据统计，铁缺陷在亚洲国家仍然普遍存在，其会导致贫血、疲劳、发育迟缓、认知障碍和不良妊娠等后果[1-2]。从全球公共卫生的角度来看，铁元素的食品强化是最具成本效益的干预措施之一。铁强化主食（如面粉、盐和油）和强化调味品（如富铁酱油）等已作为提高微量营养素摄入的额外方式[3]。除此之外，近年来，还有有关越南的铁强化鱼露、摩洛哥的铁碘双重强化盐和非洲的铁强化肉汤块等的报道[4]。
乙二胺四乙酸铁钠（sodium ferric ethylenediaminetetraacetate，NaFeEDTA），理论含铁量为13.26%，常温（20 ℃）条件下在水中溶解度为10%。其无铁腥味、口感好、无沉淀、色泽也正常、不易被氧化，且在酸性条件下性质较稳定，可避免植酸对铁剂吸收的障碍，铁的生物利用率为FeSO4的2～3倍。因此，NaFeEDTA常作为食品中的优质铁元素营养强化剂。
腌渍蔬菜在中国甚至全亚洲具有悠久的食用历史，因其独特的风味和口感在高、中和低收入人群中广泛消费[5-6]。腌菜作为一种常见的开胃食品，采用乳酸菌进行发酵，因此含有丰富的酸味物质，研究表明，酸味物质可促进矿物元素在机体的吸收，其中有机酸不仅可以增酸还可增加风味[7]。然而，关于铁强化腌渍蔬菜的数据相当有限。
密刺黄瓜多产自河北、山东等地区，既适合春露地的早熟栽培，又可大棚种植，四季均有收获，适合全年的腌渍食用[8]。本研究以腌渍黄瓜为对象，探究NaFeEDTA对腌渍黄瓜还原糖、总酸、有机酸含量及微观形态和感官品质影响，并以大鼠为研究对象，评价其补铁效果，以期为实现铁强化腌渍蔬菜并增加其吸收率提供一定的理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
新鲜密刺黄瓜：河北省沧州市市售；
耐盐乳酸菌CICC 10286、嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）：由沧州市食品药品检验所微生物实验室保藏；
NaFeEDTA（分析纯）：北京索莱宝科技股份有限公司；MRS肉汤培养基、改良MRS乳酸菌琼脂培养基：上海迈瑞尔生化科技有限公司；氯化钠、氢氧化钠、磷酸二氢钾（均为分析纯）：天津市江天化工技术股份有限公司；酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、丙酸标准品（均为色谱纯）：上海源叶生物科技有限公司；血红蛋白ELISA试剂盒：上海恒远生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
COXEM扫描电镜：北京天耀科技有限公司；LGJ-10N/C冷冻干燥机：北京亚星仪科科技发展有限公司；PHSJ-6L型实验室pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；JIDI-20D台式高速离心机：广州吉迪仪器有限公司；T5自动电位滴定仪：梅特勒-托利多国际有限公司；QQXH-E旋涡混合器：上海启前电子科技有限公司；SZ-DC-P3全自动测色色差计：山东桑泽仪器有限公司；BSI-103叠加式振荡培养箱生物摇床：上海贝茵生物科技有限公司；LS-100HD立式压力蒸汽灭菌器：南北仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的活化
将冷冻贮藏的耐盐乳酸菌接种于改良MRS乳酸菌琼脂培养基37 ℃培养24 h，筛选出单菌落接于MRS液体培养基中扩大培养，37 ℃培养至对数期，5 000 r/min离心10 min收集菌体，无菌生理盐水（0.9%）重悬菌体后再次离心，重复2次后备用。
1.3.2 新鲜黄瓜的腌渍
用流动的水清洗新鲜黄瓜，洗净后切成规格为6 cm×2.0 cm×2.0 cm的长方体小块，使用鼓风干燥箱烘干（45 ℃、1 h）黄瓜表面水分，称取50 g黄瓜于500 mL三角瓶中。对照组加入氯化钠使终质量浓度为150 g/L，铁元素强化组再分别加入相应乙二胺四乙酸铁钠使终质量分数分别为0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，分别加入培养至对数期的乳酸菌（1×106 CFU/g）后密封腌渍（26 ℃、相对湿度30%）19 d。每隔3 d取样进行测定。
1.3.3 测定方法
还原糖含量的测定：采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法。
