桑葚(Morus nigra)含有酚类物质[1]、类黄酮[2]、花青素[3]和白藜芦醇[4]等多种营养素和生物活性物质,具有抗炎[5]、抗癌[6]和保护神经[7]等多种功能,因此,桑葚被《中国药典》认定为药食同源的食物[8]。桑葚目前以鲜食为主,加工产品主要有桑葚干、桑葚果汁、桑葚酒及桑葚醋等[7]。将桑葚加工制成果酒,既符合国家“高度酒向低度酒转变,蒸馏酒向酿造酒转变,粮食酒向水果酒转变”的政策[9],又可以解决桑葚储存和原料浪费问题,延长产业链,提高附加值,填补市场空白,且桑葚酒因含有丰富的生物活性物质而备受消费者欢迎[10]。方裕理等[11]以扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)为发酵菌种,在发酵温度26 ℃、接种量2%和料液比75∶25(g∶mL)条件下发酵桑葚酒,得到桑葚酒的感官评分为90.0分,酒精度为8.72%vol,总酯含量5.7 g/L、总酸含量4.8 g/L、总酚含量2.5 mg/mL,共检出24种挥发性风味物质,赋予桑葚酒花果香。廉苇佳等[12]以酵母EC118为发酵菌种,在酵母接种量0.2 g/kg、初始pH值3.1、初始糖度22%、发酵温度22 ℃条件下酿造低产高级醇桑葚酒,高级醇含量与常规工艺相比降低31.55%。JOHNSON N A N等[13]在发酵温度25.01 ℃、pH值4.22、糖度25°Bx和硒添加量299.99 μg条件下发酵富硒桑葚酒,改善了桑葚酒的理化性质、抗氧化活性等。
对于桑葚等水果的传统工艺发酵酒,发酵原料品种单一,导致口感协调度不足,风味单一,难以博采众长。而复合发酵果酒在风味、色泽和营养价值上欧比单一品种发酵酒饮料更加全面[14]。葡萄作为常用的果酒原料,含糖量高,含有丰富的酚类物质、类黄酮和白藜芦醇等营养物质和风味物质。古丽米热·祖努纳等[15]以新疆喀什药桑与赤霞珠葡萄为原料混合发酵果酒,得到的药桑葡萄果酒总酚和总黄酮含量高,且具有抗氧化和降血脂功效。李巍巍[16]以冷冻后的桑葚和巨峰葡萄为原料发酵果酒,得到的桑葚葡萄复合果酒具有丰富的香气物质。桑葚葡萄复合果酒结合了桑葚和葡萄两种水果的优点,不仅口感独特,而且富含多种营养成分,具有保健功能。目前与桑葚复合发酵的葡萄原料品种较少,为此,探究更多的品种葡萄与桑葚葡萄复合酿制果酒的工艺显得十分必要。
本研究以桑葚和葡萄为主要原料制备复合果酒,采用单因素试验及响应面优化其发酵工艺,通过分光光度法检测2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、1,1-二 苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、羟基自由基清除率对其抗氧化活性进行评价,以期为桑葚复合果酒工业化生产提供理论技术支撑,同时一定程度上丰富了桑葚和葡萄深加工产品种类,促进果酒市场的发展。
桑葚(Morus nigra)、不同品种葡萄(巨峰(KG)、玻璃翠(GG)、乌黑子(BG)、维多利亚(VG)、红提(RG)、玫瑰香(MG)):采摘于新疆吐鲁番;柠檬酸、偏重亚硫酸钾(均为分析纯):广东百味佳味业科技股份有限公司;果胶酶(1×105U/g):德国AB酶制剂公司;酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BV818:安琪酵母有限公司;2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(均为分析纯):上海麦克林生化科技股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
MJ-WJE2802D原汁机、MJ-PB219榨汁机:广东美的生活电器制造有限公司;LB32T手持糖度折光仪:广州市铭睿电子科技有限公司;pHS-3C酸度计:上海仪电科学仪器股份有限公司;HWS-28恒温水浴锅:上海一恒科学仪器有限公司;JBI-250恒温培养箱:上海剑革电子科技有限公司;Multifuge X1R高速冷冻离心机:赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.3.1 桑葚葡萄复合果酒加工工艺流程及操作要点
