浓香型白酒是中国白酒四大基本香型(浓、酱、清、米)之一,因具有芳香浓郁、绵柔甘洌等特点深受广大消费者喜爱,其产量和市场占有率占整个白酒行业的70%左右[1]。但浓香型白酒多以传统生产方式酿造,工艺复杂、繁琐,受原料、工艺操作、环境等因素的影响,生产过程中往往会出现各种异杂味,苦味、酸味、涩味、臭味、糠味是浓香型白酒中常见的异杂味[2-4],其中糠味是最常见的影响白酒质量的杂味[5]。因此,解析浓香型白酒糠味异嗅味物质基础对浓香型白酒品质提升具有重要意义。
白酒呈现类似生谷壳等辅料的气味特征就是糠味[6],会造成酒体尾味不净,后味中糠腥味突出,给人粗糙不舒适的感觉[7]。在白酒生产中,糠味主要来源于辅料中的稻壳,当稻壳用量过大或者清蒸不彻底时,就会产生糠醛等物质,使酒体中带有糠腥味[8-9]。前期研究发现,土臭素为中国白酒糠味的主要物质[10-11],并发现清香型白酒酒醅中糠嗅味物质土臭素含量最高,其次是浓香型白酒、酱香型白酒[12]。李泽霞等[13]通过气相色谱-嗅闻法(gas chromatography-olfactometry,GC-O)分析,确定了2-糠酸乙酯、4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、1,4-二甲氧基苯、1,2二甲氧基苯、笏、土嗅素、[3.3.1]壬二烯-3,7-二酮八种物质是白酒中的糠味物质。李玉英等[14]对青稞酒生产监控发现,稻壳在参与发酵的过程中会产生糠醛,糠醛是白酒中的呈香物质,能赋予白酒特殊的香味,但含量过高会使白酒产生糠霉味、燥辣味,从而影响青稞酒的质量。现有研究认为白酒中糠味异嗅主要是原料带入的异杂味,因此常采用原料筛选、清蒸除杂处理及控制辅料用量等方法避免糠味异嗅产生[15-16]。而杜海等[17]对影响产土味素链霉菌生长及代谢的白酒酿造相关环境因素进行研究,发现在酸性(pH 3.5)环境中,产土味素链霉菌菌体生长受到抑制,进而减少土味素的产生,为有效控制白酒中糠味异嗅提供了新思路。前期关于白酒中糠味异嗅的研究较多,但针对浓香型白酒糠味异嗅物质的研究还需进一步深入研究。
本研究按照相关国标对正常和糠味浓香型原酒进行感官评价,利用气质联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)和气相色谱-嗅闻-质谱(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry,GC-O-MS)技术检测正常和糠味浓香型原酒中挥发性风味物质,采用偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLSDA)构建模型,利用香气活度值(ordor active value,OAV)筛选重要香气化合物,通过变量重要性投影(variable importance in the projection,VIP)值筛选正常和糠味原酒差异的重要潜在标记物,并通过香气添加与缺失试验确认糠味物质。浓香型白酒糠味物质的解析,为糠味产生原因及产生机制研究提供理论基础,可以通过糠味物质的溯源明确其来源,进一步分析其产生原因,从而为预防和解决浓香型白酒中糠味异嗅味提供科学依据。
浓香型原酒样品:宜宾南溪酒业有限公司一车间生产,生产工艺与原料一致,生产时间为2023年3月至9月,包括10批正常浓香型白酒原酒样品和10批糠味缺陷型浓香型白酒原酒样品。酒精度在68.0%vol~74.7%vol。
乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、己酸、乙酸、异丁醛等97种标准品(纯度均>98%),其中乙酸正戊酯(内标1)、叔戊醇(内标2)、2-乙基丁酸(内标3)、茴香基丙酮(内标4)、二异丙基二硫醚(内标5):阿拉丁生化科技股份有限公司;辛酸乙酯-d15(内标6)、丁香酚-d3(内标7)、糠醛-d4(内标8):美国Icon Isotope公司;C6~C30正构烷烃(均为色谱纯):美国TEDIA公司;己酸己酯、己酸丁酯、甲硫醇、乙硫醇、吲哚、芴等43种标准品(纯度均>98%):上海安谱试验科技股份有限公司。
无水乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯(均为色谱纯):美国Thermo Fisher Scientific公司;氯化钠(NaCl)、无水硫酸钠(Na2SO4)、盐酸(HCl)(均为分析纯):中国国药化学试剂有限公司;超纯水:PURELAB Classic超纯水净化系统制备。