总酸含量的测定：量取10 g均质后的瓜体研磨物，加入25～30 mL蒸馏水于测量杯中，使用氢氧化钠（0.05 mol/L）溶液在自动电位滴定仪下进行滴定，空白对照为35～40 mL蒸馏水使用氢氧化钠（0.05 mol/L）溶液滴定，滴定终点pH值为8.2±0.2，以乳酸计。
有机酸含量的测定：准确称取待测有机酸标准品，超纯水溶解至不同浓度，经有机微孔纤维素滤膜（0.45 μm）过滤。准确称取5.00 g样品匀浆，KH2PO4溶液（0.03 mol/L）稀释至25 mL（准确定容），超声提取40 min后5 000 r/min离心5 min，取上清经上述滤膜（0.45 μm）过滤后进样。色谱条件：Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm），柱温（30±2）℃；流动相为KH2PO4（0.03 mol/L，pH 3.0）；检测器为紫外检测器（SPD-20A，波长210 nm）；流速控制在0.5 mL/min；进样量为20 μL。定性定量方法：根据目标物标准品色谱图保留时间进行定性；以各目标物质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，分别绘制有机酸标准工作曲线，按照标准曲线回归方程计算样品中各有机酸含量。有机酸标准品的保留时间、相关系数及回归方程见表1。
表1 有机酸标准品保留时间、相关系数及回归方程
Table 1 Retention time, correlation coefficient and regression equation of organic acid standards
有机酸 保留时间/min相关系数（R2）回归方程酒石酸甲酸苹果酸乳酸乙酸柠檬酸富马酸琥珀酸丙酸7.405 8.08 9.995 12.487 13.765 18.189 20.156 24.773 37.615 0.999 0 0.999 6 0.999 4 0.999 5 0.999 5 0.999 9 0.997 3 0.999 4 0.999 9 Y=51 938 468X+195 281.166 7 Y=17 970 088.33X-37 172.75 Y=18 142 832.67X+18 313.166 67 Y=10 027 235.67X-24 533.416 67 Y=9 668 282.667X-39 050.166 67 Y=22 500 567.33X+217 898 Y=12 167 449 007X+32 119 821.858 Y=9 663 885.333X-52 687 Y=10 576 760.33X-129 218.083 3
1.3.4 腌渍黄瓜微观结构的测定
挑选形态完整的样品，取中部位置进行组织切片，厚度为2～3 mm，蒸馏水迅速漂洗2～3次后将样品置于真空冷冻干燥机（18±2）h，最后将样本固定于双面胶导电碳膜上进行喷金，扫描电镜下观察并拍照。
1.3.5 感官评价
从沧州市食品药品检验所研究人员以及天津科技大学食品科学与工程学院在校学生中挑选10人（5男5女）组成感官评价小组，经培训后对样品进行感官评分，评价标准如表2所示。
表2 腌渍黄瓜感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of pickled cucumber
项目 评定标准 评分/分形态色泽滋味气味质地形态完整，无明显破损形态较完整，带细小划痕形态不完整，有明显破损形态非常不完整，有明显残缺颜色新鲜、翠绿颜色绿中带黄颜色较黄，无光泽颜色发乌，严重黄变具有黄瓜清香，口感适中，不咸不淡黄瓜香气较淡，口感一般，偏咸或偏淡黄瓜香味轻微，口感较差无黄瓜特征性香气，口感不好咸鲜味，且无任何不良气味鲜味，无不良气味无明显鲜味有不良气味或刺激气味质地脆嫩不够脆嫩黄瓜偏软或者偏硬黄瓜太硬或太软20 15～19 10～14 0～9 20 15～19 10～14 0～9 20 15～19 10～14 0～9 20 15～19 10～14 0～9 20 15～19 10～14 0～9
1.3.6 铁吸收率评价
选用无特定病原体（specific pathogen free，SPF）白色封闭群SD大鼠，体质量（180±20）g，正常组自由摄取常规饲料。缺铁性贫血大鼠模型的构建采用低铁饲料进行喂养，喂饲动物14 d后可出现缺铁性贫血，为加速造模，最后5 d加用鼠尾放血法，最终血红蛋白含量≤100 g/L以下进行后续补铁试验。按正常成年人食用铁推荐量为20～25 mg/d，每日腌渍黄瓜摄入量约为1.50 g/kg体质量，折合成大鼠体质量进行灌胃，每日一次，共28 d。模型组每日灌胃相同体积去离子水。第29天断脊取血和脾脏进行相关指标测定。