操作要点:
原料预处理:选择成熟度高、果体均匀、饱满无虫害的桑葚和葡萄,桑葚使用原汁机压榨破碎,使用四层纱布过滤,去籽去梗,得到桑葚汁。葡萄去籽,将桑葚汁和葡萄按质量比9∶1的比例混合打浆。
成分调整:添加白砂糖调节混合发酵液初始糖度为22°Bx,添加柠檬酸调节pH至4.4。
酶解:添加0.005%(V/V)的果胶酶,置于45 ℃酶解2 h。
添加偏重亚硫酸钾:加入0.006%(V/V)质量浓度为28 mg/L偏重亚硫酸钾溶液,起到杀菌、抗氧化的作用。
酵母菌活化:称取0.03%的BV818酵母菌,加入5 mL的5%葡萄糖溶液,37 ℃活化30 min。
发酵:加入活化好的酵母菌,混合均匀,放置在恒温培养箱中发酵,发酵过程中每隔4 h搅拌、摇瓶,防止产生的气泡盖帽;每隔12 h对发酵液的可溶性固形物进行检测,根据理论情况,1%vol的酒精需要消耗17 g/L的蔗糖进行发酵,结合预计的酒精度,在残糖及酒精度基本不变时,终止发酵。
离心:用40目筛网过滤复合果酒,离心(6 000 r/min,15 min,4 ℃)后取上清液。
灭菌:将装有酒样的玻璃瓶放入锅中,在100 ℃热排气5~10 min,拧紧瓶盖,沸水煮灭菌15 min,取出冷却即得桑葚葡萄复合果酒成品。
1.3.2 不同品种的葡萄对桑葚葡萄复合果酒品质的影响
桑葚汁与不同品种葡萄(巨峰(KG)、玻璃翠(GG)、乌黑子(BG)、维多利亚(VG)、红提(RG)、玫瑰香(MG))分别按质量比9∶1进行混合打浆,同时设置一组不添加葡萄的桑葚汁(M)作为对照,以相同的条件进行发酵,试验重复3次。分别测定桑葚葡萄复合果酒发酵前的初始糖度、初始pH值以及发酵后的酒精度及总酸含量,并对桑葚葡萄复合果酒进行感官评定,确定桑葚葡萄复合果酒最适葡萄品种。
1.3.3 桑葚葡萄复合果酒发酵工艺优化
(1)单因素试验
在确定最适葡萄品种的基础上,设置桑葚汁与葡萄质量比分别为10∶0、9∶1、8∶2、7∶3和6∶4,初始糖度分别为16°Bx、18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx,初始pH值分别为3.6、4.0、4.4、4.8、5.2,发酵温度分别为16 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃,在发酵时间为60 h条件下分别考察桑葚汁与葡萄质量比、初始糖度、初始pH值、发酵温度对桑葚葡萄复合果酒感官评分及酒精度的影响。
(2)响应面试验
在单因素试验的基础上,固定桑葚汁与玫瑰香葡萄质量比为9∶1,以发酵温度(A)、初始pH值(B)、初始糖度(C)为自变量,以感官评分(Y)为响应值进行响应面试验优化,Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation process optimization
-1水平0 1因素A 发酵温度/℃B 初始pH值C 初始糖度/°Bx 18 4.0 20 20 4.4 22 22 4.8 24
1.3.4 分析检测
酒精度、总糖和总酸含量的测定:参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17];可溶性固形物含量的测定:采用手持糖度计;ABTS、DPPH、羟基自由基清除率测定:分光光度法[18-20];总酚含量测定:采用福林酚法;总黄酮含量的测定:采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法;总花色苷含量的测定:采用pH示差法[21]。
感官评价:参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》制定感官评分细则。感官评定小组由15名具有一定专业知识且经过培训的人员组成,依照感官评分标准对其色泽、澄清度、香味、口感及风格进行评价,感官评分标准见表2,满分100分,取平均值作为最终感官评分。
表2 桑葚葡萄复合果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards for mulberry-grape compound fruit wine
