100g，总酸含量为12g/L，总酚含量为11.56mg/100mL，pH值为4.19，SOD活力值为36.70 U/mL，乳酸菌活菌数对数值为7.63。SOD、总黄酮和总酚对人体具有较强的抗氧化能力，具有提高机体免疫能力[9，33]。在最佳优化条件下制备的枇杷发酵液具有较高的营养价值，以上指标均符合国家相关标准。
3 结论
本研究通过短乳杆菌发酵枇杷汁，利用单因素和响应面试验优化枇杷发酵液工艺条件，得到最佳发酵工艺参数为：白砂糖添加量为6%，发酵时间为72 h，发酵温度为37 ℃，接种量为6%。在此优化条件下，枇杷发酵液感官评分为91分，总黄酮含量为8.90mg/100mL，维生素C含量为1.05 mg/100 g，总酸含量为12g/L，总酚含量为11.56mg/100mL，pH值为4.19，SOD酶活力值为36.70 U/mL，乳酸菌活菌数对数值为7.63，制备的枇杷发酵液澄清透明，酸甜可口，具有较高的营养价值，为枇杷的深加工产业及其衍生产品的开发提供参考依据。
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