Agilent 8890气相色谱仪(配火焰离子检测器(flame ionization detector,FID)和脉冲火焰光度检测器(pulsed flame photometric detector,PFPD))、Agilent 8890-5977 B气质联用仪、DB-FFAP色谱柱(60m×0.25mm,0.25μm)、CP-Wax 57 CB毛细管色谱柱(50 m×0.25 mm,0.20 μm),美国Agilent科技有限公司;ODP4嗅闻仪、MPS2三合一自动进样器:德国GERSTEL公司;固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)三相萃取头(1 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS):美国SUPELCO公司;PURELAB Classic超纯水机:英国ELGA公司。
1.3.1 感官分析
参考国际标准化组织(international organization for standardization,ISO)8586—2012《感官分析.选定的评估员和专业感官评估人员的选择、培训和监视的通用指南》和国家标准GB/T 10345—2022《白酒分析方法》,感官分析在温度为(20±1)℃的品评室内进行。感官评价小组由5名训练有素的国家级白酒评委组成。所有小组成员嗅闻白酒样品讨论香气属性,并确认其表征香气描述词为“窖香”、“陈香”、“粮香”、“糟香”、“酸香”、“糠味”6种特征香气属性。小组成员按照六点法[18]进行打分(0表示未闻到香气,5表示气味最强)。最终以品评人员打分结果的算术平均值为每种香气的强度值,绘制香气轮廓图,每个分析重复3次。
1.3.2 糠味浓香型白酒样品中糠味物质初步分析
糠味浓香型白酒样品中糠味物质分析采用GC-O-MS法[19-20]。取糠味浓香型原酒酒样50 mL于500 mL分液漏斗中,用超纯水稀释至乙醇体积分数为10%~14%,加氯化钠至溶液饱和。用二氯甲烷萃取3次(共150 mL,50 mL/次),合并3次的萃取液后加入适量无水Na2SO4,置于-4 ℃冰箱中过夜干燥,过滤,氮吹浓缩至0.5 mL后进行GC-O-MS分析。
气相色谱条件:DB-FFAP色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),升温程序为:初始温度40 ℃,保持5 min,以3.5 ℃/min升至250 ℃,保持5 min;载气为高纯氦气(He)(纯度>99.999%),流速为1.42 mL/min,进样口温度250 ℃,进样量为1 μL,不分流进样。
质谱条件:电子电离(electronic ionization,EI)源;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;辅助通道加热温度280 ℃;全扫描模式,质量扫描范围20~500 m/z。
嗅闻仪条件:嗅闻仪传输线温度为250 ℃,嗅闻口温度为200 ℃,加湿器流速50 mL/min,流出成分在毛细管末端以1∶1的分流比流入嗅闻仪及质谱。
1.3.3 浓香型白酒样品中挥发性风味物质分析
正常浓香型白酒样品中挥发性风味物质分析采用GC-MS法进行定性,采用直接进样结合GC-FID技术、顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)结合GC-PFPD技术及不同进样方式结合质谱联用技术(GC-MS)等多种检测技术对浓香型白酒中挥发性风味物质定量[21]。所有样品一式三份进行平行测定。
1.3.4 香气活度值计算
香气活度值(OAV)表示化合物浓度与香气阈值的比值,它是衡量某种香气化合物对酒样整体香气贡献度大小的重要指标。一般认为,OAV>1的香气化合物是对酒样有明显香气贡献的重要香气化合物[22]。基于风味物质定量结果,并查阅文献中每种香气物质的香气阈值[23-24]计算得到OAV,其计算公式如下:
式中:C为各香气化合物质量浓度,μg/L;OT为各香气化合物阈值,μg/L。
1.3.5 香气添加与缺失试验
选用正常原酒为基质样品,向其中添加一定浓度的目标化合物,添加完毕后将样品置于室温条件下放置7 d。经6名省级及以上白酒评委对添加样品及未添加基质样品进行感官分析,小组成员采取六分法对“窖香”、“陈香”、“粮香”、“糟香”、“酸香”、“糠味”6种特征香气属性的强度进行评分,最终以品评人员打分结果的算术平均值为每种香气的强度值,绘制香气轮廓图,每个分析重复3次。为了进一步确定各成分对糠味的贡献程度,采用相同感官分析方法,将香气添加试验中添加的化合物按化合物种类及风味特征分组,并逐一进行缺失验证某一种或一类化合物对糠味特征的影响程度。
1.3.6 数据处理
采用Origin 2021 b绘制轮廓图、金字塔图;使用SIMCA 14.1软件进行偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)。
为了明确正常浓香型白酒原酒和糠味浓香型白酒原酒整体香气差异,对两种类型浓香型原酒香气进行感官特征分析,结果见图1。由图1可知,除粮香外,窖香、糟香、陈香、酸香和糠味感官属性在两种类型原酒之间都具有显著性差异,其中糠味香气属性在糠味原酒中强度较强,其余香气属性糠味原酒强度都弱于正常原酒。
图1 正常与糠味浓香型原酒感官分析结果
