酿酒酵母（Saccharomyces cerevisia）与非酿酒酵母对于葡萄酒酒精发酵起着至关重要的作用[1]。李旋等[2]将非酿酒酿酒酵母进行酒精混合发酵，发现乙酸酯类物质含量较单一酿酒酵母发酵显著增加。秦迪[3]分析在发酵前阶段采用冷浸渍工艺有助于增强红葡萄酒酚类物质的含量与酒的水果香气并改善口感。目前，冷浸渍工艺主要应用于分析葡萄酒中的挥发性香气物质[4]。颜色是评价红葡萄酒品质的重要指标之一[5]。红葡萄酒中的色素性质不稳定，导致葡萄酒在发酵过程中常出现色泽质量下降的情况[6]。新疆产区具备得天独厚的自然条件，但酒存在糖高酸低，色素物质不稳定的问题[7]。吴璐璐等[8]发现干红葡萄酒的总花色苷含量受产区和品种的影响显著。干红葡萄酒中的多酚主要包括两大类：非花色苷酚和花色苷酚类物质，如酚酸、芪、黄酮醇、黄烷醇等，对葡萄酒的口感、澄清、稳定性起关键性作用[9]。酚类化合物可借助自身结构中所含的π电子系统，与缺乏电子的花色苷烊盐离子结合形成“酚-花色苷”复合物，从而起到保护花色苷结构的作用[10]。本研究采用新疆赤霞珠葡萄为原料，通过添加非酿酒酵母（CT10）及发酵前冷浸渍（8 ℃、5 d），采用紫外分光-光度法探究干红葡萄酒在酒精发酵及陈酿时期颜色参数及酚类物质的变化，为改善新疆地区干红葡萄酒的品质提供理论研究参考与依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤霞珠（糖度24°Bx）：2023年采摘于新疆巴州和硕芳香酒庄葡萄园；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisia）CECA、非酿酒酵母耐热克鲁维酵母（Kluyveromyces termotolerans）CT10：上海鼎唐国际贸易有限公司。
氢氧化钠、无水葡萄糖、无水乙醇、硫酸铜、酒石酸钾钠、酚酞、单宁酸、没食子酸：天津市致远化学试剂有限公司；福林-肖卡、福林-丹尼斯：上海康朗生物科技有限公司；盐酸、乙醛、亚硫酸氢钠、磷酸、柠檬酸、冰乙酸、无水碳酸钠：天津市北联精细化学品开发有限公司；偏重亚硫酸钾：山东长城化工公司；芦丁标准品（纯度＞98%）：北京索莱宝科技有限公司；锦葵色素-3-葡萄糖苷：上海源叶生物科技有限公司；果胶酶（100 000 U/g）：法国Laffort公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DZK/W-D2型电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；BCD-160型低温冰箱：青岛海尔有限公司；P4PC型紫外可见分光光度计：上海美谱达有限公司；雷磁PHS-3C型pH计：上海精密科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 实验分组
以添加0.25 g/L酿酒酵母CECA的酒样为对照组（CK）；以添加0.25 g/L酿酒酵母CECA，在酒精发酵（alcoholic fermentation，AF）前8℃冷浸渍5d为CK-CM组；以先添加0.25g/L非酿酒酵母CT10，48 h后添加0.25 g/L酿酒酵母CECA为CA组；以先添加0.25 g/L非酿酒酵母CT10，48 h后添加0.25 g/L酿酒酵母CECA，在酒精发酵（AF）前8 ℃冷浸渍5 d为CA-CM组。CK、CA组分别在AF前期（比重1.081～1.119）、中期（比重1.018～1.169）、末期（比重0.998～1.018）、AF结束时（比重0.998）、陈酿1个月（比重下降至0.998终止发酵1个月后）进行取样；CK-CM、CA-CM组分别在AF前期（比重在1.097～1.119）、中期（比重在1.026～1.088）、末期（比重0.998～1.018）、AF结束时（比重0.998）、陈酿1个月进行取样。
1.3.2 干红葡萄酒酿造工艺及操作要点
赤霞珠葡萄分选→破碎除梗→压榨→葡萄醪→添加偏重亚硫酸钾与果胶酶→添加非酿酒酵母CT10→添加酿酒酵母CECA→冷浸渍→酒精发酵→过滤、澄清→添加偏重亚硫酸钾→瓶储→干红葡萄酒
赤霞珠葡萄原料分选进行破碎除梗，压榨后置于60 L不锈钢发酵桶中，添加30 mg/L偏重亚硫酸钾与30 mg/L果胶酶。添加0.25 g/L非酿酒酵母CT10 48 h后以1∶1添加0.25 g/L酿酒酵母CECA，再放置8 ℃机械冷库冷浸渍5 d，冷浸渍后浸渍发酵温度控制在25 ℃。每日监测比重、温度，待比重下降至0.998后酒精发酵结束，过滤、澄清后添加50 mg/L偏重亚硫酸钾终止发酵，25 ℃条件下装瓶陈酿。每组样品发酵60 L，总共240 L。