项目 感官评价标准 评分/分色泽、澄清度(10分)香味(30分)口感(40分)风格(20分)澄清透明,有光泽,紫色澄清,无杂物,红棕色浑浊,有悬浮物,暗紫红色酒香醇厚,有典型的桑葚果香酒香良好,有良好的桑葚果香酒香较少,桑葚果香味不足,但无异味无酒香和果香味,或有异味酒体丰满,口感舒服柔和酒质柔顺,柔和爽口,酸甜适当口感酸涩,风味不足风格独特,酒体协调风格明显,酒体较协调风格一般,酒体不协调9~10 6~8 0~5 27~30 20~26 10~20 0~9 36~40 25~35 0~24 18~20 10~17 0~9
1.3.5 数据处理
采用SPSS Statistics 26.0软件进行统计学分析和Origin 2023软件进行绘图,采用Design Expert 13.0软件进行响应面试验设计和结果分析。
不同品种葡萄对桑葚葡萄复合果酒理化指标及感官评分的影响结果分别见表3和图1。
图1 不同品种葡萄对桑葚葡萄复合果酒感官评分的影响
Fig.1 Effects of different grape varieties on sensory score of mulberry-grape compound fruit wine
表3 不同品种葡萄对桑葚葡萄复合果酒理化指标的影响
Table 3 Effects of different grape varieties on physicochemical indexes of mulberry-grape compound fruit wine
注:不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
项目 KG+M GG+M BG+M VG+M RG+M MG+M M初始糖度/°Bx初始pH值酒精度/%vol总酸/(g·L-1)17.03±0.15a 4.53±0.16a 7.95±0.12a 2.83±0.03e 15.87±0.12c 4.43±0.09a 7.73±0.09abc 3.35±0.04a 15.83±0.15c 4.41±0.06a 7.90±0.05ab 3.09±0.04c 16.00±0.20c 4.57±0.14a 7.20±0.19c 2.92±0.04de 15.30±0.26d 4.53±0.11a 7.37±0.24bc 3.25±0.05ab 16.47±0.15b 4.44±0.16a 8.10±0.14a 2.95±0.05d 15.10±0.17d 4.66±0.12a 7.70±0.42abc 3.21±0.08b
由表3可知,添加不同品种的葡萄使发酵液的初始糖度和初始pH值均不同,初始糖度相较于未添加葡萄M组均有所增高,初始pH值均比M组低,表明葡萄的糖含量比桑葚更高,pH比桑葚低,其中KG+M组初始糖含量显著高于其他组(P<0.05)。为了保证各组发酵前初始糖度和初始pH值一致,因此在7组发酵液中分别加入适量的白砂糖和柠檬酸,调节初始糖度至22°Bx,初始pH值至4.00。在发酵结束后,MG+M组的桑葚葡萄复合果酒样品酒精度最高,为8.10%vol,这说明在相同的发酵条件和时间下,玫瑰香葡萄的糖或者有机物更容易被酵母代谢转化为酒精。发酵后,GG+M组桑葚葡萄复合果酒样品总酸含量显著高于其他样品组(P<0.05),这可能是因为样品经过发酵过程生成的酸性物质更多,导致其总酸含量更高。
由图1可知,VG+M组和RG+M组桑葚葡萄复合果酒样品感官评分最低,分别为81.6分和81.8分,BG+M组和MG+M组桑葚葡萄复合果酒样品感官评分最高,均为87.8分。
综上,选择玫瑰香葡萄与桑葚混合发酵制备桑葚葡萄复合果酒。
2.2.1 原料配比对桑葚葡萄复合果酒感官评分和酒精度的影响
桑葚汁与玫瑰香葡萄质量比对桑葚葡萄复合果酒感官评分和酒精度的影响结果见图2。由图2可知,当桑葚汁与葡萄质量比为10∶0时,酒精度最低为8.0%vol,这可能是因为桑葚在发酵过程中产酸相对较多,影响酵母菌的活力,导致酒精度也降低;当桑葚汁与葡萄质量比为9∶1时,复合果酒感官评分和酒精度均达到最高,分别为84.6分和8.46%vol;当桑葚汁与葡萄质量比为8∶2、7∶3和6∶4时,感官评分逐渐下降,酒精度变化趋于平稳。此外,玫瑰香葡萄具有浓郁的玫瑰香味,若添加比例过大,可能会掩盖桑葚原有的风味,且苦涩味加重。因此,选取桑葚汁与玫瑰香葡萄最佳质量比为9∶1。