Fig.1 Sensory analysis results of normal and bran flavor strongflavor raw liquor
“*”表示差异显著(P<0.05);“**表示差异极显著(P<0.01);“***”表示差异高度显著(P<0.001)。
GC-O分析过程中主要香气为花果香等酯类、醇类物质气味和酸臭味等酸类物质气味,说明酯类、醇类、酸类等是糠味浓香型原酒的主要呈香物质。嗅闻过程中着重注意与糠味相关香气特征的收集,结果在保留时间35.12 min处嗅闻到明显麦麸味气味,由此处质谱全离子扫描图可知该保留时间处有多种物质混合构成,与美国国家标准技术研究所(national institute of standards and technology,NIST)20.L标准质谱库进行匹配,解析出此处存在苯甲酸乙酯和丁二酸二乙酯,推测这两种物质可能与浓香型白酒糠味相关。采用标准品对苯甲酸乙酯和丁二酸二乙酯香气特征进行确认,在体积分数50%乙醇溶液中苯甲酸乙酯具有水果香、醇香,而丁二酸二乙酯具有花香、酯香,二者混合使溶液果香味增强,但并未呈现出糠味特征,因此,浓香型白酒糠味呈现还需要其他物质参与,需要进一步挖掘。
对10批正常浓香型白酒原酒样品和10批糠味缺陷型浓香型白酒原酒样品中挥发性风味物质进行GC-MS分析,根据定量结果结合香气阈值计算各香气化合物的OAV,各香气化合物在正常原酒和糠味原酒中的含量及OAV平均值见表1。
表1 浓香型白酒样品中香气物质含量测定结果及香气活力值
Table 1 Determination results and odour activity value of aroma substances in strong-flavor Baijiu samples
序号 化合物 定量方法 阈值/(μg·L-1)正常原酒检测结果/(μg·L-1)OAV糠味原酒检测结果/(μg·L-1) OAV 123456酯类甲酸乙酯乙酸乙酯*丙酸乙酯甲酸异戊酯乙酸丙酯丁酸丁酯GC-FID GC-FID HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS 150 32 600 19 000—65 000 430 111 958.40±1 142.64 4 350.46±291.46 117 774.80±2 012.47 16 736.75±596.71 416 360.21±3 562.55 138.56±13.62 746.39 133.45 6.20—6.41<1 43 859.20±752.17 2 034.99±115.26 12 226.76±2 159.44 2 647.69±98.92 78 645.91±4 831.42 139.71±11.47 292.39 62.42<1—1.21<1
续表
序号 化合物 定量方法 阈值/(μg·L-1)正常原酒检测结果/(μg·L-1)OAV糠味原酒检测结果/(μg·L-1) OAV 7 8 9 1 0 500 600 140 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS GC-FID HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS GC-FID GC-FID HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS 8—1 5 500 900 200 700 5 560 35 12 800 13 200 250000—677.84 12.90 1 400—960.56 3 150.61 1 890 1 120 406.83 636.07—640 51 400 407 909—180.24 16 000 125 1 433.65 39 299 4 000 3 154 3 500 1 271.19±96.27 64.74±6.24 204 918.20±3 532.79 9 118.15±364.78 10 276.56±532.53 4 733.50±145.62 6 480.80±527.72 365 897.20±2 043.79 3 222.71±93.54 532.60±4.14 19 360.48±983.23 2 891.25±53.20 16 269.14±721.46 175 211.90±1 853.27 823 889.50±4 220.21 154.79±2.15 37 723.90±325.31 66 108.33±942.24 5 031.95±194.47 3.15±0.18 24.93±2.14 3 519.89±653.52 588.83±62.42 851.67±79.45 99.70±10.46 1 278.14±215.62 1 209.69±186.30 547.91±47.29 52.94±10.24 