1.3.7 统计学分析
采用SPSS 25.0统计软件进行独立样本t检验，P值＜0.05表明差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜发酵过程中还原糖含量的影响
乳酸菌不具有分解植物中纤维素和蛋白质的酶系统，因此可以极大程度保持腌渍蔬菜的完整形态，并通过同型或异型等发酵途径利用葡萄糖等还原糖产生一系列有机酸，增加腌渍食品的风味，因此在发酵过程中还原糖处于一种被消耗的过程[9-10]。有研究表明，乳酸菌对于金属离子（包括铁）具有一定的富集作用，并且适宜浓度的铁离子对于其生长具有一定的促进作用[11]。NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜发酵过程中还原糖含量的影响见图1。
图1 NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜发酵过程中还原糖含量的影响
Fig.1 Effect of NaFeEDTA addition on reducing sugar contents of pickled cucumber during fermentation process
由图1可知，各发酵组在1～4 d还原糖含量下降趋势明显，这与乳酸菌的大量繁殖有关；除对照组和添加0.25%NaFeEDTA组外，其余各组在13～16 d还原糖下降趋势依旧显著，说明乳酸菌对铁进行了富集，从而持续生长繁殖，然而，铁浓度过大时，反而会一定程度上抑制其生长，影响其对有机物的代谢利用。还原糖是乳酸菌发酵产生酸类物质的主要来源，还原糖利用率的高低可以映射出乳酸菌的产酸代谢率，然而体系中较高的总酸含量也会反向抑制糖的代谢，降低糖利用率，与此同时，植物细胞的呼吸作用也会消耗一部分还原糖，这一系列的反应均对盐渍黄瓜还原糖含量产生影响。
2.2 NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜发酵过程中pH和总酸含量的影响
铁可存在于乳酸菌的细胞壁、细胞膜、线粒体和细胞溶胶中，有的在细胞外与细胞排出的配体进行外螯合，有的参与细胞内代谢，如果铁离子进入细胞过多，就会有一部分铁离子流出[12-13]。NaFeEDTA是一种被糖醇和氨基酸螯合后易吸收的小分子，从而避免了铁离子氧化沉淀，有利于营养铁的吸收，腌渍黄瓜pH与总酸含量变化与微生物发酵相关[14]。NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜发酵过程中pH值和总酸的影响见图2。
图2 NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜发酵过程中pH值（a）和总酸含量（b）的影响
Fig.2 Effect of NaFeEDTA addition on pH value and total acid contents of pickled cucumber during fermentation process
由图2（a）可知，除对照组外，其余发酵组pH整体呈下降趋势；对照组波动较大，在第10天达到平衡，较高的氯化钠浓度改变植物和微生物细胞内部渗透压，从而影响其代谢循环，部分NaFeEDTA附着于细胞膜以及细胞溶胶中，维持细胞内部平衡；其余组在第16天达到平衡，pH值的稳定意味着微生物活跃期的终止，最终pH值为对照组＞添加0.10%NaFeEDTA组＞添加0.20%NaFeEDTA组＞添加0.25%NaFeEDTA组＞添加0.15%NaFeEDTA组，且pH值为4.7～5.0。由图2（b）可知，对照组的总酸含量在第10天趋于稳定，其余发酵组在13～16 d时趋于稳定，最终总酸含量为0.15%NaFeEDTA组＞添加0.25%NaFeEDTA 组＞添加0.20%NaFeEDTA组＞添加0.10%NaFeEDTA组＞对照组，且总酸含量为0.35～0.40 g/100 mL，高于对照组。
2.3 NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜有机酸含量的影响
腌渍蔬菜的品质与初级代谢产物和次级代谢产物的平衡有关[15]。葡萄糖和果糖是果蔬中的主要糖类，这些初级代谢物的含量受品种、气候和营养状况的影响；而次级代谢产物受乳酸菌发酵的影响，乳酸菌代谢旺盛，处于三羧酸循环活跃期，可产生丰富的有机酸；除此之外，次级代谢产物还受植物自身呼吸的影响，如苹果酸和柠檬酸就是植物呼吸作用的主要底物[16-17]。NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜有机酸含量的影响见表3。
