白酒是一种起源于中国的发酵酒精饮品，通过多种微生物的协同作用在开放的环境中自然发酵制成[1-2]。酒曲是白酒发酵的主要微生物来源，其中含有复杂的微生物群以及多种粗酶，其品质的好坏直接影响白酒的品质、产量和风格[3]。伊力特白酒以“香气悠久、味醇厚、入口甘美、入喉净爽、诸味谐调、酒味全面”的独特风格闻名新疆内外，被誉为“新疆第一酒”，其浓香型大曲中含有丰富的酿酒微生物。
霉菌是酒曲中的主要微生物之一，其可以分泌糖化酶、液化酶，能将原料中的淀粉水解为可发酵性的糖，为其他酿酒微生物的生长提供充足的营养物质[4]。糖化酶和液化酶分别也被叫作β-淀粉酶和α-淀粉酶，β-淀粉酶可作用于α-1,4糖苷键，将淀粉以及液化酶生成的糊精水解成葡萄糖[5]，α-淀粉酶作用于直链淀粉和支链淀粉非末端的α-1,4糖苷键，可以将淀粉水解成糊精和小分子糖，使黏度下降，提高发酵过程中的糖化效率[6]，这两种酶均在酿酒原料的水解过程中发挥重要作用，直接关系到酒曲的质量。一般情况下，具有高糖化酶、液化酶活力的霉菌可以极大地提高原料利用率及出酒率[7]。近年来，许多研究使用糖化酶、液化酶制剂来达到提高原料利用率和出酒率的目的[8-9]，但以此类方法生产白酒发酵体系中酶系过于单一，原料水解速度过快，导致酿造出的白酒风味品质较低[10]。麸曲以麸皮为原料，接入一种或多种纯种微生物，经培养繁殖产酶后制作而成，由于其制作工艺简单，制作原料成本低廉而被广泛应用于白酒工业，同时也是培养微生物的优良载体[11]。因此，分离筛选出产糖化酶、液化酶性能优良的霉菌，通过制作纯菌种麸曲的方式将其应用于白酒酿造，对推动白酒行业的高品质发展具有重要意义。
本研究以伊力特浓香型大曲为筛选原料，采用传统培养分离法分离筛选高产糖化酶和液化酶活力的霉菌，并通过形态学观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定。利用筛选菌株制作麸曲，并以糖化酶及液化酶活力为评价指标，通过单因素试验及响应面试验优化麸曲制作工艺，以期为伊力特大曲中优良霉菌的筛选及麸曲制作提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 酒曲及材料来源
伊力特大曲（浓香型），由新疆伊力特实业股份有限公司提供，用无菌袋包装后于（0±1）℃冰箱中保存；麸皮：新疆昌吉呼图壁县金葵花粮油加工厂，选择新鲜、无虫、无霉变的麸皮。
1.1.2 试剂
葡萄糖、酚酞、无水乙酸钠、酒石酸钾钠、次甲基蓝、可溶性淀粉、磷酸二氢钠：天津市盛奥化学试剂有限公司；氢氧化钠、硫酸铜、无水乙醇、冰乙酸、柠檬酸：天津市鑫铂特化工有限公司；氯化钠：天津市致远化学试剂有限公司；酵母膏、蛋白胨、牛肉膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；TIANamp Bacteria脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）试剂盒：北京天根生化科技有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物：上海派森诺生物科技股份有限公司；脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、TaKaRa LA Taq聚合酶：日本TaKaRa公司；琼脂糖：上海生工生物工程股份有限公司。以上试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯浸出粉12 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂14 g/L。115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
淀粉透明圈培养基[12]：可溶性淀粉10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏5 g/L，琼脂20 g/L。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
复筛培养基[12]：新鲜麸皮15 g，水15 mL。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SPX-250B生化培养箱：常州诺基仪器有限公司；DGG-9053A电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；IMJ-54A高压灭菌锅：施都凯仪器设备（上海）有限公司；SW-CJ-2FD净化工作台：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；S500T-T310生物显微镜：苏州倍特嘉光电科技有限公司；ABI-2720 PCR仪、ABI 3730XL测序仪：美国Applied Biosystems公司；NanoDrop 2000微量分光光度计：美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 方法