图2 桑葚汁与葡萄质量比对桑葚葡萄复合果酒感官评分及酒精度的影响
Fig.2 Effects of mass ratio of mulberry juice and muscat grape on sensory score and alcohol content of mulberry-grape compound fruit wine
2.2.2 初始糖度对桑葚葡萄复合果酒感官评分和酒精度的影响
初始糖度对桑葚葡萄复合果酒感官评分和酒精度的影响结果见图3。由图3可知,在初始糖度为16~24°Bx范围内,随着初始糖度的增加,果酒的感官评分和酒精度均呈先上升后下降的趋势。初始糖度为16~22°Bx时,感官评分和酒精度随之增加;当初始糖度为22°Bx时,感官评分和酒精度达到最高值,分别为85分和8.6%vol;当初始糖度>22°Bx之后,感官评分和酒精度随之降低。糖是酵母菌生长繁殖的重要碳源,也是生成酒精的重要底物。充足的糖分可以使发酵产生的酒精增多,同时提供更多的营养物质和风味化合物,使果酒更加饱满[22]。然而,过多的糖含量会增加发酵液的渗透压,导致酵母脱水和细胞壁分离,从而抑制酵母的活力,导致发酵不足,酒精含量降低,果酒口感和风味不佳。同时,初始含糖量过高也会使葡萄酒过于甜腻,影响发酵果酒的整体口感[23]。因此,选取最佳初始糖度为22°Bx。
图3 初始糖度对桑葚葡萄复合果酒感官评分及酒精度的影响
Fig.3 Effects of initial sugar content on sensory score and alcohol content of mulberry-grape compound fruit wine
2.2.3 初始pH值对桑葚葡萄复合果酒感官评分和酒精度的影响
初始pH值对桑葚葡萄复合果酒感官评分和酒精度的影响结果见图4。由图4可知,随着初始pH值在3.6~5.2范围内的增加,果酒的感官评分和酒精度呈现先上升后下降的趋势。当pH值在3.6~4.4时,感官评分和酒精度随之增加;当初始pH值为4.4时,感官评分最高,为85.6分,酒精度为8.46%vol;当初始pH值>4.4之后,感官评分有所下降,酒精度先稍微增加后下降。酵母菌适合在偏酸性的环境下生长,因此适宜的酸性环境有利于酵母菌的快速生长代谢进而完成酒体的发酵,较低的pH值不仅会影响酵母菌的生长,影响果酒的发酵,还会使其口感酸涩;较高的pH值会影响果酒的色泽和品质[24]。因此,选择最佳初始pH值为4.4。
图4 初始pH值对桑葚葡萄复合果酒感官评分及酒精度的影响
Fig.4 Effects of initial pH value on sensory score and alcohol content of mulberry-grape compound fruit wine
2.2.4 发酵温度对桑葚葡萄复合果酒感官评分及酒精度的影响
发酵温度对桑葚葡萄复合果酒感官评分和酒精度的影响结果见图5。由图5可知,随着发酵温度在16~24 ℃范围内的上升,酒精度先上升后趋于稳定,当发酵温度为20 ℃时,酒精度最高,为9.07%vol。当发酵温度在16~20 ℃范围内上升,感官评分随之增高;当发酵温度为20 ℃时,感官评分最高,为87.6分;当发酵温度>20 ℃之后,感官评分逐渐下降。其中原因可能是温度的变化调节酶促反应速率,影响风味物质的形成,使果酒在低温发酵环境下香味会更加浓郁,但会对酵母菌生长代谢起到抑制作用;随着发酵温度的升高,酵母菌的代谢活动更强,发酵更彻底,高的发酵温度虽然会加快酵母菌的生长速率,但过高温度会使酵母菌自溶,降低存活率,还会影响果酒的口感及风味[25]。因此,选取最佳发酵温度为20 ℃。
图5 发酵温度对桑葚葡萄复合果酒感官评分及酒精度的影响
Fig.5 Effects of fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mulberry-grape compound fruit wine