5 039.78±204.74 611.14±101.25 34 057.09±1439.35 495.21±74.60 13.57±3.71 2 052.11±367.32 2.37±0.68 40 722.89±1 956.26 20 226.30±1 057.40 533.31±74.39 58 561.67±2 157.53 2.54<1 1 463.70 1 139.77—315.57 12.96 406.55 16 113.54<1 3.48 82.61 1.27 13.27 3.30—55.65 5 124.68 3.59—<1 1.12<1<1<1 2.01—<1<1 12.38<1—2.75<1 16.42<1 1.04 5.06<1 12.68 1 526.30±112.33 32.45±2.41 150 167.40±3 011.65 753.69±4.92 6 126.50±276.17 1 128.10±58.28 6 686.50±502.48 73 558.60±835.35 972.88±8.42 186.24±1.68 4 211.02±96.42 10 115.67±20.19 3 407.67±65.35 25 699.70±321.66 888 719.22±5026.58 153.27±2.03 18 636.00±157.92 16 075.30±424.25 3 167.96±117.36 3.09±0.46 61.77±5.48 2 308.80±517.83 140.05±35.68 1 846.70±215.02 275.86±21.43 3 170.19±435.32 6 622.36±743.03 835.16±65.20 62.58±13.53 3 242.70±112.66 674.86±158.57 6 041.22±859.16 900.43±30.02 26.03±5.88 2 068.17±365.43 1.07±0.48 40 500.60±2 186.06 16 130.00±895.77 496.76±58.37 41 395.20±1 643.21 3.05<1 1 072.62 94.21—75.21 13.37 81.73 4 864.41<1<1 289.02<1 1.95 3.55—27.49 1 246.15 2.26—<1<1<1 1.65<1 4.98—1.30<1 7.97<1—5.00<1 16.55<1 1.03 4.03<1 11.83 47 48 49 50丁酸-3-甲基丁酯辛酸异戊酯丁酸乙酯2-甲基丁酸乙酯乙酸丁酯异戊酸乙酯乙酸异戊酯戊酸乙酯己酸乙酯*丙酸异戊酯乙酸己酯乳酸丁酯己酸丙酯庚酸乙酯乳酸乙酯乙酸糠酯己酸丁酯辛酸乙酯己酸异戊酯丙酸糠酯丁酸苯乙酯壬酸乙酯己酸己酯癸酸乙酯苯甲酸乙酯丁二酸二乙酯乳酸异戊酯十二酸乙酯2-羟基己酸乙酯苯乙酸乙酯乙酸苯乙酯乙酰丙酸乙酯十四酸乙酯糠酸乙酯苯丙酸乙酯苯甲酸甲酯棕榈酸乙酯油酸乙酯异丁酸苯乙酯亚油酸乙酯醇类仲丁醇正丙醇异丁醇正丁醇HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS GC-FID GC-FID 5 000 314 000 200 000 2 730 189 348.30±6 264.52 753 748.70±8 471.41 79 893.89±853.73 587 739.30±7 252.26 37.87 2.40<1 215.29 54 748.50±2 305.27 560 809.50±6 353.85 87 579.70±946.18 606 750.50±8 835.37 10.95 1.79<1 222.25
续表
序号 化合物 定量方法 阈值/(μg·L-1)51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 HS-SPME-GC-MS GC-FID GC-FID GC-FID GC-FID GC-FID GC-FID HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS GC-FID GC-FID GC-FID HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS 70 000 37 400 4 000 6.12 194 000 668 000 1 100 54 700 28 900 900 806 180 1 433.94 25.36 1 100 100 67 68 69 70 72 73 74 75 76 77 78 79 80 HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS 200 000 18 100 1 580 974 1 050 389 2 520 13 300 2 700 3 560 13 700 