1.3.1 霉菌的分离
稀释涂布平板法：称取10 g浓香型大曲于250 mL锥形瓶中，加入90 mL无菌水，30 ℃、150 r/min条件下振荡20 min，静置后取1 mL上清液置于装有9 mL无菌水的试管中，制成10-1的稀释液，以此方法梯度稀释至10-6。分别吸取0.2 mL 10-4、10-5、10-6梯度稀释液均匀涂布于PDA培养基，置于恒温培养箱中30 ℃培养3 d。
平板划线法：根据稀释涂布平板分离得到的单菌落特征（菌落大小，有无菌丝，颜色气味等），挑取具有典型霉菌菌落特征的菌株在PDA平板上划线纯化3～4次，得到单菌落。挑取单菌落接种于PDA培养基上，于恒温培养箱中30 ℃培养3 d，放入4 ℃冰箱保藏，备用。
1.3.2 霉菌的筛选
（1）初筛
将通过平板划线法分离得到的纯种霉菌菌株点种于淀粉透明圈培养基中，于恒温培养箱中30 ℃培养3 d后，向培养皿中加入适量稀碘液进行染色，静置30 min，测量菌落直径（d）和菌落周围透明圈直径（D），测定D/d值，试验重复3次。根据D/d值初步判断菌株产糖化酶和液化酶能力的强弱，D/d值越大，表示菌株产糖化酶和液化酶的能力越强。
（2）复筛
孢子悬浮液的制备：将初筛得到的菌株接种于PDA培养基，于恒温培养箱中30 ℃培养3 d后，向PDA培养基中加入10 mL无菌水，浸泡1 min后刮下霉菌孢子，经脱脂棉过滤后收集滤液，使用血球计数板对滤液中的孢子进行计数，并稀释至孢子数为1×107 CFU/mL。
麸曲制备：取3 mL孢子悬浮液接种于复筛培养基中，在无菌环境下搅拌均匀后，置于恒温培养箱中30 ℃培养3 d，每12 h进行一次无菌搅拌。培养完毕后将霉菌麸曲置于烘箱（40 ℃）中干燥12 h，置于无菌袋中放入4 ℃保藏，备用。
1.3.3 霉菌的鉴定
形态学观察：将目标菌株点种于PDA培养基上，置于恒温培养箱中30 ℃培养3 d后观察菌落特征。在载玻片上滴加一滴乳酸酚棉蓝染液，用无菌接种环从菌落的边缘将少量带有孢子的菌丝挑入载玻片的染液中，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。
分子生物学鉴定：使用TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒提取筛选霉菌的基因组DNA，以其为模板，采用引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS8（5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'）对菌株的18S rDNA进行PCR扩增。PCR扩增体系：基因组DNA 1.0 μL，10×Buffer（Mg2+Plus）5.0 μL，Taq聚合酶（5 U/L）1.0 μL，dNTP（10 mmol/L）1.0μL，正向和反向引物分别1.5μL，双蒸水（ddH2O）39.0 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃终延伸7 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物检测合格后委托上海派森诺生物科技有限公司进行测序。将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank数据库中，采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源序列对比，获取同源性较高的模式菌株的18SrDNA基因序列，利用MEGA7软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。
1.3.4 霉菌麸曲制曲工艺优化单因素试验
接种量的影响：向5个250 mL的锥形瓶中加入15 g麸皮，再分别添加17 mL、16 mL、15 mL、14 mL和13 mL的蒸馏水，灭菌后冷却至室温，分别接种1 mL（3%）、2 mL（6%）、3 mL（9%）、4 mL（12%）和5 mL（15%）的孢子悬浮液，在无菌条件下搅拌均匀后置于恒温培养箱中30 ℃培养72 h，并且每隔12 h进行一次无菌搅拌，制为霉菌纯菌种麸曲，并测定其糖化酶活力、液化酶活力。
