我国饮酒与饮茶文化历史悠久,在传统的基础上,人们创造性地开始用茶叶酿酒,并发明了一种新的酒精饮料——茶酒[1-3]。茶酒结合了茶的香味和发酵酒的醇厚,具有独特感官特征[4-6]。此外,茶酒对人体健康有许多潜在的好处,包括改善免疫力、神经保护作用、抗氧化作用和抗菌效果[7-9]。因此,茶酒近年来受到了研究人员和消费者的广泛关注[10]。
茶酒在酿造过程中加入了茶叶,因此,茶多酚成为了这种酒精饮料中最重要的生理活性物质之一[11]。由于茶多酚具有较高的抗氧化活性,其不仅在消除自由基方面发挥着非常积极的作用,而且在预防某些疾病方面发挥着有益的健康作用,但过量的茶多酚会抑制酿酒微生物的生长代谢并给茶酒带来不悦的苦涩味[12-14]。本课题组通过研究发现,将茶叶经过食用酒精提取制成的速溶茶粉添加至酿酒原料,制得的茶酒苦涩味明显减弱而感官特征不会发生显著改变[15]。此外,在茶酒发酵过程中,茶不仅作为氮源,还为茶酒提供风味和功能成分[16-17]。根据不同的发酵程度,茶叶可分为绿茶(非发酵型)、白茶(轻微发酵型)、黄茶(微发酵型)、乌龙茶(半发酵型)、红茶(全发酵型)和黑茶(微生物发酵型),不同类型的茶叶具有不同的风味特征[18-19]。因此,制作茶酒时需要选用适合与酿酒原料风味搭配的茶叶类型。四川边茶属于黑茶的一类,茶鲜叶经杀青、蒸揉、渥堆、干燥等工序制成,在多种黑茶品种中茶多酚的含量相对较低[20-22]。
四川地区不仅生产四川边茶而且盛产柑橘,但四川大部分地区属于盆地和丘陵地貌,柑橘经常遇到采摘和运输不便的困难[23]。因此,拟采用四川边茶制成的速溶茶粉与柑橘汁为原料制备柑橘茶酒,通过单因素试验及响应面试验对柑橘茶酒的酿造工艺进行优化,并对其抗氧化活性进行测定,以期提高柑橘茶酒的感官品质,拓宽茶酒的市场应用。
四川边茶(茶叶原料为四川小叶种群体品种,采摘标准为一芽二叶):四川省雅安茶厂有限公司;新鲜成熟的柑橘、白砂糖:市售;酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31482:宜宾职业技术学院菌种保藏中心;果胶酶(酶活105 U/mL):上海杰兔工贸有限公司;偏重亚硫酸钾(食品级)、维生素C(纯度≥99.0%):桂林宝钻食品有限公司;无水乙醇(食品级):山东鲁赢化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals,DPPH·)、羟自由基(hydroxyl radicals,·OH)清除能力试剂盒:上海通蔚实业有限公司;其余试剂均为国产分析纯。
BS210S型电子分析天平:北京赛多利斯天平有限公司;WJE2802D型榨汁机:美的集团股份有限公司;AZL-2500C型粉碎机:永康市红太阳机电有限公司;RE-2000B型旋转蒸发仪:郑州市亚荣仪器有限公司;SD-2L型喷雾干燥机:郑州科达机械仪器设备有限公司;DHP-9162型电热恒温培养箱:上海一恒科学仪器有限公司;W-CJ-2FD型超净工作台:苏州净化设备有限公司;723型可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;SPHs-3c型精密pH计:上海理达仪器厂;LXJ-IIB低速大容量多管离心机:郑州长城工贸有限公司。
1.3.1 柑橘茶酒的酿造工艺流程及操作要点
新鲜柑橘→挑选清洗→去皮去核→打浆酶解→过滤灭酶→调整成分→灭菌→接种酵母→静置发酵→过滤→灭菌→成品茶酒
操作要点:去除四川边茶中的杂质后粉碎过筛(40目),加入茶粉15倍质量的体积分数60%的乙醇溶液,浸泡48 h后过滤,将滤液减压浓缩至原体积的1/3后160 ℃喷雾干燥,得到四川边茶的速溶茶粉(以下简称为速溶茶粉);挑选新鲜成熟的柑橘,去皮、去核后加入同等质量的纯净水破碎,向果浆汁中添加果胶酶(20 U/g)常温处理3 h后过滤;按照试验设计在果汁中添加速溶茶粉及白砂糖调节初始糖度,加入偏重亚硫酸钾调节总酸含量为0.90%,并添加0.08%维生素C,巴氏灭菌(65 ℃、30 min);待冷却至常温后接入一定比例的经扩大培养后的酿酒酵母悬液(1.3×109 CFU/mL),在试验设定的条件下静置发酵;待无气泡产生完成发酵,经四层纱布过滤与巴氏灭菌(65 ℃、30 min)后得到柑橘茶酒成品。
1.3.2 柑橘茶酒酿造工艺优化单因素试验
经前期研究[15]与参考金琦芳等[24-25]的试验发现,速溶茶粉添加量、初始糖度、酿酒酵母接种量、发酵温度对试验结果有一定影响,因此,分别考察速溶茶粉添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、初始糖度(15.0%、17.5%、20.0%、22.5%、25.0%)、酿酒酵母接种量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)及发酵温度(18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃)对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响,每组试验重复3次。