2.3.1 响应面试验结果及方差分析
在单因素试验结果的基础上,设定桑葚汁与玫瑰香葡萄质量比为9∶1,选取以发酵温度(A)、初始pH值(B)、初始糖度(C)为自变量,以感官评分(Y)为响应值,进行3因素3水平响应面试验,Box-Behnken试验设计及结果见表4,方差分析结果见表5。
表4 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation process optimization
试验号 A B C Y 感官评分/分1234567891 0 0 0-1-1-1 0-1 00010--1 00010001011 10-11 12 13 14 15 16 17 1110-1001-100001100-10-1-1 10 01 87.59 80.64 82.52 81.94 87.19 74.76 87.33 79.59 83.43 78.27 86.61 75.83 86.53 76.57 82.39 74.16 81.09
表5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注:“*”表示对结果影响显著(P<0.05);“**”表示对结果影响极显著(P<0.01)。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B********AC BC A2****B2 C2 165.76 68.31 225.81 68.31 10.16 4.52 10.16 447.29 494.59 65.08<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.015 3 0.071 2 0.015 3<0.000 1<0.000 1<0.000 1****残差失拟项纯误差总差330.33 15.12 50.00 15.13 2.25 1.00 2.25 99.04 109.52 14.41 1.55 0.75 0.80 331.88 91111111117341 6 36.7 15.12 50.00 15.13 2.25 1.00 2.25 99.04 109.52 14.41 0.221 4 0.25 0.20 1.25 0.402 8
使用Design Expert 13.0软件对表4的数据结果进行二次多项回归拟合,得到复合果酒感官评分与3个因素之间的二次多元回归方程如下:
Y=-1 385.875+49.187 5A+326.125B+22.662 5C-0.937 5AB+0.125AC-0.937 5BC-1.212 5A2-31.875B2-0.462 5C2
由表5可知,回归模型极显著(P<0.01),失拟项不显著(P=0.402 8>0.05),说明试验结果受到的干扰极小;决定系数R2为0.995 3,调整决定系数R2Adj为0.989 3,预测决定系数R2Pre为0.960 1,说明拟合回归方程可信度和拟合度均较高,可利用该模型分析和预测桑葚葡萄复合果酒的发酵工艺条件。由P值可知,一次项A、B、C,二次项A2、B2、C2对感官评分影响极显著(P<0.01),交互项AB、BC对感官评分影响显著(P<0.05),交互项AC对结果影响不显著(P>0.05)。由F值可知,3个因素对桑葚复合果酒感官评分的影响顺序为初始pH值(B)>发酵温度(A)=初始糖度(C)。
2.3.2 响应面交互作用分析
根据响应曲面的陡峭程度、等高线的形状和稀疏程度,可以推测出每个因素之间的交互作用对感官评分的影响。各因素间交互作用对桑葚葡萄复合果酒感官评分影响的响应面见图6。
图6 各因素之间交互作用对桑葚葡萄复合果酒感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of the interaction between various factors on sensory score of mulberry-grape compound fruit wine
由图6可知,发酵温度(A)和初始pH值(B)交互作用的响应曲面、初始pH值(B)和初始糖度(C)交互作用的响应曲面陡峭,等高线接近椭圆形,说明AB、BC交互作用对感官评分影响较大,这与回归模型方差分析结果一致。