培养温度的影响：向5个250 mL锥形瓶中加入15 g麸皮和15 mL蒸馏水，灭菌后冷却至室温，分别接种3 mL孢子悬浮液，在无菌条件下搅拌均匀后分别置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃的恒温培养箱中培养72 h，并且每隔12 h进行一次无菌搅拌，制为霉菌纯菌种麸曲，并测定其糖化酶活力、液化酶活力。
培养时间的影响：向5个250 mL锥形瓶中加入15 g麸皮和15 mL蒸馏水，灭菌后冷却至室温，分别接种3 mL孢子悬浮液，在无菌条件下搅拌均匀后置于恒温培养箱中，30 ℃培养24 h、48 h、72 h、96 h和120 h，并且每隔12 h进行一次无菌搅拌，制为霉菌纯菌种麸曲，并测定其糖化酶活力、液化酶活力。
水分含量的影响：分别向5个250 mL锥形瓶中加入15 g麸皮，然后分别加入9.8 mL（45%）、12.3 mL（50%）、15.3 mL（55%）、19.1 mL（60%）和24.0 mL（65%）的蒸馏水，灭菌后冷却至室温，分别接种2.5 mL、2.7 mL、3.0 mL、3.4 mL、3.9 mL的孢子悬浮液，在无菌条件下搅拌均匀后置于恒温培养箱中30 ℃培养72 h，并且每隔12 h无菌搅拌一次，制为霉菌纯菌种麸曲，并测定其糖化酶活力、液化酶活力。
1.3.5 霉菌麸曲制曲工艺优化Box-Behnken响应面试验
根据单因素试验结果，剔除影响不显著的因素，固定水分含量为55%，最终选择接种量（A）、培养温度（B）和培养时间（C）作为试验因素。由于菌株JW-3麸曲的糖化酶活力较低而液化酶活力较高，并且在单因素试验中糖化酶活力与液化酶活力变化趋势一致，为了使菌株JW-3麸曲在具有高液化酶活力的同时具有更高的糖化酶活力，获得更全面的产酶性能以提高其在应用时的适用度，选择以糖化酶活力（Y）为响应值，采用Design Expert 13软件设计3因素3水平的响应面试验，试验因素与水平见表1。
表1 霉菌麸曲制曲工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for mold Fuqu-making process optimization
水平 A 接种量/% B 培养温度/℃ C 培养时间/h-1 0 1 6 9 1 2 25 30 35 72 96 120
1.3.6 测定方法
糖化酶、液化酶活力的测定：参照赵恒山[13]的方法。
糖化酶活力的定义：1 g干曲所制备的酶液在35 ℃、pH4.6的条件下，1 h分解可溶性淀粉所产生1 mg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位，以U/g表示[14]。
液化酶活力的定义：1 g干曲所制备的酶液在35 ℃、pH4.6的条件下，1 h液化1 g可溶性淀粉称为1个液化酶活力单位，以U/g表示[14]。
1.3.7 数据处理
每组试验做3次平行，结果用“平均值±标准差”表示；使用SPSS Statistics 24软件对数据进行统计分析。采用Duncan多重比较法进行显著性分析。使用Origin 2018软件作图。
2 结果与分析
2.1 霉菌的分离及筛选
通过稀释涂布平板法和平板划线法从伊力特浓香型大曲中共分离得到10株霉菌，采用透明圈法测定10株霉菌的糖化酶能力，结果见表2。由表2可知，共有6株菌株能产生透明圈，分别为JW-2、JW-3、SY-1、SY-2、ML-1和ML-2，说明这6株菌株均具有产糖化酶能力。
表2 分离霉菌的菌落直径与透明圈直径
Table 2 Colony diameter and transparent circle diameter of isolated mold
注：不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）；“-”代表无透明圈产生。
菌株编号 菌落直径（d）/cm 透明圈直径（D）/cm D/d值JW-1 JW-2 JW-3 SY-1 SY-2 SY-3 ML-1 ML-2 ML-3 ML-4 2.15±0.12e 2.70±0.06d 2.05±0.05e 4.53±0.10a 3.70±0.05c 4.25±0.08b 3.25±0.02cd 3.52±0.02c 2.93±0.05d 3.38±0.12cd--3.63±0.08d 3.95±0.13bc 4.95±0.06a 4.00±0.03b-3.85±0.12c 3.75±0.12c 1.34 1.93 1.09 1.08-1.18 1.06——
采用初筛得到的6株霉菌发酵制作纯菌种麸曲，测定其糖化酶及液化酶活力，结果见表3。由表3可知，菌株JW-2和JW-3的糖化酶活力较高，分别为373.3 U/g和384.7 U/g。菌株JW-3的液化酶活力最高，达到1 391.5 U/g，显著高于其余5株菌株（P＜0.05）。菌株JW-3的糖化酶和液化酶活力均显著高于其他菌株（P＜0.05），因此，选定其为目标菌株。