143.84 25 000 81 82 83 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS GC-FID LLME-GC-MS GC-FID GC-FID HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS GC-FID 25 000 1 312.56 122 4 200 178 25.5 40 70.81 25 26 0.01 2 086.5 93 94异戊醇正戊醇正己醇1-辛烯-3-醇2-戊醇2,3-丁二醇正辛醇糠醇β-苯乙醇苯甲醇壬醇癸醇2-庚醇芳樟醇正辛醇橙花叔醇酸类乙酸*丙酸异丁酸丁酸异戊酸戊酸己酸庚酸辛酸壬酸癸酸4-甲基戊酸苯甲酸醛和缩醛类乙醛异丁醛壬醛苯甲醛异戊醛正己醛辛醛癸醛苯乙醛香草醛反顺-壬二烯醛乙缩醛1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷酮类2-丁酮2-戊酮GC-FID HS-SPME-GC-MS——70 000正常原酒检测结果/(μg·L-1)205 553.20±2 854.64 91 284.05±1 170.46 157 089.07±4 255.03 446.34±77.26 20 489.44±965.44 7 603.22±564.37 944.56±84.42 4 073.39±298.40 1 128.44±153.21 32.23±7.06 263.64±12.68 7.91±1.14 2 987.06±426.08 0.61±0.08 944.56±64.74 39.76±2.53 2 990.78±384.64 9 924.00±867.01 6 593.78±425.75 78 716.89±1 563.62 18 749.67±953.03 46 405.67±1 154.59 260 126.44±8 605.35 13 707.56±643.53 4 031.56±536.36 347.50±65.32 932.37±159.04 1 104.48±247.70 758.18±164.73 89 554.22±5 539.05 1 780.56±532.28 1 221.42±425.62 313.62±75.32 121 003.70±9 352.01 9 410.10±2 546.36 3 120.49±843.60 125.40±21.53 1 106.50±63.25 44.036±13.20 15.20±5.25 286 613.80±82 525.6 95 083.67±3 502.53 6 816.89±539.21 14 464.33±739.62 OAV 2.94 2.44 39.27 72.93<1<1<1<1<1<1<1<1 2.08<1<1<1 14.95<1 4.17 81.66 17.86 119.29 103.22 1.03 1.49<1<1 7.68<1 3.58 1.36 10.01<1 679.80 369.02 78.01 1.77 44.26 1.69 1 520.43 137.37——<1糠味原酒检测结果/(μg·L-1) OAV 330 626.80±3 536.92 37 400.87±643.70 101 757.32±2 758.31 801.16±150.45 4 743.00±375.40 8 636.10±637.09 598.64±54.52 4 615.26±396.36 2 199.10±289.06 52.09±10.77 42.26±3.63 13.74±2.86 537.99±48.43 1.26±0.19 598.64±20.17 70.45±5.75 4.72 1.00 25.44 130.91<1<1<1<1<1<1<1<1<1<1<1<1 2 448.72±264.06 13 770.00±1 043.58 5 833.70±399.64 61 334.70±1 684.81 5 802.60±536.24 2 090.40±175.35 68 235.70±2 534.50 2 146.70±265.07 1 059.17±126.43 211.31±41.68 953.20±256.30 812.86±143.15 749.66±185.36 12.24<1 3.69 63.63 5.53 5.37 27.08<1 1.12<1<1 5.65<1 83 384.90±4 925.30 986.10±382.53 424.14±119.32 491.02±102.59 76 193.30±6 524.20 6 317.39±1 636.47 1 343.06±593.17 59.78±15.60 2 567.35±184.91 42.94±10.08 8.57±2.69 125 213.40±41 536.0 36 411.10±1 320.88 3.34<1 3.48<1 428.05 247.74 33.57<1 102.69 1.65 857.20 60.01 3 582.00±246.30 5 085.30±288.24——<1