1.3.3 柑橘茶酒酿造工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上,以柑橘茶酒感官评分(Y1)及酒精度(Y2)为考察指标,以速溶茶粉添加量(A)、初始糖度(B)、酿酒酵母接种量(C)和发酵温度(D)为试验因素设计4因素3水平响应面试验对柑橘茶酒酿造工艺进行优化,响应面试验因素与水平见表1。
表1 柑橘茶酒酿造工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for citrus and tea wine brewing process optimization
水平 A 速溶茶粉添加量/%D 发酵温度/℃-1 B 初始糖度/%C 酿酒酵母接种量/%0 1 1.0 1.5 2.0 20.0 22.5 25.0 0.03 0.04 0.05 20 22 24
1.3.4 测定方法
感官评价:参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的感官评价方法[26],邀请11名(6男5女)年龄在28~38岁之间,具有高级品酒师职业资格证书的专业人士组成评价小组,从形态色泽、香气、滋味、典型性四个方面对进行柑橘茶酒感官评价,取11人的平均分,满分100分。柑橘茶酒的感官评分标准见表2。
表2 柑橘茶酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of citrus and tea wine
指标 评定标准及得分优良中差形态色泽(20分)香气(25分)滋味(35分)典型性(20分)色泽呈浅褐色有光泽,澄清透明,悦目协调(16~20分)茶香与酒香浓郁协调,无异味(19~25分)酒体丰满,醇厚,爽口,无异杂味(28~35分)风格优雅独特(16~20分)色泽呈褐色,较为澄清,无悬浮物,光泽度一般(11~15分)茶香与酒香浓郁,较为协调,无异味(13~18分)酒质较为柔顺,爽口,无异杂味(19~27分)风格良好(10~15分)色泽暗黄,较浑浊,光泽度较差(6~10分)茶香与酒香不足,稍有异味(7~12分)酒质较为柔顺,欠爽口,有异味(10~18分)风格普通(6~10分)色泽浑浊,无光泽,有明显悬浮物(0~5分)茶香与酒香不足且香气不协调(0~6分)酒质寡淡,不爽口,异杂味明显(0~9分)风格无典型性(0~5分)
酒精度及干浸出物含量的测定:均采用密度瓶法[26-27];总糖含量与总酸含量的测定:分别采用直接滴定法与电位滴定法[26,28]。
抗氧化活性分析:分别量取15mL、30mL、60 mL、90mL、120 mL柑橘茶酒于试管中,以蒸馏水定容至120 mL,按照DPPH·与·OH试剂盒说明书测定及分析柑橘茶酒对2种自由基的清除能力,以阳性对照(维生素C)溶液为对照,考察其抗氧化能力。
1.3.5 数据统计分析
采用SPSS Statistics 20.0进行数据统计分析,使用Origin Pro 12.1和GraphPad Prism 8.3.0分别绘制单因素试验及抗氧化活性试验的结果图,利用Design-Expert 12.0进行响应面试验设计结果分析。
2.1.1 速溶茶粉添加量对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响
由图1可知,当速溶茶粉添加量为0.5%~1.5%时,柑橘茶酒的感官评分显著升高(P<0.05),速溶茶粉添加量为1.5%时感官评分最高为(90.4±1.4)分;速溶茶粉添加量继续升高时,柑橘茶酒的感官评分显著降低(P<0.05)。当速溶茶粉添加量为0.5%~1.5%时,柑橘茶酒的酒精度无显著差异(P>0.05),速溶茶粉添加量继续升高时,柑橘茶酒的酒精度显著降低(P<0.05)。速溶茶粉的添加能赋予柑橘茶酒独特的香气与滋味,进而有助于形成茶酒优雅的风格特征,但速溶茶粉添加量过大时(超过1.5%),较高含量的茶多酚会抑制酿酒酵母的生长代谢[29],进而影响柑橘茶酒的酒精度及感官特征。故选择速溶茶粉最适添加量为1.5%。
图1 速溶茶粉添加量对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响
Fig.1 Effect of instant tea powder addition on the sensory score and alcohol content of citrus and tea wine