表3 筛选霉菌糖化酶及液化酶活力的测定结果
Table 3 Determination results of saccharifying enzyme and liquefying enzyme activity of screened mold
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
菌株 糖化酶活力/（U·g-1） 液化酶活力/（U·g-1）JW-2 JW-3 SY-1 SY-2 ML-1 ML-2 373.3±5.77b 384.7±4.62a 183.3±5.77f 216.7±5.77e 303.3±5.77c 245.0±5.00d 780.3±58.31b 1 391.5±79.55a 506.0±53.69d 537.0±53.69d 664.0±83.14c 254.3±36.23e
2.2 霉菌JW-3的鉴定
2.2.1 形态学观察
菌株JW-3的菌落形态、细胞及孢子形态见图1。
图1 菌株JW-3的菌落（a）、细胞（b）及孢子（c, d）形态特征
Fig.1 Colony (a), cell (b) and spore (c, d) morphology characteristics of strain JW-3
由图1可知，菌株JW-3的菌丝呈白色、绒毛状且无横隔，随着培养时间的延长菌丝逐渐表现为黄褐色，菌落反面的颜色也由乳白色转为黄褐色，显微镜下观察菌丝无假根，孢子梗不成束，顶生孢子囊，孢子囊为圆形或烧瓶形，孢子为圆形或椭圆形。
2.2.2 分子生物学鉴定
基于18S rDNA基因序列构建菌株JW-3的系统发育树，结果见图2。
图2 基于18S rDNA基因序列菌株JW-3的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain JW-3 based on 18S rDNA gene sequences
由图2可知，菌株JW-3与伞枝横梗霉（Lichtheimia corymbifera）MJ11聚于一支，相似度达100%，亲缘关系最近。结合菌株JW-3的形态学特征，鉴定菌株JW-3为伞枝横梗霉（Lichtheimia corymbifera）。伞枝横梗霉属于丝状真菌，是清香型白酒大曲中的主体微生物之一[15]，同时也是牛栏山二锅头发酵初期的主要真菌之一[16]。目前对伞枝横梗霉产酶性能及制曲条件的研究还鲜有报道，本研究将对伞枝横梗霉JW-3的产酶性能及制曲条件进行研究。
2.3 霉菌麸曲制曲工艺优化
2.3.1 单因素试验
不同培养条件对霉菌麸曲糖化酶和液化酶活力的影响见图3。
图3 接种量（A）、培养温度（B）、培养时间（C）和水分含量（D）对霉菌麸曲糖化酶及液化酶活力的影响
Fig.3 Effect of inoculum (A), culture temperature (B), culture time (C)and moisture (D) on saccharifying enzyme and liquefying enzyme activity of mold Fuqu
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
适宜的接种量可以减少制曲时间，接种量过大，会导致霉菌在生长繁殖过程中消耗营养物质过快，使得培养基在发酵中后期营养成分不足；接种量过小，菌体繁殖能力不足，会导致制曲时间延长[17]。由图3a可知，随着接种量的增加，糖化酶活力和液化酶活力均呈现先上升后下降的趋势，当接种量为9%时，菌株JW-3麸曲的糖化酶活力和液化酶活力均达到最高值，分别为384.34 U/g和1 357.67 U/g。因此，确定最佳接种量为9%。王晓勇等[18]优化糖化菌株M1制曲条件时，孢子悬浮液浓度与本研究相似，测得最佳的接种量与本研究接近，菌株M1麸曲优化后的糖化酶活力和液化酶活力分别为847 U/g和0.79 U/g，与之相比，菌株JW-3麸曲具有更高的液化酶活力。
温度对霉菌的生长代谢有较大的影响，同时也对酶的代谢影响较大，过高的温度会损害霉菌的蛋白质、酶和核酸等成分，温度过低则会抑制霉菌的生长和产酶[19]。由图3b可知，当培养温度由25 ℃提升至30 ℃时，菌株JW-3麸曲的糖化酶活力和液化酶活力呈上升趋势；当培养温度为30 ℃时，菌株JW-3麸曲的糖化酶、液化酶活力达到最大值，分别为379.00 U/g和1 209.33 U/g；当培养温度继续提升至45 ℃的过程中，糖化酶活力和液化酶活力随着培养温度的升高而降低。因此，确定最佳培养温度为30 ℃。霉菌产糖化酶的最适培养温度通常在30～40 ℃[20-22]，菌株JW-3的最适培养温度为30 ℃，适用于中低温曲的制作，同时较低的培养温度在白酒的工业化生产中的能耗更低，可在一定程度上降低生产成本。