续表
注:“*”风味物质表示其单位为mg/L,“—”表示未查询到阈值,“n.a”表示未检出。
序号 化合物 定量方法 阈值/(μg·L-1)95 96 97 98 99 100 101 102 HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS GC-FID HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS 250 140 259 0.025 400 255.68 60 2.5 103 104 105 106 107 108 109 110 111 HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS GC-FID GC-FID HS-SPME-GC-MS 3 000 466 000 14.5 58 504 40 900 35 2 200 90.7 2 820 112 113 114 115 116 117 118 119 LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS LLME-GC-MS 9.5 315 123 40 18 900 147 600 21.24 120 121 122 123 124 125 126 127 128 HS-SPME-GC-PFPD HS-SPME-GC-PFPD HS-SPME-GC-PFPD HS-SPME-GC-PFPD HS-SPME-GC-PFPD HS-SPME-GC-PFPD HS-SPME-GC-PFPD HS-SPME-GC-PFPD HS-SPME-GC-PFPD 2.21 0.84 500 150 9.13 0.36 45.9 24.08 3 080 129 130 131 132 133 134 135总计*2-辛酮2-庚酮3-羟基-2-丁酮1-辛烯-3-酮2-十一酮苯乙酮香叶基丙酮β-大马酮内酯类糠醛5-甲基糠醛2-戊基呋喃2-乙酰基呋喃2-乙酰基-5-甲基呋喃γ-丁内酯γ-戊内酯γ-壬内酯γ-辛内酯酚类愈创木酚4-甲基愈创木酚4-乙基愈创木酚4-乙烯基愈创木酚苯酚4-甲基苯酚4-乙基苯酚丁香酚硫化物甲硫醇乙硫醇3-甲硫基丙醇丁酸甲硫醇酯二甲基二硫二甲基三硫壬硫醇苯并噻酚甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫其他类吲哚3-甲基吲哚萘柏木脑芴土味素α-柏木烯HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS HS-SPME-GC-MS 0.3 6.09 159.3 21 396 8.12 0.11 18 170正常原酒检测结果/(μg·L-1)99.56±25.06 1 168.82±263.19 3 585.78±342.64 12.78±1.60 171.54±15.98 25.26±3.51 1.74±0.68 42.68±7.39 15 808.67±6 460.07 16.32±9.57 448.80±86.40 79.07±10.44 58.20±11.52 151.06±18.43 987.32±58.15 35.15±8.06 70.77±14.28 61.36±8.53 17.26±4.18 17.36±3.51 17.78±6.38 645.59±37.54 3 587.94±743.53 18.77±8.43 14.81±4.77 142.70±18.99 324.60±38.62 2.15±1.47 342.94±43.52 273.18±39.69 356.79±47.91 13.64±5.44 n.a n.a 7.91±4.77 12.92±3.68 30.98±9.36 1.30±0.87 13.29±5.44 10.50±4.98 12.72±8.42 16 351.66 OAV<1 8.35 13.84 511.03<1<1<1 17.07 5.27<1 30.95<1<1 4.32<1<1<1 6.46<1<1<1<1 24.41<1<1 64.57 386.43<1 2.29 29.92 991.09<1——26.38 2.12<1<1 1.64 95.49<1糠味原酒检测结果/(μg·L-1) OAV 60.24±17.36 298.59±39.45 4 943.40±501.33 8.87±1.17 77.31±9.46 38.68±5.19 0.03±0.01 59.58±9.61<1 2.13 19.09 354.64<1<1<1 23.83 24 973.23±9 242.40 11.29±6.39 428.46±77.03 99.60±19.37 