中国白酒是世界六大蒸馏酒之一，以谷物为原料，通过蒸煮、发酵、蒸馏和勾调而成[1]。俗话说“好粮出好酒”，可见高粱的品质对白酒的酒质有直接影响。目前国内对酿酒高粱的研究主要集中在高粱中的淀粉、蛋白质、脂肪和单宁等主要成分的检测[2-3]，高粱蒸煮的香气成分对白酒品质的影响方面[4]，但是高粱自身的香气物质对白酒风味品质的影响缺乏深入研究。高粱中的香气物质以游离态和结合态两种形式存在[5]。结合态化合物通常是糖苷类化合物，需要经过热解[6]、酶解[7]和酸解[8]等释放出香气成分，结合态香气物质是游离态香气物质的2～8倍[9]。孙细珍等[10]研究了不同品种高粱对清香型白酒品质的影响，研究表明，糯高粱作为小曲白酒的酿造原料，在提高甜香、粮食香、水果香等香气特征上比粳高粱更具优势。程度[11]研究了不同品种酿酒高粱对酱香型白酒品质的影响，结果表明，糯高粱种皮耐蒸煮性更强，蒸煮香气更优，糯高粱比粳高粱更容易发生液化和糖化。王志伟等[12]分别研究了“晋杂22号”、“晋粱白2号”、“晋粱白3号”3种高粱对黄酒风味品质的影响，结果表明，“晋粱白3号”的支链淀粉质量分数最高，风味物质的种类及质量浓度也最高。
以五粮液为代表的川派浓香型白酒，通过清蒸辅料、续糟配料、掐头去尾、量质摘酒等生产工艺，使酒体具有窖香浓郁、绵甜醇厚等特点[13]。其中“续糟配料”是指发酵成熟的酒糟和新鲜粮食一起上甑蒸酒，新鲜粮食带有独特的香气物质通过蒸馏过程进入到基酒中，从而影响白酒的风味，在白酒感官品评中被称作“粮香”[14-15]。高粱中的香气成分分为生粮香和蒸粮香，目前常用的提取高粱香气的方法有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE），固相萃取（solid phase extraction，SPE），顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）和同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）等。其中顶空固相微萃取法操作方便，前处理简单，能检测到较多的挥发性香气成分[16]，固相萃取法可以同时完成样品的富集与净化，但是成本较高[6]，同时蒸馏萃取法是通过少量溶剂提取大量样品的浓缩方法，但是前处理较为复杂[17]，液液萃取法因其回收率高[18]，能将大多数物质萃取出来，是提取风味物质的常用手段之一，可以起到富集浓缩风味物质、突出香气特征的作用。
高粱中含有大量的色素和油脂，在前处理过程中，除了考虑风味物质的富集和浓缩，还应该考虑色素和油脂的去除。为了尽可能全面地分析高粱中的香气成分，本研究比较了不同前处理方式对酿酒高粱香气的分离提取效果。本研究以酿酒高粱为研究对象，比较液液萃取、顶空固相微萃取和固相萃取前处理方法对高粱香气的提取效果，建立基于液液萃取结合气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）联用技术分析酿酒高粱中香气成分的方法，以期科学地认识酿酒高粱中的香气成分，为白酒中香气成分的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
糯性酿酒高粱粉（20目）：由白酒生产企业粮曲车间提供；乙醇、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷（均为分析纯）：国药集团化学试剂公司。C7～C30正构烷烃（均为色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
8890/7000D气相色谱串联质谱联用仪、DB-WAX毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）：美国Agilent公司；6 mL CNW BOND LC-C18小柱：上海安谱实验科技股份有限公司；Eppendorf 5810R型离心机：德国Eppendorf公司；YM-060S型超声波：深圳市方奥微电子有限公司；ML1602/02型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；JSFM-II型粉碎机：中储粮成都储藏研究院有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酿酒高粱中的挥发性风味成分的提取
液液萃取：参照倪德让等[19]的方法稍作改动：称取5 g高粱粉，加入50 mL体积分数60%乙醇，用封口膜封口后超声提取（超声温度20 ℃、功率300 W）30 min，提取结束后，4 000 r/min离心10 min，移出上清液，残渣再提取2次，合并3次上清液并于35 ℃减压蒸馏至10 mL，加入2 g氯化钠，然后分别用等体积正己烷和乙酸乙酯分别萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠除去多余水分后，氮吹浓缩至500 μL。