在适宜条件下，麸曲的酶活力会随着霉菌的生长代谢而增加，但过长的培养时间不利于麸曲酶活力的保持。随着培养时间的延长，麸皮中的营养物质不断被消耗，霉菌因得不到充足的营养物质和水分而凋亡，致使麸曲的性能下降[23]。由图3c可知，培养时间在24～120 h范围内，随着培养时间的延长，菌株JW-3麸曲的糖化酶活力和液化酶活力均呈现先增加后降低的趋势；当培养时间为96 h时，菌株JW-3麸曲的糖化酶活力和液化酶活力均达到最大值，分别为404.33 U/g和1 574.67 U/g。因此，确定最佳培养时间为96 h。马鹏[24]将从托木尔峰大曲中分离出的功能菌分别制为产糖化酶混合功能菌剂和产液化酶混合功能菌剂，在培养96 h后的糖化力和液化力分别为308 U/g和4.12 U/g，在相同的培养时间下，菌株JW-3具有更高的糖化力和液化力，高糖化力、液化力可以更充分的分解原料，为酿酒微生物提供营养物质，提高原料的利用率，同时促进部分香气成分的产生[25]。
合理的水分含量可以使麸皮具有较好的疏松性，有利于霉菌菌丝的生长，当麸皮中水分含量不足时，培养后期麸皮表面会逐渐干燥失水，导致霉菌缺少生长必需的水分；水分含量过高，会导致麸皮黏连，透气性差，麸曲制作过程中无法充分散热[26]。由图3d可知，水分含量在50%～55%范围内时，其对菌株JW-3麸曲糖化酶、液化酶活力的影响均不显著（P＞0.05）；当水分含量为55%时，菌株JW-3麸曲有最高的糖化酶活力和液化酶活力，分别为380.00 U/g和1 248.00 U/g。因此，确定最佳水分含量为55%。
2.3.2 响应面试验
根据单因素试验结果，剔除影响不显著的因素，固定水分含量为55%，选择接种量（A）、培养温度（B）和培养时间（C）3个因素为自变量，以糖化酶活力（Y）为响应值，使用Design-Expert 13.0软件设计3因素3水平的Box-Behnken响应面试验，试验设计及结果见表4，方差分析见表5。
表4 菌株JW-3麸曲制备工艺优化响应面试验设计及结果
Table 4 Design and results of response surface experiments for Fuqu-making process optimization by strain JW-3
序号 A 接种量/% B 培养温度/℃ C 培养时间/h 糖化酶活力/（U·g-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 6 12 6 12 6 12 6 12 9 9 25 25 35 35 30 30 30 30 25 35 96 96 96 96 72 72 120 120 72 72 235.00±2.65 283.33±0.58 227.33±2.08 280.33±0.58 286.67±1.53 336.00±1.73 248.00±1.00 298.67±1.15 293.33±1.53 290.33±0.58
续表
序号 A 接种量/% B 培养温度/℃ C 培养时间/h 糖化酶活力/（U·g-1）11 12 13 14 15 16 17 9 9 9 9 9 9 9 25 35 30 30 30 30 30 120 120 96 96 96 96 96 255.00±0.00 253.00±1.73 412.33±2.08 411.00±2.00 405.00±0.00 402.00±1.00 410.00±2.00
表5 回归模型的方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
项目 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B******AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和74 069.56 5 066.72 30.69 2 875.09 5.45 0.448 9 0.250 0 18 382.34 30 775.86 10 382.29 80.98 4.25 76.73 74 150.54 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 8 229.95 5 066.72 30.69 2 875.09 5.45 0.448 9 0.250 0 18 382.34 30 775.86 10 382.29 11.57 1.42 19.18 711.39 437.97 2.65 248.52 0.471 3 0.038 8 0.021 6 1 588.96 2 660.26 897.44＜0.000 1＜0.000 1 0.147 4＜0.000 1 0.514 5 0.849 4 0.887 3＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1******0.073 9 0.970 8不显著
