瓜蒌薤白汤又名瓜蒌薤白白酒汤，是中医治疗胸痹之症的经典方剂。该方始载于汉代张仲景所著《金匮要略》[1]，由瓜蒌、薤白和白酒等原料组成，主要含有黄酮、甾醇、皂苷、多糖、有机酸等活性物质[2-5]，具有抗氧化、抗血小板聚集、祛痰、抗炎、降脂和抗动脉粥样硬化等药理活性[6-7]。瓜蒌薤白汤的临床应用历史长，安全性高，而且本身具有“以酒入方”的特点，有进一步开发为保健酒的潜力。
保健酒是以蒸馏酒、发酵酒或食用酒精为基酒，加入符合国家有关规定的原料、辅料或食品添加剂，经注册或备案，并声称具有保健功能的饮料酒[8]。其适用于特定人群食用，具有调节机体的功能，但不以治疗为目的，并且对人体不产生任何急性、亚急性或慢性危害[9]。保健酒的制备过程一般涉及提取、调配、澄清等环节，其中提取工艺的优劣直接关系到能否高效获得有效成分群[10]，并最终影响产品的有效性和稳定性[11]。渗漉法是将适度粉碎的药材置渗漉筒中，由上部不断添加溶剂，利用溶剂渗过药材层向下流动的过程，浸出药材成分的方法，该方法具有溶剂利用率高、有效成分浸出完全、无需高温加热等特点，被广泛应用于黄酮类、丹参酮类、总生物碱、总皂苷等活性物质的提取[12]。利用渗漉法对银杏叶中银杏酸的回收率高于85%，且不会破坏热不稳定性物质，如黄酮、内脂类成分[13]。近年来，渗漉法也常常用于保健酒的制备，如李薪宇等[14]在采用渗漉法制备的复方金钗石斛保健酒中石斛含量、总黄酮含量、浸膏得率及感官评分分别为183.37 mg/L、219.74 mg/L、24.81%、75分。李幼娟等[15]研究结果表明，在最佳条件下制备的天麻酒中羟基苯甲醇、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的溶出率之和为3.59 mg/g。目前还没有关于瓜蒌薤白保健酒制备的相关研究报道。
本研究以瓜蒌和薤白为原料，采用渗漉法制备瓜蒌薤白保健酒，以总黄酮含量及浸出率为评价指标，通过单因素和正交试验对渗漉工艺进行优化，采用感官评价法确定其最佳调配工艺，并对其抗氧化活性进行分析。以期建立瓜蒌薤白保健酒的最佳制备工艺，初步评价其抗氧化活性，可为瓜蒌薤白保健酒的后期商业化开发利用提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
瓜蒌、薤白：亳州市京皖中药饮片厂，符合《中国药典》的执行标准；芦丁标准品（纯度＞98%）：国药集团化学试剂有限公司；1,1二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）：上海麦克林生化科技股份有限公司；95%vol食用酒精：河南鑫河阳酒精有限公司；甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、过氧化氢（均为分析纯）：成都科隆化学品有限公司；过硫酸钾、硫酸亚铁（分析纯）：天津福晨化学试剂有限公司；三氯化铁、水杨酸、三氯乙酸（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；铁氰化钾（分析纯）：天津市津东天正精细化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
SUS304中药材粉碎机：永康市利阳电器有限公司；HH-2水浴锅：常州智博瑞仪器制造有限公司；N5000/N5000Plus紫外分光光度计、FA2204B电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；101-3B电热恒温干燥箱：浙江力辰仪器科技有限公司；渗漉装置：江苏荣力普科学仪器有限公司；DL-1电磁炉：北京中兴伟业世纪仪器有限公司；TG16高速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；TSQ8000气相色谱质谱联用仪：赛默飞世尔科技公司。
1.3 试验方法
1.3.1 瓜蒌薤白保健酒的加工工艺流程及操作要点
瓜蒌、薤白→烘干→打粉→浸渍→渗漉→浓缩→调配→成品
原料预处理：将瓜蒌、薤白105 ℃烘干至恒质量，粉碎过24目筛，按瓜蒌∶薤白质量比（3∶2）混合。
浸渍：按照混合原料∶食用酒精=1∶2（g∶mL）料液比加入40%vol的食用酒精，在室温条件下浸润24 h。
渗漉：以5 mL/min的流速渗漉至料液比为1∶10（g∶mL），收集渗漉液。
浓缩、调配：用旋蒸减压方式浓缩提取液，取一定量蔗糖，以少量蒸馏水溶解后加入浓缩液，使用清香型白酒配（52%vol）和蒸馏水进行调配，即得瓜蒌薤白保健酒成品。
1.3.2 渗漉工艺优化
（1）单因素试验
分别考察料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g∶mL）），渗漉速度（1 mL/min、3 mL/min、5 mL/min、7 mL/min、9 mL/min），酒精度（20%vol、30%vol、40%vol、50%vol、60%vol），浸渍时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）对总黄酮含量和浸出物浸出率的影响。
（2）正交试验
在单因素试验结果的基础上，以料液比（A）、渗漉速度（B）、酒精度（C）、浸渍时间（D）为影响因素，以总黄酮含量和浸出率为考察指标，采用L9（34）正交试验设计优化其提取工艺条件，渗漉工艺优化正交试验设计因素与水平见表1。