1.3.3 分析检测方法
葡萄酒基本指标：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]。
色度色调：参照李运奎等[12]的方法。
葡萄酒颜色、聚合色素、总色素：参照郝笑云[13]的方法。
总酚：采用福林肖卡（Folin-Ciocalteu）法[14]，其标准曲线回归方程为y=0.092 4x+0.004 0，相关系数R2为0.999 7；总类黄酮：采用氯化铝比色法[15]，其标准曲线回归方程为y=0.017 8x-0.012 6，相关系数R2为1.000 0；总花色苷：采用pH示差法[16]，其标准曲线回归方程为y=0.042 5x-0.006 7，相关系数R2为1.000 0；单宁：采用福林-单尼斯（Folin-Denis）法[14]，其标准曲线回归方程为y=0.322 7x+0.002 2，相关系数R2为0.999 9。
1.3.4 数据处理
每个指标做3次重复，利用Excel2010对数据进行基本处理，通过SPSS 27.0对数据进行单因素方差分析、相关性分析，每组做3个平行，采用Origin2021软件作图。
2 结果与分析
2.1 非酿酒酵母结合冷浸渍对葡萄酒基本指标的影响
由表1可知，各酒样基本指标均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的标准。AF结束时，（CA、CK-CM、CA-CM）组酒精度与对照组（CK）相比分别降低5.10%、9.09%、15.17%，总糖含量分别降低9.98%、13.72%、21.95%，挥发酸含量分别降低22.73%、18.18%、22.73%，总酸含量分别提升21.63%、9.72%、41.07%，CA-CM组总酸含量可达4.50 g/L，显著高于对照（CK）组（P＜0.05）。表明发酵前冷浸渍（8 ℃、5 d），添加非酿酒酵母CT10可以提升干红葡萄酒总酸含量，降低酒精、总糖、挥发酸的含量。齐白羽等[17]研究表明，非酿酒酵母对整个发酵过程的发酵速率与酿酒酵母的生长起到了一定的抑制作用，并且可以降低葡萄酒中酒精度、挥发酸、SO2含量，这与本研究结果相似。GIGLIO C等[18]研究表明，冷浸渍工艺可以增加葡萄酒中总酸含量，而浸渍条件则是决定葡萄酒品质的重要因素，这与本研究结果一致。
表1 不同处理酒样在酒精发酵结束时的基本理化指标
Table 1 Basic physicochemical indexes of wine samples with different treatments at the end of alcoholic fermentation
注：同行不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
基本指标 CK CA CK-CM CA-CM酒精度%vol总糖/（g·L-1）还原糖/（g·L-1）挥发酸/（g·L-1）pH游离SO2/（mg·L-1）总SO2/（mg·L-1）总酸/（g·L-1）12.13±0.15c 3.13±0.18bcd 2.16±0.68a 0.34±0.05bc 4.32±0.06a 8.00±1.60bc 35.73±6.66b 4.50±0.19 14.30±0.35a 4.01±0.20a 1.99±0.13bc 0.44±0.10a 4.22±0.05b 20.27±4.03a 48.00±5.77a 3.19±0.50 13.57±0.40b 3.61±0.21b 2.05±0.03abc 0.34±0.05bc 4.31±0.08ab 17.60±5.77ab 48.00±4.23a 3.88±0.47 13.00±0.36bc 3.46±0.14bc 2.14±0.03ab 0.36±0.05b 4.15±0.03bc 12.27±3.33abc 43.20±1.60ab 3.50±0.39
2.2 非酿酒酵母结合冷浸渍对葡萄酒色度、色调的影响