通过Design-Expert 13.0软件对表4结果进行多元二次回归拟合分析，得到菌株JW-3麸曲糖化酶活力与接种量、培养温度和培养时间的回归方程：
Y=408.07+25.17A-1.96B-18.96C+1.17AB+0.335 0AC+0.250 0BC-66.07A2-85.49B2-49.66C2
由表5可知，二次多项式回归模型P＜0.000 1，极显著，失拟项P=0.970 8＞0.05，不显著，说明模型可靠。决定系数R2=0.998 9＞0.85，说明拟合程度较好，试验误差小，该回归方程可以代替试验真实点对霉菌麸曲的制曲试验结果进行分析和预测。根据F值可知，3个因素对霉菌麸曲糖化酶活力的影响从大到小依次为A（接种量）＞C（培养时间）＞B（培养温度）。由P值可知，一次项A、C及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01）。其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。
各因素间交互作用对菌株JW-3麸曲糖化酶活力影响的响应面及等高线见图4。两变量之间的响应面及等高线可以用来判断二者之间的交互作用是否显著，响应面越陡峭、等高线趋于椭圆形表明两因素之间交互作用显著；响应面越平缓、等高线趋于圆形表明两因素之间交互作用不显著[27]。由图4可知，各因素间交互作用对糖化酶活力影响的响应面较平缓、等高线图均趋于圆形，说明3个因素之间的交互作用均不显著（P＞0.05），这与方差分析结果一致。
图4 各因素间交互作用对糖化酶活力影响的响应面及等高线图
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the activity of saccharifying enzyme
采用Design-Expert 13.0软件对多元二次回归方程进行求解，得到菌株JW-3麸曲的最佳制曲条件为：接种量9.57%，培养温度29.95 ℃，培养时间91.44 h。此条件下菌株JW-3麸曲糖化酶活力的预测值为412.27 U/g。考虑实际操作的可行性，将制曲条件调整为接种量10%，培养温度30 ℃，培养时间91 h，水分含量55%。在此条件下进行3次平行验证试验，得到菌株JW-3麸曲的糖化酶活力实际值为409.67 U/g，与预测值的相对误差为0.634%，说明实际值与预测值符合程度较好，本试验用响应面分析得到的菌株JW-3麸曲最佳制曲条件较为可靠，并且在该培养条件下，菌株JW-3麸曲的液化酶活力为1 597.00 U/g，具有较高的液化力。
目前分离筛选产糖化酶性能优良霉菌的研究较多，且所筛选出霉菌的糖化酶活力能达到1 000 U/g以上[12，28-30]，但分离出液化酶活力能达到1 000 U/g以上的霉菌较少，菌株JW-3麸曲液化酶活力可达1 597.00 U/g，产液化酶性能优良，可作为其他酒曲的强化菌剂，解决白酒发酵体系液化力不足的问题，同时其糖化酶活力也达409.67 U/g，也具有良好的产糖化酶性能，可制作纯菌种麸曲作为糖化剂应用于小曲酒或麸曲酒的酿造。菌株JW-3在拥有优良产液化酶性能的同时也具有良好的产糖化酶性能，在白酒生产中具有一定的应用价值。
3 结论
以伊力特浓香型大曲为原料，筛选出一株具有高糖化酶、液化酶活力的霉菌，编号为JW-3，经形态观察及分子生物学技术鉴定其为伞枝横梗霉（Lichtheimia corymbifera）。采用伞枝横梗霉JW-3制作麸曲，以糖化酶活力为响应值，采用单因素试验及响应面试验优化得到菌株JW-3麸曲的最佳制备工艺条件为：接种量10%，培养温度30 ℃，培养时间91 h，水分含量55%。在此优化条件下，麸曲糖化酶活力为409.67 U/g，液化酶活力为1 597.00 U/g，相较于优化前分别提高了6.49%和14.77%，具有较高的糖化酶、液化酶活力，在白酒的生产中具有一定的应用潜力。本实验对伊力特大曲中优良霉菌的筛选利用具有积极意义，并可为该霉菌的麸曲制作工艺提供理论依据。
[1]肖冬光.白酒生产技术[M].北京：化学工业出版社，2005：4.
[2]程伟，吴丽华，徐亚磊，等.浓香型白酒酿造微生物研究进展[J].中国酿造，2014，33（3）：1-4.
[3]陈孝，温承坤，巩园园，等.酒曲的研究进展[J].中国酿造，2019，38（10）：7-11.