顶空固相微萃取：参照丁一等[20]的方法稍作改动：向15 mL顶空瓶中加入5 g粉碎后的高粱和5 mL水，加热蒸煮2 h后，进行顶空固相微萃取，萃取过程由CTC多功能自动进样器实现。萃取条件：采用80 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取头，60 ℃预热5 min后，将萃取头插入顶空瓶内吸附萃取30 min，萃取结束后萃取头于GC进样口250 ℃解吸5 min。
固相萃取：参照韩现文等[21]的方法稍作改动：称取5 g粉碎后的高粱于三角烧瓶中，加入50 mL去离子水，封口膜封口后超声提取（超声温度20 ℃、功率300 W）30 min，提取结束后，4 000 r/min离心10 min，移出上清液，用10 mL正己烷萃取，将下层水溶液倒入经5 mL甲醇和5 mL水活化过的LC-C18小柱中，完成上样后将固相萃取小柱抽干，用10 mL重蒸二氯甲烷洗脱目标物，洗脱液中加入少量无水硫酸钠脱水后氮吹浓缩至500 μL。
1.3.2 酿酒高粱中的挥发性风味成分分析
气相色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温为初始温度35 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升至230 ℃，保持15 min，采用恒流模式，载气为高纯氦气（He），流速1.0 mL/min，不分流进样，进样量1 μL，进样口温度为250 ℃。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源：电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围45～500 m/z，溶剂延迟5 min。
1.3.3 挥发性风味成分的定性定量
定性分析：基于气相色谱线性保留指数（retention in dex，RI），将气相色谱质谱联用仪检测到的未知化合物的谱图与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）光谱库20.L进行数据对比。
定量分析：采用峰面积归一法。
1.3.4 数据分析
采用Office Excel 2016进行数据计算。
2 结果与分析
2.1 不同萃取方法对酿酒高粱挥发性风味的影响
在液液萃取、顶空固相微萃取和固相萃取3种萃取方法中，顶空固相微萃取由于没有溶剂提取的过程，无须考虑色素和油脂的去除，液液萃取的样品溶液呈轻微的淡黄色，样液中残留了少量的色素。固相萃取的样液则是透明无色的状态。
高粱挥发性风味物质的GC-MS分析总离子流图见图1。由图1可知，液液萃取、顶空固相微萃取、固相萃取结合GC-MS的高粱挥发性风味物质分别有37种、22种、16种化合物，其中，醛类化合物分别有15种、9种、5种。酿酒高粱中的挥发性风味物质大部分都是醛类化合物，LLE结合GC-MS法检测到出15种醛类物质，主要为不饱和脂肪醛类化合物。HS-SPME结合GC-MS法检出9种醛类物质，主要为饱和脂肪醛，如2-甲基丁醛、3-甲基丁醛等。SPE结合GC-MS法检测到醛类物质较少，只有5种。该结果与吕佳慧等[7-8]的研究结果一致，其采用酸水解法和酶水解法分别从酿酒高粱中检出21种、38种结合态风味物质，其中，醛类物质为主要香气成分。其中，LLE结合GC-MS法检出的挥发性风味物质更多，因此，对该方法的挥发性风味成分进行分析。
图1 3种前处理方法结合GC-MS检测高粱挥发性风味物质的总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of volatile flavor substances in sorghum detected by 3 pretreatment methods combined with GC-MS
2.2 酿酒高粱挥发性风味物质分析
通过LLE结合GC-MS法测得的酿酒高粱挥发性风味化合物共37种，其中，醛类15种、酮类4种、醇类8种、酯类6种、环类3种、酸类1种。本方法的检测结果多于ZANAN R等[22]检测高粱的挥发性风味物质种类。醛类物质种类较多，是酿酒高粱香气的含量较为丰富的化合物，其含量占总挥发性风味物质含量的62.14%，而酮类、醇类、酯类等物质的含量较低。
表1 酿酒高粱挥发性风味化合物的含量
Table 1 Contents of volatile flavor substances in brewing sorghum
