新疆拥有丰富的葡萄资源，是我国栽培面积最大和产量最高的地区，2020年新疆葡萄面积和产量，分别为12.3万hm2和305万t[1-2]。木纳格葡萄（Vitis vinifera L.cv.Munage）又名冬葡萄、葡萄、戈壁葡萄，是新疆南疆地区特色晚熟鲜食葡萄品种之一，分为红木纳格和白木纳格，粒大、皮薄、糖度高、果肉厚而脆[3-4]。沙枣（Elaeagnus angustifolia L.）也称七里香、桂香柳、吉格代等，是多年生落叶乔木的一种，分属于胡颓子科胡颓子属（Elaeagnus）[5]，是重要的防风固沙树种，其花、果、叶等均有经济价值，也是一种重要的经济树种。研究表明，沙枣中含有丰富的多酚类化合物，这些物质具有很好的营养价值和抗氧化、抗炎活性，对体内自由基的清除有着极大效果，可抑制脂质氧化、延缓衰老、预防肿瘤、防止多种疾病的发生，是一种天然绿色的抗氧化剂[6]。
为了更好的利用当地果品资源，开发新型发酵产品，将新疆特色鲜食葡萄木纳格及特色农产品沙枣果实为原料，经过微生物代谢途径转化为更易被人体吸收、利用的产物[7]。既能减轻葡萄集中上市带来的销售压力，也可解决沙枣加工产品单一的问题，还能在保持其独特的风味和自然营养价值的同时，在营养成分、色泽和香味方面也能得到最好的互补作用[8]。发酵有利于原料中营养物质的保存，同时提高浸提液中可溶性固形物的提取率，从而提高产品中有效功能性成分的含量[9-10]。本研究以新疆木纳格葡萄、沙枣为主要原料，经对其加工工艺进行优化，得到一款营养健康、口味独特的木纳格葡萄复合果酒，通过对复合果酒抗氧化性测定，以期为新疆特色果酒的提供理论支持，同时也为复合果酒行业发展提供新的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
木纳格葡萄（Vitis vinifera L.cv.Munage）：喀什库尔兰农贸市场；沙枣（Elaeagnus angustifolia L.）：阿克苏地区温宿县沙枣林业合作社；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y45：喀什大学生命与地理科学学院实验室；蔗糖（食品级）：市售；果胶酶（30 000 U/g）：肇东日成酶制剂有限公司；柠檬酸（分析纯）：江西华豫源生物科技有限公司；胃蛋白酶（酶活2 500 U/L）：上海宸鸿生物技术有限公司；D-抗坏血酸钠：诸城华源生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-联氮-双（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzoth iazoline-6-sulfonic acid），ABTS）（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
LE2002E/02电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SPX-250B生化培养箱：常州诺基仪器有限公司；S-3C pH计：上海精密科学仪器有限公司；MC202231手持糖度计：成都泰光学有限公司；HH-S6恒温水浴锅：江苏金怡仪器科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 木纳格葡萄沙枣复合果酒发酵工艺流程及操作要点
操作要点：
葡萄汁制备：手工将葡萄梗部全部去除，剔除掉成熟度不高、腐烂和霉变的果粒；然后用螺旋榨汁机榨汁，在破碎的汁液中加入0.04 g/L D-抗坏血酸钠、40 mg/L果胶酶分别进行护色、酶解；用八层无菌纱布过滤杂质，得到葡萄汁发酵原液，4 ℃冷藏。
沙枣汁制备：选取成熟度一致、颜色均匀、无病虫害和霉变的沙枣果；用清水洗去表皮泥沙，再放入锅中预煮（100 ℃、15 min）；去核后的沙枣放入打浆机中加入葡萄汁进行打浆处理；用八层无菌纱布过滤掉杂质，得到沙枣汁液，4 ℃冷藏。
成分调整：将葡萄汁和沙枣汁按照3∶2（V/V）比例混合于3 000 mL锥形瓶中，通过添加白砂糖将果汁糖度调整为适合糖度。
发酵：按一定比例接入活化好（20 g/L糖水活化15 min）的酿酒酵母Y45进行发酵，置于恒温培养箱中发酵，发酵结束（酒精度不变，残糖含量＜4g/L）后立即于4℃条件下冷藏。