表3 NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜发酵过程中有机酸含量的影响
Table 3 Effect of NaFeEDTA addition on organic acid contents of pickled cucumber during fermentation process
有机酸/（mg·100 g-1）氯化钠组氯化钠+0.10%NaFeEDTA组氯化钠+0.15%NaFeEDTA组氯化钠+0.20%NaFeEDTA组氯化钠+0.25%NaFeEDTA组酒石酸甲酸苹果酸乳酸乙酸柠檬酸富马酸琥珀酸丙酸/0.015 34.171 0.008 0.002 6.242 0.250 0.017 0.015 0.230 0.010 117.501 0.005 0.010 12.331 0.290 0.055 0.018 0.320 0.011 161.302 0.003 0.012 18.562 0.370 0.045 0.016 0.280 0.013 149.196 0.010 0.011 13.769 0.320 0.031 0.016 0.220 0.014 143.599 0.020 0.010 15.263 0.300 0.042 0.019
由表3可知，腌渍黄瓜中主要有机酸为苹果酸和柠檬酸。NaFeEDTA发酵组的苹果酸含量均高于对照组，其中0.15%NaFeEDTA添加组的苹果酸、柠檬酸含量最高，分别为161.302 mg/100 g和18.562 mg/100 g。苹果酸呈现爽快感的酸味，较柠檬酸更柔和一些。苹果酸和柠檬酸作为常见有机酸，它们具有酸性的特性同时，有助于降低胃酸的pH值，从而改善铁的可溶性，促进机体对铁的吸收[18]。
除苹果酸和柠檬酸外，还检测出7种有机酸，分别为酒石酸、甲酸、乳酸、乙酸、富马酸、琥珀酸和丙酸；其中添加0.15%NaFeEDTA组酒石酸和富马酸含量最高，分别为0.320mg/100g和0.370 mg/100 g，其次为添加0.20%NaFeEDTA组，含量分别为0.280 mg/100 g和0.320 mg/100 g。酒石酸提供酸味的同时具有良好的持久性和稳固性，有利于保持产品的风味和色泽；乳酸可以带来如奶油、黄油般丝滑的口感，增添风味的复杂度；琥珀酸相对的钠盐具有独特的鲜贝风味；富马酸具有特殊酸味，其酸感强度约为柠檬酸的1.5倍。有机酸在提供风味的同时还起到抑制其他腐败菌生长的作用。
2.4 NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜微观结构的影响
由图3可知，密刺黄瓜经NaCl腌渍后出现了大面积的塌陷，分层现象明显，组织收缩严重；添加0.10%NaFeEDTA组的腌渍黄瓜组织塌陷和分层现象有所恢复；添加0.15%和0.20%NaFeEDTA组的腌渍黄瓜组织结构出现部分褶皱，断裂不明显，微观结构相对平整；添加0.25%NaFeEDTA组的腌渍黄瓜组织结构的断层现象不明显，但组织结构不再平整。添加0.15%NaFeEDTA组的腌渍黄瓜在扫描电镜下组织结构的完整性和平整度最佳。可能是一定的铁浓度提高了植物细胞的代谢活性，保持细胞膜壁完整性，提高植物细胞的质量和密度。
图3 NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜微观结构的影响
Fig.3 Effect of NaFeEDTA addition on the microstructure of pickled cucumber
2.5 NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜感官评价的影响
由表4可知，添加NaFeEDTA组的腌渍黄瓜感官评分均在70分以上；其中添加0.15%NaFeEDTA组腌渍黄瓜具有完整的形态色泽、良好的风味气味以及质地，总分为95.2分；其次分别为添加0.20%和0.25%NaFeEDTA组；对照组的评分最低。适量添加NaFeEDTA有利于有机酸的形成，从而具有更好的风味和挥发性香气，同时在一定程度上保持了黄瓜的形态、色泽和质地，感官在总体上接受度更高。
表4 NaFeEDTA添加量对腌渍黄瓜感官评价的影响