种类 化合物 保留指数 香气特征[23-25] 相对含量/%己醛辛醛2-庚烯醛壬醛2-辛烯醛（E,E）-2,4-庚二烯醛癸醛苯甲醛（E）-2-壬烯醛（Z）-2-癸烯醛2-丁基-2-辛烯醛（E,E）-2,4-壬二烯醛2-十一烯醛（E,E）-2,4-癸二烯醛（E,E）-2,4-十二烯醛小计1-辛烯-3-酮3-辛烯-2-酮（Z,E）-3,5-辛二烯-2-酮6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮醛类1 085 1 302 1 343 1 404 1 417 1 479 1 509 1 547 1 551 1 660 1 685 1 724 1 761 1 785 1 855青草味水果味脂肪味青草味脂肪味青草味青草味苦杏仁味青草味脂肪味脂肪味脂肪味果香味香橙味脂肪味酮类1 306 1 422 1 536 1 587蘑菇味蘑菇味青草味青草味醇类小计戊醇己醇1-辛烯-3-醇庚醇辛醇2-辛烯-1-醇壬醇苯乙醇小计1 266 1 361 1 451 1 460 1 560 1 620 1 648 1 939面包味青草味蘑菇味果香味玫瑰花味蘑菇味玫瑰味花香味16.08 3.19 19.71 3.62 0.92 0.36 1.50 0.30 2.21 8.57 1.08 0.93 1.01 0.98 1.68 62.14 5.00 0.81 0.34 1.74 7.89 0.99 1.53 3.46 0.73 2.47 0.56 0.86 0.24 10.84
续表
种类 化合物 保留指数 香气特征[23-25] 相对含量/%酯类1 202 1 499 1 532 2 071 2 212 2 250果香味甜香味果香味椰奶味脂肪味脂肪味环类1 250 1 929 1 971果香味甜香味蔬菜坚果味酸类己酸甲酯壬酸甲酯壬酸乙酯γ-壬内酯十六酸甲酯十六酸乙酯小计2-戊基呋喃对二乙氧基苯苯并噻唑小计己酸小计1 853汗臭味5.68 1.12 0.82 1.25 0.29 0.60 9.76 6.04 0.56 1.00 7.60 0.77 0.77
在醛类化合物中，己醛和2-庚烯醛相对含量较高，分别为16.08%和19.71%。己醛、辛醛等饱和脂肪醛具有青草香和水果香等香气特征，而2-庚烯醛、2-辛烯醛和（E,E）-2,4-壬二烯醛等不饱和脂肪醛具有脂肪的香气。在酿酒高粱中检测到的芳香醛类化合物为苯甲醛，具有苦杏仁味，相对含量为0.3%，陈双等[26]检测到苯甲醛在熟高粱的香气成分中的相对含量为20.21%，可能是由于高粱在加热蒸煮过程中会加速氧化反应的发生。这些醛类化合物也在白酒中被检测到[27]，表明酿酒高粱中醛类化合物可以通过白酒特有的生产工艺带入到酒体中，从而增加白酒的风味。壬醛的相对含量3.62%，（阈值122.45 μg/L[28]），被认为是对“粮香”有贡献的重要风味化合物[17]。
本研究共检出4种酮类化合物，占总含量的7.89%，分别为1-辛烯-3-酮（5.00%）、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮（1.74%）、3-辛烯-2-酮（0.81%）、（Z,E）-3,5-辛二烯-2-酮（0.34%）。其中1-辛烯-3-酮含量较高，相对含量为5.00%，辛茜等[29]在白酒中检测到该化合物，具有典型的蘑菇香味[30]。6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮为生粮香的[2]特征化合物，尤宇漫等[31]在白酒中检测到，被认为是馥郁香白酒中重要的香气化合物。
本研究检测到的醇类化合物中主要包括戊醇、己醇等饱和脂肪醇，其呈花香和果香。在白酒中，醇类化合物的含量和种类都比较丰富[26]，属于醇甜和助香剂的主要物质来源，对形成酒的风味和促使酒体丰满、浓厚起着重要作用[32]。本研究在酿酒高粱中只检测到8种醇类化合物，占总含量的10.84%，其中相对含量较高的是1-辛烯-3-醇（3.46%）。1-辛烯-3-醇俗称松覃醇、蘑菇醇，具有蘑菇香味，阈值较低（阈值为6.12 μg/L[28]），刘家欢等[33]认为酱香型白酒中1-辛烯-3-醇与乙醛、己醛等醛类物质呈正相关，检测到的芳香醇是苯乙醇，相对含量为0.24%，具有清甜的玫瑰花香。
6种酯类化合物分别为己酸甲酯（5.68%）、壬酸甲酯（1.12%）、壬酸乙酯（0.82%）、γ-壬内酯（1.25%）、十六酸甲酯（0.29%）和十六酸乙酯（0.6%），占总含量的9.76%，其中低碳链的酯类化合物主要呈现青草香和花果香，而高碳链的酯类化合物则具有脂肪味，如十六酸乙酯。检测到的内酯化合物为γ-壬内酯，这是一类重要的呈香化合物，留香时间长，有增香的作用[34]。γ-壬内酯具有椰奶香，阈值较低（阈值为90.66 μg/L[28]），对浓香型白酒的风味贡献较大。
此外，本研究还检测到2种杂环化合物、1种芳香化合物和1种酸类化合物。分别是2-戊基呋喃（6.04%）、苯并噻唑（1.0%）、对二乙氧基苯（0.56%）和己酸（0.77%）。2-戊基呋喃具有果香，在熟高粱和成品酒中都被检出。己酸在白酒中含量较高，是重要的风味成分之一，具有汗臭味。酸类物质是影响白酒的口感和后味的主要因素，也是白酒香气的重要协调成分，适量的酸有助于酒体的放香[33]。
3 结论
本研究通过比较不同的前处理方式对酿酒高粱香气成分的提取效果发现，采用液液萃取结合GC-MS检测出高粱挥发性风味物质最多，为37种，包括醛类15种，酮类4种，醇类8种，酯类6种，环状化合物3种，酸类1种。醛类是酿酒高粱香气中含量较为丰富的化合物，其相对含量占总香气含量的62.14%。该方法能更加有效地提取到酿酒高粱中的风味组分，为白酒中香气成分的研究奠定基础。
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