52.23±13.64 215.71±30.52 914.57±49.09 68.28±14.36 24.21±5.35 8.32<1 29.55<1<1 6.16<1<1<1 59.90±7.16 112.64±36.50 56.20±8.19 34.10±11.75 260.44±18.57 1 221.48±468.22 30.50±14.71 16.33±5.26 6.31<1<1<1<1 8.31<1<1 203.53±25.16 283.59±31.47 2.34±1.69 37.84±8.55 165.31±18.40 225.74±38.88 0.64±0.49 16.36±10.43 59.05±6.41 92.10 337.60<1<1 18.11 627.06<1<1<1 8.36±6.22 9.35±2.69 62.58±14.07 0.76±0.42 7.47±2.66 27.65±6.31 9.78±6.38 9 274.14 27.86 1.54<1<1<1 251.32<1
由表1可知,正常原酒与糠味原酒中共检出挥发性风味物质135种,其中正常原酒中共检出挥发性风味物质133种,包括酯类46种,醇类20种,酸类13种,醛与缩醛类13种,酮类10种,内酯类9种,酚类8种,硫化物7种,其他类7种;糠味原酒中共检出挥发性风味物质135种,硫化物比正常白酒多两种,但这两种化合物含量均较低,对样品整体香气贡献不大(OAV<1)。135种挥发性风味物质中OAV>1,即对两种样品风味有明显香气贡献的重要香气化合物共64种。正常原酒与糠味原酒中风味物质总量分别为16 351.66 mg/L和9 274.14 mg/L,糠味原酒风味物质总量仅为正常原酒的56.7%,风味物质的相对欠缺,导致样品整体香气不足,这与感官分析中糠味原酒在窖香、糟香、陈香、酸香等香气属性强度弱于正常原酒的结果一致。前期GC-O-MS分析可知,丁二酸二乙酯和苯甲酸乙酯可能与浓香型白酒糠味相关,由定量结果可知二者在糠味原酒中含量分别为正常原酒的2.48和2.78倍,进一步验证了其与浓香型白酒糠味密切相关。这与酒中异杂味的实质是一些物质的存在打破了酒体中呈香呈味物质之间的平衡,严重影响了白酒的风味,降低了白酒的优质率的前期研究结论一致[25-26]。
为了进一步挖掘造成正常和糠味原酒差异的主要因素,对20个样品中OAV>1的重要香气化合物定量数据进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA),结果见图2。由图2a可知,PLS-DA模型很好地区分正常原酒和糠味原酒,该模型的解释变异度(R2Y)和预测能力(Q2)分别为0.952和0.909,R2Y和Q2都比较接近1,说明该模型拟合效果较好。采用200次的置换检验评估该模型模型的预测能力,通过置换检验图(图2b)可以看出,两组数据分离度较好,同时Q2在Y轴的截距是负值,表明该模型有较好预测能力[27]。变量重要性投影(VIP)值表示每个变量对样品区分的贡献程度,一般认为VIP>1的变量是解释样品差异的潜在标记化合物[28]。由图2c可知,筛选出导致正常与糠味浓香型白酒差异的重要潜在标记物32种,包括戊酸、乙缩醛、戊酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、土味素、1-辛烯-3-醇、甲硫醇、二甲基三硫等。
图2 正常与糠味浓香型白酒香气化合物偏最小二乘判别分析
Fig.2 Partial least squares discrimination analysis of aroma compounds in normal and bran flavor strong-flavor Baijiu
a为得分图;b为200次置换检验图;c为VIP预测值分布图。
对这32种导致正常与糠味浓香型白酒差异的重要潜在标记物的OAV进行分析,结果见图3。由图3可知,糠味原酒中土味素、十四酸乙酯、γ-丁内酯、苯乙醛、甲硫醇、1-辛烯-3-醇的OAV高于正常原酒,这6种物质可能与浓香型原酒糠味具有重要相关性。
图3 导致正常与糠味浓香型原酒差异重要潜在标记物的香气活度值
Fig.3 Odour activity values of important potential markers causing the difference between normal and bran flavor strong-flavor Baijiu
a为OAV>140;b为OAV<140。
通过GC-O-MS分析结果结合多元统计分析正常原酒与糠味原酒香气化合物差异结果,筛选出可能与浓香型白酒糠味密切相关的化合物有8种,分别为丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯、土味素、十四酸乙酯、γ-丁内酯、苯乙醛、甲硫醇、1-辛烯-3-醇,其中苯甲酸乙酯OAV<1,但是在嗅闻过程中其保留时间处显现出较强的香气活性,由于文献中香气阈值大多是水中阈值,可能是由于基质不同导致化合物香气强度不同,所以在此处也一并考虑。