2.3.3 验证试验
通过Design-Expert 13.0软件分析得出的桑葚葡萄复合果酒最佳发酵工艺条件为发酵温度19.712 ℃,初始pH值为4.493,初始糖度22.609°Bx,在该条件下复合果酒感官评分预测值为87.8分。考虑到实际操作可行性,将优化发酵工艺条件修正为发酵温度20 ℃,初始pH值为4.4,初始糖度22°Bx。并在此发酵条件下进行3次平行验证试验,得到桑葚复合果酒感官评分实际值为87.3分,与预测值接近,表明该模型可用于优化桑葚复合果酒的发酵工艺。
为探究以最优发酵工艺发酵得到的桑葚复合果酒品质的变化,对其发酵前后主要理化指标进行测定分析,结果见表6。由表6可知,经过60 h发酵,可溶性固形物含量降低了11.8°Bx,总糖含量显著下降(P<0.05),由219.60 g/L下降至60.7 g/L,酒精度为7.86%vol,这是因为酵母菌利用果汁中的糖进行无氧呼吸产生酒精,导致总糖含量下降,酒精度上升。总酸含量相较发酵前升高了1.77 g/L,pH值从4.40降低到4.26,这可能是在发酵过程中产生了有机酸及挥发酸[26-27],导致总酸含量显著升高(P<0.05)。
表6 桑葚葡萄复合果酒发酵前后主要理化指标变化
Table 6 Changes of main physicochemical indexes of mulberry grape compound fruit wine before and after fermentation
指标 发酵前 发酵后pH值可溶性固形物含量/°Bx总糖含量/(g·L-1)总酸含量/(g·L-1)酒精度/%vol 4.40±0.23a 22.00±0.08a 219.60±1.30a 1.18±0.01b 0 4.26±0.16a 10.20±0.3b 60.70±0.86b 2.95±0.54a 7.86±0.21
发酵前后的抗氧化活性与功能性物质含量结果见图7。由图7a可知,ABTS自由基清除率在发酵前后趋于稳定,没有明显变化。而DPPH和羟基自由基清除率经过60 h发酵显著上升(P<0.05),分别升高了12.32%和24.03%,这可能是由于发酵液中的酚酸和类黄酮等抗氧化性物质的生成[28],导致其抗氧化活性的增强。由图7b可知,总酚与总黄酮含量在发酵60 h后分别上升了159.67 mg/L和34.46 mg/L,可能由于发酵过程中产生酒精,促进酚类物质的生物转化与合成,导致酚类物质的积累,这与上述结果相辅相成。总花色苷含量反而显著下降48.93 mg/L(P<0.05),这可能是由于一些花青素被酵母细胞壁吸附或者形成沉淀[29]。
图7 桑葚葡萄复合果酒发酵前后抗氧化活性(A)及功能性物质含量(B)变化
Fig.7 Changes of antioxidant activities (A) and functional substance contents (B) of mulberry-grape compound fruit wine before and after fermentation
酿造桑葚葡萄复合果酒最适宜的葡萄品种为玫瑰香葡萄,采用单因素试验及响应面优化试验确定最佳的发酵工艺条件为桑葚汁与玫瑰香葡萄质量比9∶1,发酵温度20 ℃,初始pH值4.4,初始糖度22°Bx。在此优化条件下,桑葚葡萄复合果酒的酒精度为7.86%vol,感官评分为87.3分。经过发酵60 h后,果酒中总糖含量降低,可滴定酸总含量升高,ABTS、DPPH和OH自由基清除率分别为99.55%、97.44%和97.87%。ABTS自由基清除率趋于稳定,变化不明显,而DPPH、OH自由基清除率、总酚及总黄酮均呈现上升趋势,提升了复合果酒的抗氧化性。本研究为桑葚葡萄复合果酒产业化生产奠定了理论基础。
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Optimization of fermentation process of mulberry-grape compound fruit wine by response surface methodology