Table 4 Effect of NaFeEDTA addition on sensory evaluation of pickled cucumber
项目 氯化钠组氯化钠+0.10%NaFeEDTA组感官评分/分氯化钠+0.15%NaFeEDTA组氯化钠+0.20%NaFeEDTA组氯化钠+0.25%NaFeEDTA组形态色泽风味气味质地总分13.8 10.2 14.2 14.6 15.8 68.6 15.5 13.5 15.9 15.8 16.5 77.2 18.3 18.3 19.6 19.4 19.6 95.2 17.9 17.5 17.3 16.3 18.7 87.7 16.9 13.6 16.4 17.2 17.8 81.9
2.6 NaFeEDTA腌渍黄瓜对大鼠体质量和血红蛋白的影响
若机体缺乏铁元素，直接导致血红蛋白合成不足，出现贫血等症状，从而影响生长发育[19-20]。NaFeEDTA腌渍黄瓜对大鼠体质量和血红蛋白指标的影响见图4。
图4 NaFeEDTA腌渍黄瓜对大鼠体质量（a）和血红蛋白（b）的影响
Fig.4 Effect of pickled cucumber added with NaFeEDTA on body mass (a) and hemoglobin (b) in rats
“*”表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；“**”表示与模型组比较差异极显著（P＜0.01）。
由图4（a）可知，模型组大鼠体质量极显著低于正常组（P＜0.01），说明建模成功；与模型组相比，添加NaFeEDTA腌渍黄瓜组大鼠体质量显著或极显著高于模型组（P＜0.05、P＜0.01），说明铁元素被有效吸收；其中添加0.15%NaFe EDTA组大鼠体质量增加最高；由图4（b）可知，模型组大鼠的血红蛋白极显著低于正常组（P＜0.01），添加NaFe EDTA腌渍黄瓜组大鼠的血红蛋白均显著或极显著高于模型组（P＜0.05、P＜0.01），其中添加0.15%NaFeEDTA组大鼠血红蛋白最高。结果表明，添加NaFeEDTA腌渍黄瓜可有效提高大鼠的体质量及血红蛋白。
2.7 NaFeEDTA腌渍黄瓜对大鼠脾脏组织的影响
缺铁会直接影响免疫功能，长期缺铁，阻碍免疫细胞的生成，导致免疫功能缺陷[21]。脾是最大的淋巴免疫器官，具有储血、造血、清除衰老红细胞和进行免疫应答等功能[22-23]。NaFeEDTA腌渍黄瓜对大鼠脾脏组织的影响，结果见图5。
图5 NaFeEDTA腌渍黄瓜对大鼠脾脏组织的影响
Fig.5 Effect of pickled cucumber added with NaFeEDTA on spleen tissue of rats
（a）正常组；（b）模型组；（c）0.10%NaFeEDTA组；（d）0.15%NaFeEDTA组；（e）0.20%NaFeEDTA组；（f）0.25%NaFeEDTA组。
由图5可知，正常组大鼠的脾细胞排列紧密有序，细胞核清晰可见，红白髓分界明显，白髓内结构完整的脾小体较多，红髓内脾索连成一体，脾窦明显。模型组大鼠的脾脏细胞数量明显减少，细胞大小不一，排列稀疏无序，红白髓分界不清，淋巴鞘结构疏松，脾窦高度扩张[24-25]。NaFeEDTA腌渍黄瓜组大鼠的脾细胞数量比模型组显著增加，脾脏结构异常有效缓解。其中添加0.15%NaFeEDTA腌渍黄瓜组大鼠的脾细胞排列整齐，核仁清晰，红细胞渗出现象得到缓解，组织形态逐渐恢复到与正常组相似。
3 结论
本实验探究添加不同浓度的NaFeEDTA对腌渍黄瓜理化性质及感官的影响，通过对腌渍黄瓜还原糖、总酸、pH值以及有机酸的测定，说明NaFeEDTA的添加可有效提高还原糖的利用率，增加腌渍黄瓜总酸和有机酸的含量和种类；缓解腌渍黄瓜塌陷和断层现象；提高腌渍黄瓜的质地、形态和风味等指标。通过大鼠实验证明添加NaFeEDTA腌渍黄瓜可通过口服的方式有效进行补铁，促进机体生长发育，改善贫血症状。其中添加0.15%NaFeEDTA腌渍黄瓜的总酸含量、有机酸含量及种类最高，分别为0.396 g/100 mL、180.641 mg/100 g及9种，组织形态最完整，感官评分最高，为95.2分；补铁效果最佳，大鼠的体质量增加、血红蛋白值均最高，脾细胞排列整齐，核仁清晰，红细胞渗出现象得到缓解，组织形态逐渐恢复到与正常组相似。推测可能与腌菜腌渍过程中有机酸等指标有关，从而促进了铁元素在机体的吸收率，为实现铁强化腌渍蔬菜并增加其吸收率提供一定的理论基础。
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