采用正常浓香型原酒作为基质样品,将筛选出的与浓香型白酒糠味密切相关的8种化合物分组,由于丁二酸二乙酯和苯甲酸乙酯为GC-O分析得到,其余指标为化学计量学分析得到,其中土味素为前期白酒糠味研究中多次得到的研究结论,因此将8种物质分成3组,分组及化合物信息见表2。
表2 香气添加与缺失试验设计
Table 2 Design of aroma addition and omission tests
组名 添加/缺失化合物组-1组-2组-3组-4丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯土味素十四酸乙酯、γ-丁内酯、苯乙醛、甲硫醇、1-辛烯-3-醇丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯、土味素、十四酸乙酯、γ-丁内酯、苯乙醛、甲硫醇、1-辛烯-3-醇
本研究前期基于糠味原酒风味物质总量和正常原酒相差较多,推测是与糠味相关化合物在风味物质总量中占比失调导致糠味出现,所以添加与缺失试验以正常原酒为添加基质,按各化合物在糠味原酒风味物质总量的占比进行补充添加。组织感官评价小组对样品香气属性强度进行评分,根据品评小组成员感官分析结果绘制香气轮廓图,结果见图4a。由图4a可知,三组化合物分别添加后样品中糠味强度无显著变化,而当三组化合物同时添加后样品中糠味显著增强,可能是具有花果香的酯类、醛类物质掩盖了土味素、甲硫醇及1-辛烯三醇等异嗅物质的部分异嗅风味而呈现出新的风味特征-糠味,也可能是化合物的添加改变了基质,基质效应对风味物质的香气表达存在一定的影响,导致糠味风味增强,总之,三组化合物中的8种物质存在协同作用,他们在风味物质总量中占比过高会导致浓香型白酒糠味露头。在感官分析过程中还发现土味素的添加对样品感官特征影响较大,由于土味素的添加会使样品中土霉味异臭凸出,导致样品窖香、粮香、糟香、陈香等香气属性都显著降低。
图4 香气添加(a)与缺失(b)试验感官分析结果
Fig.4 Sensory analysis results of aroma addition (a) and omission(b) tests
为了进一步验证上述三组化合物对浓香型白酒糠味的贡献程度,以正常原酒为添加基质,以8种化合物全部添加的样品作为对照,三组化合物依次进行缺失,组织感官评价小组进行感官分析,根据品评小组成员感官分析结果绘制香气轮廓图,结果见图4b。由图4b可知,缺失丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯及缺失土味素后样品糠味显著降低,说明这3种化合物与浓香型白酒显著相关;而缺失十四酸乙酯、甲硫醇、1-辛烯-3醇、γ-丁内酯、苯乙醛等化合物对样品糠味强度无明显影响,说明这些物质与浓香型白酒糠味相关性不大。
综上,土味素、丁二酸二乙酯和苯甲酸乙酯共同作用是导致浓香型白酒糠味的主要原因。究其原因可能是带有花果香、酯香的丁二酸二乙酯和苯甲酸乙酯掩盖了部分土味素强烈的土霉味,使样品呈现出新的异嗅味——糠味,也可能是基质的改变对化合物香气表达存在一定的影响,导致糠味风味增强。
本研究对正常和糠味浓香型原酒进行感官评价,利用气质联用(GC-MS)和气相色谱-嗅闻-质谱(GC-O-MS)技术检测正常和糠味浓香型原酒中挥发性风味物质、糠味物质,采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)构建模型,利用香气活度值(OAV)筛选重要香气化合物,采用变量重要性投影(VIP)值筛选正常和糠味浓香型原酒差异的重要潜在标记物,并通过香气添加与缺失试验确认糠味物质。结果表明,与正常原酒相比,糠味原酒中糠味香气属性较强,窖香、糟香、陈香、酸香等香气属性较弱。正常和糠味原酒中共检出135种挥发性风味物质,其中重要香气化合物(OAV>1)共64种,通过PLS-DA筛选出导致正常与糠味浓香型白酒差异的潜在标记物(VIP>1)32种。香气添加与缺失试验结果显示,土味素、丁二酸二乙酯和苯甲酸乙酯共同作用是导致浓香型白酒糠味的主要原因。前期研究表明土味素是很多香型白酒中糠味形成的重要影响因素,本研究通过风味组学和感官组学研究发现土味素是造成浓香型白酒土霉味的主要原因,而浓香型白酒的糠味是土味素、丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯共同作用的结果。浓香型白酒糠味物质基础的明确为后期糠味物质的溯源和产生机制研究提供方向,为解决浓香型白酒糠味异杂、提升浓香型白酒品质奠定了基础。
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Analysis of off-flavor-bran flavor substances in strong-flavor Baijiu