过滤：用8层洁净纱布粗过滤后，滤液4 000 r/min离心10 min，取上清液。
杀菌：在85 ℃水浴锅中杀菌30 min。
冷却、灌装：将杀菌后的沙枣汁放置冰箱快速冷却至20 ℃，灌装后得到木纳格葡萄沙枣复合果酒。
1.3.2 木纳格葡萄沙枣复合果酒发酵工艺优化单因素试验
以初始糖度24°Bx，酵母菌接种量0.4%，发酵时间7 d，发酵温度24 ℃为初始条件，每次改变其中一个条件，分别考察初始糖度（18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx、26°Bx）、酵母菌接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、发酵时间（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d）、发酵温度（20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃）对木纳格葡萄沙枣复合果酒品质的影响。
1.3.3 木纳格葡萄沙枣复合果酒发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以木纳格葡萄沙枣复合果酒的感官评分为考察指标，选取对复合果酒品质影响较大的3个因素，初始糖度（A）、酵母菌接种量（B）、发酵温度（C）设计3因素3水平L9（33）正交试验。正交试验因素与水平见表1。
表1 木纳格葡萄沙枣复合果酒发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization of Munage grape-Elaeagnus angustifolia compound fruit wine
水平 A 初始糖度/°Bx B 酵母菌接种量/% C 发酵温度/℃1 220.322 2 240.424 3 260.526
1.3.4 测定方法
总酸含量、酒精度：参照15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》检测[11]；可溶性固形物：用折光计法测定；pH：用酸度计测定。
沙门氏菌、金黄色葡萄球菌：按照GB 4789.25—2024《食品安全国家标准食品微生物学检验酒类、饮料、冷冻饮品采样和检样处理》进行测定[12]。
总酚含量：参考吴澎等[13]的福林酚方法；总黄酮含量：参考于梅等[14]的方法；黄烷-3-醇含量：参考卫颖[15]的方法进行测定。
感官评价：由10名食品专业学生经培训组成感官评定小组分别从复合果酒的色泽、气味、口感、组织形态4个指标进行感官评价，满分100分，取10人平均分。葡萄复合果酒感官评分标准见表2。
表2 木纳格葡萄沙枣复合果酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Munage grape-Elaeagnus angustifolia compound fruit wine
项目 评分标准 分值/分色泽（20分）色泽均一，黄色泽差别不明显，淡黄色色泽不均匀，颜色暗淡16～20 10～15＜10
续表
项目 评分标准 分值/分气味（25分）口感（40分）组织形态（15分）有两种果香，果香和酒香平衡，无刺激性气味有两种果香，酒精气味稍浓郁，无异味无两种果香不突出，酒精气味过浓，有刺激性气味酸甜适中，口感细腻，回味绵延，无杂味过甜或过酸，稍具苦涩，有回味感有少许苦涩味，伴有酸涩味澄清，无悬浮物，均匀分布，无沉淀基本澄清，有轻微分层现象，无肉眼可见杂质少许浑浊，分层明显，有杂质沉淀20～25 16～20＜15 36～40 30～35＜30 11～15 5～10＜5
1.3.5 体外抗氧化活性测定
DPPH自由基清除能力的测定：参照杨冰鑫等[16]的测定方法；ABTS+自由基清除能力的测定：参考秦晋颖等[17]的测定方法；羟基自由基（·OH）清除能力的测定：参照YANG H等[18]的测定方法。
1.3.6 数据处理
所有的试验重复3次，结果表示为“平均值±标准差”，试验数据采用Origin85和SPSS22软件进行处理。