色度表示颜色的呈色强度，色调表示酒体颜色的红黄偏向[19]。由图1（a）可知，不同处理酒样在AF前期色度含量基本一致（P＞0.05）。AF中期时，CA、CK-CM、CA-CM组与对照组（CK）相比色度分别提升5.78%、6.27%、8.19%；AF末期时，CK-CM、CA-CM组色度均高于对照组（CK）；陈酿1个月时，CA、CK-CM、CA-CM组色度均高于对照组（CK），其中CA-CM色度可达7.21，显著高于对照（CK）组（P＜0.05）。由图1（b）可知，AF中期时，CA、CK-CM、CA-CM组色调低于对照组（CK），分别降低14.99%、14.13%、14.45%；AF末期，CA-CM组与对照组（CK）相比色调降低6.64%；陈酿1个月时，CA、CK-CM组与对照组（CK）色调含量基本一致，CA-CM组色调达到0.598。表明冷浸渍（8 ℃、5 d）在AF末期及陈酿1个月时期提升了各酒样色度含量，降低了各酒样色调含量，冷浸渍的浸提与非酿酒酵母的添加在一定程度上提升了葡萄酒的色泽。冷浸渍使总花色苷含量和辅色花色苷的比例得到了提升，从而提高了葡萄酒的呈色强度[20]。
图1 不同发酵时期不同处理酒样色度（a）及色调（b）变化
Fig.1 Changes of chromaticity (a) and hue (b) of wine samples with different treatments in different fermentation periods
不同小字字母表示同一时期不同处理酒样存在显著差异（P＜0.05）。下同。
2.3 非酿酒酵母结合冷浸渍对葡萄酒颜色、聚合色素、总色素的影响
由图2（a）可知，各酒样在AF前期葡萄酒颜色与对照组（CK）差异不显著（P＞0.05）。AF中期，CA、CA-CM组葡萄酒颜色含量均高于对照组（CK），分别提升6.72%、9.70%；AF末期，CK-CM、CA-CM组葡萄酒颜色均高于对照组（CK）；陈酿1个月时，CK-CM、CA-CM组与对照组（CK）相比葡萄酒颜色含量分别提升2.63%、4.82%，其中CA-CM可达2.390。由图2（b）可知，AF中期，CK-CM组聚合色素含量高于对照组（CK），提升16.82%；AF末期，CA、CK-CM、CA-CM组聚合色素与对照组（CK）相比分别提升6.17%、7.41%、8.02%；陈酿1个月时，CA、CA-CM组聚合色素含量均高于对照组（CK），其中CA-CM达到1.872。由图2（c）可知，AF中期，CA、CA-CM与对照组（CK）相比总色素含量分别提升4.87%、6.10%；AF末期，CA组总色素含量低于对照组（CK），CA-CM组与对照组（CK）相比总色素含量提升4.10%；陈酿1个月时，CA、CA-CM组总色素分别达到2.43、2.48。表明冷浸渍（8 ℃、5 d）在AF末期及陈酿1个月时期能有效浸提干红葡萄酒的色素物质，其中冷浸渍（8 ℃、5 d）结合非酿酒酵母CT10对于颜色物质的浸提效果更佳。可能是耐热克鲁维酵母（Lachancea thermotolerans）在酒精发酵期间通过糖代谢产生较高乳酸，可代谢产生含量较高的吡喃型花色苷，改善了颜色参数[21]。在酒精发酵前同时进行冷浸渍会增加花色苷分子的颜色强度，从而对红葡萄酒的颜色产生积极影响[22]。这与梁丽红等[23-24]的研究结果相似。
图2 不同发酵时期不同处理酒样的葡萄酒颜色（a）、聚合色素（b）及总色素（c）含量变化
Fig.2 Changes of color (a), polymeric pigment (b) and total pigment(c) contents of wine samples with different treatments in different fermentation periods
2.4 非酿酒酵母结合冷浸渍处理对葡萄酒酚类物质含量的影响
由图3可知，AF前期总酚、单宁、总类黄酮、总花色苷含量基本一致。由图3（a）可知，AF末期，CA、CK-CM、CA-CM组总酚含量高于对照组（CK），分别提升2.98%、4.06%、5.41%，其中CA-CM组达到2 256.85 mg/L；陈酿1个月时期，CA总酚含量低于对照组（CK），CK-CM、CA-CM组与对照组（CK）相比总酚分别提升3.57%、4.94%。由图3（b）可知，AF中期，CA、CK-CM、CA-CM组单宁含量均高于对照组（CK），分别提升44.41%、37.92%、53.89%，各酒样单宁含量最高，CA-CM可达3 185.62 mg/L；AF末期，各酒样单宁含量逐渐下降，CA组单宁含量低于对照组（CK）；陈酿1个月时，CK-CM、CA-CM组单宁含量高于对照组（CK）。