[4]JIN G, ZHU Y, XU Y.Mystery behind Chinese liquor fermentation[J].Trends Food Sci Tech,2017,63:18-23.
[5]龙茜萍，王晓丹，谭静，等.一株高产糖化酶菌株的筛选与鉴定[J].酿酒科技，2013（8）：7-9.
[6]周恒刚，李运良.谈谈液化淀粉酶[J].酿酒科技，1996（6）：13-15.
[7]朱莹.酒药核心微生物解析及可控固态发酵的研究[D].无锡：江南大学，2023.
[8]白利涛，张丽萍.糖化酶活力测定方法研究[J].酿酒科技，2012（2）：100-102.
[9]THHEWS S L,BYRNE H,HENNIGAN G P.Preparation of a low carbohydrate beer by mashing at high temperature with glucoamylase[J]. J I Brewing,2001,107(3):185-194.
[10]王旭亮，王异静，王德良，等.白酒发酵高糖化性能霉菌的筛选及鉴定[J].酿酒科技，2012（9）：22-28.
[11]黄永光，徐岩.酱香白酒酿造环境曲霉的分离及Aspergillus hennebergii酶分泌胁迫条件[J].食品与生物技术学报，2015，34（8）：814-821.
[12]赵群丽.酱香大曲中酿酒微生物的筛选及发酵工艺研究[D].贵阳：贵州大学，2016.
[13]赵恒山.产糖化酶、液化酶菌株的筛选及麸曲的制备[D].晋中：山西农业大学，2017.
[14]宁正祥.食品成分分析手册[M].北京：中国轻工业出版社，2001：618-619.
[15]胡佳音，周森，赵卫鹏，等.清、浓、酱三种大曲真菌多样性初步分析[J].酿酒科技，2016（8）：87-90.
[16]周森，韩培杰，胡佳音，等.牛栏山二锅头酿造过程中的真菌多样性分析[J].食品工业科技，2018，39（1）：127-130，136.
[17]刘茗铭，周阳子，袁乐梅，等.酒曲中高产糖化酶霉菌的筛选及其固态发酵产酶条件优化[J].食品与发酵工业，2018，44（10）：118-123.
[18]王晓勇，荆旭，赵恒山，等.应用响应面法对产糖化酶菌株M1制曲工艺的优化研究[J].酿酒，2019，46（5）：79-83.
[19]刘茗铭.高温大曲中产香功能微生物的筛选及其应用研究[D].自贡：四川轻化工大学，2019.
[20]贺奕森.浓香型白酒大曲中霉菌的分离鉴定及应用[D].邯郸：河北工程大学，2023.
[21]倪海斌，彭奎，王超凯，等.藏曲高产糖化酶霉菌的筛选及其产酶条件优化[J].食品与发酵科技，2022，58（2）：31-37.
[22]韩英，赵恒山，田宇敏，等.基于风味和产酶性能的霉菌M2的筛选及制曲工艺优化[J].酿酒科技，2019（9）：27-34.
[23]孙思佳，翟磊，白秀彬，等.一株高产淀粉酶扣囊复膜孢酵母的产酶条件优化及酶学性质研究[J].食品与发酵工业，2019，45（21）：31-37.
[24]马鹏.高酯化力、糖化力和液化力霉菌的筛选及强化大曲的研究[D].阿拉尔：塔里木大学，2022.
[25]翁鹏，张建敏，彭志云，等.大曲酶系的研究现状及展望[J].酿酒科技，2023（6）：112-117.
[26]庾昌文，薛栋升，郭威，等.酒醅中高产淀粉酶酵母的分离鉴定及产酶条件研究[J].酿酒，2015，42（5）：71-75.
[27]金子亿.酵母菌-乳酸菌联合发酵大豆酒的工艺优化及品质分析[D].淮安：淮阴工学院，2022.
[28]柳旭，张倩，周森，等.清香型大曲中高糖化力霉菌的筛选、鉴定及其挥发性风味物质分析[J].中国酿造，2023，42（6）：72-78.
[29]唐洁，杨强，刘源才，等.高糖化力米根霉G1培养条件优化[J].中国酿造，2022，41（7）：173-178.
[30]李冬琴，李建芳，周枫，等.芝麻香型白酒专用曲中产糖化酶霉菌的筛选[J].酿酒，2021，48（3）：90-93.