2 结果与分析
2.1 木纳格葡萄沙枣复合果酒发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 初始糖度对木纳格葡萄沙枣复合果酒酒精度及感官评价的影响
从图1可知，随着初始糖度的增加，木纳格葡萄沙枣复合果酒的酒精度呈持续上升趋势、感官评分呈先升高后降低的趋势；当初始糖度为24°Bx时，酒精度为10.1%vol，感官评分达到最大值为75.2分。初始糖度较低时，发酵底物不足，导致发酵速度过快，不利于风味物质的形成，香气不足，感官评分低；初始糖度较高时，抑制酵母菌的繁殖，发酵不彻底，不利于酒精的产生，酒体单薄，感官评分下降[19]。因此，选择最佳初始糖度为24°Bx。
图1 初始糖度对木纳格葡萄沙枣复合果酒酒精度及感官评分的影响
Fig.1 Effect of initial sugar contents on the alcohol content and sensory score of Munage grape-Elaeagnus angustifolia compound fruit wine
2.1.2 酵母菌接种量对木纳格葡萄沙枣复合果酒酒精度及感官评价的影响
从图2可知，随酵母菌接种量的增加，复合果酒的酒精度呈先升高后平缓的趋势、感官评分均呈先升高后降低的趋势；当酵母菌接种量为0.4%时，复合果酒酒精度为9.4%vol，感官评分最高为73.4分。当酵母菌接种量较小时，发酵液中的糖不能完全被酵母菌利用转化，酒精度较低；当接种量较大时，酵母菌会大量生长繁殖，发酵速率过快，反而使发酵不充分，酒精度降低，果酒变得寡淡[20]。因此，选择最佳酵母菌接种量为0.4%。
图2 酵母菌接种量对木纳格葡萄沙枣复合果酒酒精度及感官评分的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculum on the alcohol content and sensory score of Munage grape-Elaeagnus angustifolia compound fruit wine
2.1.3 发酵时间对木纳格葡萄沙枣复合果酒酒精度及感官评价的影响
从图3可知，随着发酵时间的延长，复合果酒的酒精度呈先升高后平缓的趋势，感官评分呈先升高后降低的趋势；当发酵时间为7 d时，复合果酒酒精度为9.7%，感官评分最高为75.7分。当发酵时间较短时，导致发酵不彻底，糖没有被酵母充分利用，使酒体寡淡，酒体中残糖含量高；当发酵时间较长时，果酒中残糖含量偏低，口感偏酸，酒体不协调，感官评分下降[21]。因此，选择最佳发酵时间为7 d。
图3 发酵时间对木纳格葡萄沙枣复合果酒酒精度及感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on the alcohol content and sensory score of Munage grape-Elaeagnus angustifolia compound fruit wine
2.1.4 发酵温度对木纳格葡萄沙枣复合果酒酒精度及感官评价的影响
从图4可知，随着发酵温度的升高，复合果酒的酒精度、感官评分均呈先升高后降低的趋势；当发酵温度为24 ℃时，复合果酒酒精度与感官评分均最高，分别为10.4%vol、83.7分。当发酵温度较低时，酵母生长繁殖速度较慢；而发酵温度较高则会导致酵母出现自溶现象，从而影响发酵进程[22]。因此，选择最佳发酵温度为24 ℃。
图4 发酵温度对木纳格葡萄沙枣复合果酒酒精度及感官评分的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on the alcohol content and sensory score of Munage grape-Elaeagnus angustifolia compound fruit wine
2.2 木纳格葡萄沙枣复合果酒发酵工艺优化正交试验
木纳格葡萄沙枣复合果酒发酵工艺优化正交试验结果与分析见表3。
表3 木纳格葡萄沙枣复合果酒发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization of Munage grape-Elaeagnus angustifolia compound fruit wine