不同小写字母表示感官评分之间差异显著(P<0.05);不同大写字母表示酒精度之间差异显著(P<0.05)。下同。
2.1.2 初始糖度对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响
由图2可知,当初始糖度为15.0%~22.5%时,柑橘茶酒的感官评分显著升高(P<0.05),初始糖度为22.5%时感官评分最高为(91.9±1.0)分;初始糖度继续升高时,柑橘茶酒的感官评分显著降低(P<0.05)。随着初始糖度的升高,柑橘茶酒的酒精度呈持续显著升高的趋势(P<0.05)。糖分是酿酒酵母发酵柑橘茶酒主要动力来源,糖分不足会影响酿酒酵母的生长代谢;酿酒酵母在糖分充足的情况下,会快速生长繁殖而过快消耗营养物质,进而影响香味物质的形成[30]。因而,控制初始糖度能有效保证柑橘茶酒的感官品质。故选择最适初始糖度为22.5%。
图2 初始糖度对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响
Fig.2 Effect of initial sugar content on the sensory score and alcohol content of citrus and tea wine
2.1.3 酿酒酵母接种量对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响
由图3可知,当酿酒酵母接种量为0.01%~0.04%时,柑橘茶酒的感官评分和酒精度均呈现出显著升高的趋势(P<0.05);酿酒酵母接种量为0.04%时,柑橘茶酒的感官评分和酒精度均较高,分别为(93.6±0.8)分和(9.9±0.2)%vol;酿酒酵母接种量继续升高时,柑橘茶酒的感官评分和酒精度均无显著性差异(P>0.05)。当酿酒酵母接种量从0.01%逐渐增加到0.04%时,由于酿酒酵母数量的增加,能较快地进行发酵,代谢产生乙醇及其他香味物质。当酿酒酵母从0.04%继续增加时,因初始糖度没有变化,可供酿酒酵母生长代谢的底物是有限的,故不能进一步增加柑橘茶酒的酒精度。因此,选择最适酿酒酵母接种量为0.04%。
图3 酿酒酵母接种量对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响
Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on the sensory score and alcohol content of citrus and tea wine
2.1.4 发酵温度对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响
由图4可知,当发酵温度为18~26 ℃时,柑橘茶酒的感官评分和酒精度均呈先升高后降低的趋势;发酵温度为22 ℃时,柑橘茶酒感官评分和酒精度均达到最高,分别为(93.6±0.8)分、(9.9±0.2)%vol。当发酵温度为18 ℃时酒质及香气较寡淡;当发酵温度为18~22 ℃时,柑橘茶酒酒体不够丰满;当发酵温度高于22 ℃时,柑橘茶酒开始出现苦涩味。因此,选择最适发酵温度为22 ℃。
图4 发酵温度对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on the sensory score and alcohol content of citrus and tea wine
通过Box-Behnken中心组合设计进行响应面优化试验对柑橘茶酒酿造工艺进行优化,响应面试验设计及结果见表3,方差分析见表4。
表3 柑橘茶酒酿造工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for citrus and tea wine brewing process optimization
试验号A 速溶茶粉添加量/%B 初始糖度/%C 酿酒酵母接种量/%D 发酵温度/℃Y1感官评分/分Y2酒精度/%vol 1234567891 0 9.2 9.1 9.7 10.5 10.4 9.2 9.3 9.5 9.6 9.3 10.2 9.2 10.4 10.1 9.5 9.6 9.7 9.9 9.5 10.4 10.2 9.2 10.1 9.0 9.2 10.2 9.3 9.1 9.2 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 2.0 1.0 2.0 1.5 1.5 1.5 1.0 1.0 2.0 1.5 2.0 1.5 1.5 2.0 1.5 1.0 1.5 1.5 