由图3（c）可知，AF末期，CA、CK-CM、CA-CM组总类黄酮含量均高于对照组（CK），分别提升4.70%、9.25%、9.32%；陈酿1个月时，各酒样总类黄酮含量最高，CA-CM总类黄酮含量可达1 670.55 mg/L，高于对照组（CK）。由图3（d）可知，AF中期，CA、CA-CM组总花色苷含量均低于对照组（CK），CK-CM与对照组（CK）总花色苷含量基本一致；AF末期，各酒样总花色苷含量最高，CK-CM、CA-CM组总花色苷含量高于对照组（CK），分别提升43.79%、49.05%，CA-CM可达521.57 mg/L；陈酿1个月时，CK-CM组总花色苷含量高于对照组（CK），提升17.34%。冷浸渍工艺可以增加果酒中酚类物质的含量，而浸渍条件则是决定果酒中酚类物质组成的重要影响因素[25]。对于干红葡萄酒来说，酿酒技术中的浸渍条件与葡萄皮和种子的接触对酚类物质有着重要影响[26-28]。这与赵益梅等[29]的研究结果一致。冷浸渍结束后添加非酿酒酵母CT10启动酒精发酵可促进葡萄酒中酚类物质的浸提。
图3 不同发酵时期不同处理酒样的总酚（a）、单宁（b）、总类黄酮（c）及总花色苷（d）含量变化
Fig.3 Changes of total phenols (a), tannins (b), total flavonoids (c) and total anthocyanins (d) contents of wine samples with different treatments in different fermentation periods
2.5 不同处理酒样理化指标、颜色参数及酚类物质主成分分析
由图4可知，主成分（principal component，PC）1与PC2方差贡献率分别为58.90%、17.40%，累计方差贡献率可达76.30%。位于PC1正向端的是总酸、pH、还原糖、酚类物质、色度、葡萄酒颜色、聚合色素、总色素、总类黄酮、总花色苷、单宁，对在图4中同样位于PC1正向端的CK-CM、CA-CM贡献率较大；位于PC1负向端的是酒精度、总糖、SO2、挥发酸、色调，与同样位于PC1负向端的CK、CA贡献率较大。位于PC2正向端的是酒精度、SO2、pH、总酸、单宁、总类黄酮、葡萄酒总色素、聚合色素、色度，对同样位于PC2正向端的CA、CK2、CA-CM2、CA-CM3贡献率较大；位于PC2负向端的是总糖、还原糖、挥发酸、总酚、总花色苷、葡萄酒颜色，对同样位于PC2负向端的（CK1、CK3、CK-CM、CA-CM1）贡献率较大。由图4b可知，4组干红葡萄酒可有效区分。红葡萄酒颜色主要由花色苷及其衍生物所决定。随着陈酿和贮藏时间的推移，单体花色苷含量不断降低，它们通过氧化、聚合、环化或加成等作用，形成更为复杂的花色苷衍生物[30]。红葡萄酒酿造过程的颜色变化与酵母菌、皮渣接触方式等都有很大的关联，这与张娟等[31]的研究结果相似。新鲜红葡萄酒中的游离态花色苷含量较高，具有很强的化学活性[32]。辅色作用通过花色苷经分子间堆积、氢键连接等作用，与有机分子形成稳定的复合体，从而改变花色苷分子的形态，进而使其稳定性增加[33-34]。说明冷浸渍（8 ℃、5 d）及非酿酒酵母CT10处理对干红葡萄酒总酸、pH、酚类物质、颜色物质具有正相关影响，在一定程度上有效增加了酚类物质的含量并增强了酒的色泽。
图4 不同处理酒样各指标主成分载荷图（a）及得分图（b）
Fig.4 Principal component loading diagram (a) and score diagram(b) for each index of wine samples with different treatments
3 结论
发酵前冷浸渍（8 ℃、5 d）与添加非酿酒酵母CT10可以有效降低葡萄酒酒精度，提升总酸含量，有利于颜色物质的浸提，其中CA-CM组酒样效果最佳，在AF末期能有效提升色度、葡萄酒颜色含量。采用冷浸渍（8 ℃、5 d）工艺可以在AF末期提升总酚、总花色苷的含量。通过主成分分析，总酸、酚类物质、颜色物质对CK-CM、CA-CM贡献率较大，其中CA-CM组酒样效果最佳，在AF末期能有效提升总酚、总花色苷、色度、葡萄酒颜色的含量。冷浸渍结束后添加非酿酒酵母CT10启动酒精发酵可促进葡萄酒中酚类物质的浸提。这可为改善新疆产区干红葡萄酒品质提供理论依据。
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