试验号 A B C 感官评分/分123456789K1K2K3R 111222333 123231213 123231312 81.5 79.5 75.7 84.9 82.6 83.6 77.2 70.4 76.0 78.90 83.70 74.53 9.17 78.50 80.53 78.10 2.43 78.50 80.13 78.50 1.63
由表3可知，根据极差R值可知，影响木纳格葡萄沙枣复合果酒感官评分结果的因素主次顺序为：初始糖度（A）＞酵母菌接种量（B）＞发酵温度（C），根据k值可知，最佳发酵工艺为A2B2C2，即初始糖度24°Bx，酵母接种量0.4%，发酵温度24 ℃时，在此条件下所酿制的木纳格葡萄沙枣复合果酒色泽亮黄、酒香良好、酸甜适中、口感突出、清澈透明、无肉眼可见杂质，感官评分为85.2分。
2.3 木纳格葡萄沙枣复合果酒理化及微生物指标分析
在最优发酵工艺条件下酿造制得的木纳格葡萄沙枣复合果酒酒精度为10.3%vol、pH值为3.8、总酸含量为9.1 g/L、可溶性固形物含量为7.3%；沙门氏菌、金黄色葡萄球菌未检出，符合GB 2758—2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》要求。
2.4 木纳格葡萄沙枣复合果酒抗氧化能力分析
由图5可知，当样品用量为2.0 mL时，维生素C（vitamin C，VC）及发酵前后样品的DPPH、ABTS+、羟基自由基清除率分别为98.1%、95.3%、96.8%，92.9%、92.1%、92.5%，93.2%、85.8%、92.4%，发酵后的木纳格葡萄沙枣复合果酒样品的3种自由基清除率均低于VC、高于发酵前的样品，表明木纳格葡萄沙枣复合果酒具有一定的抗氧化能力。
图5 木纳格葡萄沙枣复合果酒对DPPH（a）、ABTS+（b）及羟基（c）自由基的清除率
Fig.5 Scavenging rate of DPPH (a), ABTS+(b) and hydroxyl (c) free radicals in Munage grape-Elaeagnus angustifolia compound fruit wine
2.5 木纳格葡萄沙枣复合果酒中酚类物质含量
木纳格葡萄沙枣复合果酒的保健作用源于其中的生物活性成分，主要存在于植物组织器官主来来自于植物及其自身的次生代谢产物[23-25]。酚类化合物在果蔬及其制品中存在较为广泛，是葡萄果酒中重要的组成部分，影响其感官品质，也是抗氧化作用的主要发挥者[26]，被认为是葡萄酒保健功能的来源[27]。近些年来，诸多科研人员通过实验发现DPPH自由基清除能力的变化主要与酚类物质含量的变化有关[28]，DPPH自由基清除能力与酚类物质含量相关，酚类物质含量越高，DPPH自由基清除能力越强[29]，对机体健康有着明显的改善作用。发酵前后的木纳格葡萄沙枣复合果酒的总酚含量分别为221.5 mg/L、325.3 mg/L，总黄酮含量分别为132.7 mg/L、294.9 mg/L，黄烷-3-醇的含量分别为40.7 mg/L、168.5 mg/L。发酵后木纳格葡萄沙枣复合果酒样品中总酚、总黄酮、黄烷-3-醇含量均显著升高（P＜0.05）。
3 结论
通过单因素和正交试验得到木纳格葡萄沙枣复合果酒最佳发酵工艺为初始糖度24°Bx，酵母接种量0.4%，发酵时间7 d，发酵温度24 ℃，在此条件下发酵制得的木纳格葡萄沙枣复合果酒呈橙黄色，酒体清亮，果香浓郁，酒香醇厚，酒精度为10.3%vol，感官评分为85.2分，其理化及微生物指标均符合相关标准要求。发酵后的复合果酒ABTS+、DPPH、羟基自由基清除能力较发酵前均提高，总酚、总黄酮、黄烷-3-醇含量均显著提高（P＜0.05），表明木纳格葡萄沙枣复合果酒具有一定的抗氧化活性。木纳格葡萄沙枣复合果酒的产生丰富了新疆葡萄酒品类，改善葡萄酒市场的单一性，填补复合果酒市场上以沙枣植物为原料的空白，为新疆沙枣植物的开发利用提供了一条创新的道路，同时，为新疆特色复合果酒的产业化奠定基础。
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