2.0 1.5 1.5 1.0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.0 25.0 25.0 22.5 22.5 22.5 25.0 22.5 22.5 22.5 20.0 20.0 22.5 22.5 22.5 25.0 22.5 22.5 20.0 22.5 22.5 22.5 20.0 25.0 20.0 25.0 22.5 22.5 20.0 22.5 0.04 0.04 0.03 0.04 0.04 0.03 0.05 0.04 0.04 0.03 0.04 0.03 0.04 0.04 0.04 0.04 0.05 0.04 0.05 0.04 0.03 0.04 0.04 0.04 0.05 0.04 0.05 0.05 0.03 22 22 22 22 22 22 22 24 24 22 22 24 22 20 24 20 24 20 22 22 20 22 20 24 22 22 20 22 22 84.9 84.3 88.3 92.1 92.6 85.1 85.6 87.0 87.3 85.8 91.9 85.1 93.1 90.9 87.1 87.4 88.1 89.8 86.7 93.5 91.3 84.6 91.2 83.8 84.8 94.1 85.4 84.4 84.8
表4 响应面试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface experiment results
方差来源模型ABCDA B AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2平方和Y1自由度均方F 值P 值Y2 Y2 Y2 Y2 Y2 Y1 Y1 Y1 Y1 272.37 22.14 0.70 2.43 25.81 11.22 1.44 2.56 0.30 0.90 19.80 57.51 90.12 104.56 17.45 5.81 0.48 0.01 0.04 0.61 0.20 0.02 0.04 0.01 0.02 0.49 1.09 2.04 2.13 0.32 14 14 11111111111111 11111111111111 19.46 22.14 0.70 2.43 25.81 11.22 1.44 2.56 0.30 0.90 19.80 57.51 90.12 104.56 17.45 0.41 0.48 0.01 0.04 0.61 0.20 0.02 0.04 0.01 0.02 0.49 1.09 2.04 2.13 0.32 8.62 9.81 0.31 1.08 11.44 4.97 0.64 1.13 0.13 0.40 8.77 25.48 39.93 46.33 7.73 8.70 10.07 0.28 0.86 12.75 4.25 0.47 0.84 0.21 0.47 10.28 22.97 42.81 44.74 6.79 0.000 1 0.007 3 0.586 1 0.317 0 0.004 5 0.042 6 0.437 8 0.304 9 0.719 8 0.537 3 0.010 3 0.000 2<0.000 1<0.000 1 0.014 7 0.000 1 0.006 8 0.605 1 0.370 3 0.003 1 0.058 3 0.503 2 0.375 1 0.653 9 0.503 2 0.006 3 0.000 3<0.000 1<0.000 1 0.020 8显著性Y1 Y2*****************************
续表
注:“*”表示对结果影响显著(P<0.05);“**”表示对结果影响极显著(P<0.01)。
方差来源残差失拟项纯误差总离差平方和Y1 Y2 Y2 Y2 Y2 Y2自由度Y1均方Y1 F 值Y1 P 值Y1 31.60 29.19 2.41 303.97 0.67 0.62 0.05 6.47 14 10 4 28 14 10 4 28 2.26 2.92 0.60 0.05 0.06 0.01 4.85 0.070 9 5.16 0.063 9显著性Y1 Y2
分别以感官评分(Y1)与酒精度(Y2)为响应值,对表3数据进行回归拟合,得到相应的回归方程如下:
Y1=83.08+1.36A-0.24B-0.45C-1.47D-1.68AB-0.60AC-0.80AD+0.27BC+0.47BD+2.22CD-2.98A2-3.73B2-4.02C2-1.64D2
Y2=10.34+0.20A-0.03B-0.06C-0.23D-0.23AB-0.08AC-0.10AD+0.05BC+0.08BD+0.35CD-0.39A2-0.54B2-0.55C2-0.20D2
由表4可知,4个因素对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响次序均为D>A>C>B,即发酵温度对柑橘茶酒感官评分及酒精度的影响最为显著,其次是速溶茶粉添加量,再次是酿酒酵母接种量,最后是初始糖度。一次项A、D,二次项A2、B2、C2对柑橘茶酒感官评分的影响极显著(P<0.01);交互项AB、CD,二次项D2对柑橘茶酒感官评分的影响显著(P<0.05)。一次项D,交互项CD,二次项A2、B2、C2对柑橘茶酒酒精度的影响极显著(P<0.01);一次项A与二次项D2对柑橘茶酒酒精度的影响显著(P<0.05)。
经比较因素A与因素B,因素C与因素D所形成的感官评分响应面曲面坡度最为陡峭,因素C与因素D所形成的感官评分及酒精度响应面曲面坡度最为陡峭(图5),验证了交互项AB、CD对柑橘茶酒感官评分的影响达到显著水平(P<0.05),交互项CD对柑橘茶酒酒精度的影响达到极显著水平(P<0.01)。这与响应面试验方差分析结果一致。
图5 各因素交互作用对柑橘茶酒感官评分及酒精度影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the sensory score and alcohol content of citrus and tea wine
以柑橘茶酒感官评分为响应值(Y1)的回归方程拟合出柑橘茶酒的最优酿造工艺条件为速溶茶粉添加量1.71%、初始糖度22.03%、酿酒酵母接种量0.04%和发酵温度20.42 ℃,在此条件下可获得柑橘茶酒感官评分的理论最高值94.03分;以柑橘茶酒酒精度为响应值(Y2)的回归方程拟合出柑橘茶酒的最优酿造工艺条件为速溶茶粉添加量1.72%、初始糖度22.01%、酿酒酵母接种量0.04%和发酵温度20.15 ℃,在此条件下可获得柑橘茶酒酒精度的理论最高值10.54%vol。为了便于实际操作,将酿造工艺条件修正为速溶茶粉添加量1.7%、初始糖度22%、酿酒酵母接种量0.04%和发酵温度20 ℃,在此工艺条件下进行3组平行验证试验,得到柑橘茶酒的感官评分与酒精度实际值分别为(94.2±1.1)分与(10.6±0.1)%vol。验证试验结果与理论值最高值偏差不大,表明该验证试验合理可靠,可以作为柑橘茶酒的最优酿造工艺。
在最优工艺条件下酿造的柑橘茶酒总糖为(10.43±0.42)g/L,总酸为(0.81±0.02)g/L,干浸出物为(35.92±1.33)g/L,均符合QB/T 5476—2020《果酒通用技术要求》。
酿造工艺优化后制备的柑橘茶酒与阳性对照(VC)对DPPH·与·OH的清除率见图6。由图6可知,柑橘茶酒与阳性对照对DPPH·与·OH的清除能力均随样液质量浓度的增加而逐渐增强,柑橘茶酒对DPPH·与·OH的清除率最高分别为(90.56±0.95)%与(91.18±1.50)%。经过拟合计算得到优化后的柑橘茶酒对上述2种自由基清除率的半最大效应浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC50)值分别为40.82 mg/mL与18.73 mg/mL(以乙醇计),而阳性对照对DPPH·与·OH清除率的EC50值分别为0.03 mg/mL与0.12 mg/mL。综上,柑橘茶酒具有一定的抗氧化活性,其抗氧化活性随着柑橘茶酒添加量的增加而逐渐增强。
图6 柑橘茶酒对DPPH(A)和OH(B)自由基的清除率
Fig.6 Scavenging rates of citrus and tea wine on DPPH (A) and OH (B) free radical
以柑橘果汁为原料,添加1.7%速溶茶粉,并添加白砂糖调节初始糖度为22%,巴氏灭菌冷却后接入0.04%酿酒酵母菌悬液,20 ℃静置发酵待无气泡产生后可以获得色泽浅褐透明、酒香与茶香浓郁、滋味醇和的柑橘茶酒,感官评分为(94.2±1.1)分、酒精度为(10.6±0.1)%vol、总糖为(10.43±0.42)g/L、总酸为(0.81±0.02)g/L及干浸出物为(35.92±1.33)g/L,均符合QB/T 5476—2020《果酒通用技术》要求;对DPPH·与·OH清除率的EC50值分别为40.82 mg/mL与18.73 mg/mL。因此,采用四川边茶速溶茶粉与柑橘果汁共同酿造技术,可获得感官品质优良兼具一定抗氧化活性的柑橘茶酒。
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Optimization of brewing process and antioxidant activity of citrus and tea wine