表1 渗漉工艺优化正交试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments design for percolation process optimization
水平因素A 料液比（g∶mL）B 渗漉速度/（mL·min-1）C 酒精度/%vol D 浸渍时间/h 123 1∶10 1∶12 1∶14 135 40 50 60 12 24 36
1.3.3 瓜蒌薤白保健酒调配工艺优化
选择基酒类型、酒精度和糖度对瓜蒌薤白保健酒进行调配工艺试验，选择9名感官评鉴人员对调配后的样品进行品评，以感官评分为评价指标。其中，基酒类型为：清香型、浓香型、酱香型；酒精度（28%vol、30%vol、32%vol、34%vol、36%vol、38%vol）；糖度（2%、4%、6%、8%、10%）。
1.3.4 理化指标的测定
（1）总黄酮含量的测定
参考龚频等[16]的方法，采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮含量。精密称取芦丁对照品适量，无水乙醇溶解，配制成0.48 mg/mL芦丁对照品溶液。精密吸取芦丁对照品系列浓度于25 mL容量瓶，加入1 mL质量分数为5%的NaNO2溶液和1 mL质量分数为10%的Al（NO3）3溶液，反应6 min，无水乙醇定容，测定波长510 nm处吸光度值，绘制标准曲线，获得芦丁标准曲线回归方程Y=0.059 1X+0.556（相关系数R2=0.993）。吸取瓜蒌薤白保健酒样品1 mL于25 mL试管中，按上述步骤测定样品吸光度值，计算总黄酮含量。
（2）浸出率的测定
参考梁正维等[17]的方法，吸取各样品20 mL于蒸发皿中，置水浴锅上蒸干，随后105 ℃烘干至恒质量，冷却后称量，计算浸出率，计算公式如下：
式中：m1为最后称得的总质量，g；m2为蒸发皿的质量，g；m为瓜蒌、薤白的质量，g。
1.3.5 感官评价
选取经感官训练的专业人员，从外观、色泽、香气、口感、回味5个方面对瓜蒌薤白保健酒进行感官评价，参考GB/T 27588—2011《露酒》[18]、T/CBJ 5102—2019《保健酒》[9]，结合供试产品特点，建立瓜蒌薤白保健酒的感官评分标准，见表2。
表2 瓜蒌薤白保健酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Gualou Xiebai health wine
项目 评价标准 评分/分外观（20分）色泽（20分）香气（20分）口感（20分）回味（20分）无悬浮物，清澈透亮，有光泽有少许沉淀或悬浮物，较清亮透明不清亮，稍显浑浊颜色纯正，清亮透明颜色稍偏淡颜色寡淡酒香和药香香味浓郁，诸香和谐香味不突出或香味单一香味不协调或几乎无药香味层次丰富，口感醇美厚重口感较舒适，酒体完整口感一般，酒味平淡回味微苦，余味干净爽快回味微苦，余味较短苦涩辛辣味重，余味杂15～20 8～14 0～7 15～20 8～14 0～7 15～20 8～14 0～7 15～20 8～14 0～7 15～20 8～14 0～7
1.3.6 工艺稳定性评价
选取5批瓜蒌薤白保健酒样品溶液，编号为S1-S5。采用TSQ8000气相色谱-质谱联用仪考察瓜蒌薤白保健酒生产工艺稳定性。气相色谱条件为TG-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温方式：初始温度40 ℃保持3 min，然后以10 ℃/min升至230 ℃保持10 min；进样口温度250 ℃，采用分流进样方式，进样量为1 μL；载气为高纯氦气（He），流速1 mL/min。质谱条件：离子化方式为电子电离（electron ionization，EI）源；传输线温度260 ℃；离子源温度280 ℃；电子能量为70 eV，质量扫描范围为30～550 amu。获得样品S1～S5总离子流图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件进行数据处理，生成叠加指纹图谱，并得到瓜蒌薤白保健酒指纹图谱相似度[19]。
1.3.7 抗氧化活性测定
（1）DPPH·清除率的测定
参考只德贤等[20]的方法并略做修改，分别吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL供试保健酒样品于试管中，用蒸馏水补至2 mL，再加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，混匀，避光静置30 min，于波长517 nm处检测吸光度值（Ai）。同时测定相同添加量的无水乙醇代替DPPH溶液的吸光度值（Aj）及以无水乙醇和DPPH溶液各2 mL混合后的吸光度值（A0），其计算公式如下：
（2）羟基自由基清除率的测定
参考YANG H等[21]的方法，吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL供试保健酒样品于试管中，加入6 mmol/LFeSO4溶液2mL和30%的H2O2溶液2mL，混合均匀，再加入6 mmol/L水杨酸溶液2 mL，摇匀，避光反应30 min，于波长510 nm处测定吸光度值，记为（A1）。以蒸馏水代替待测液作为空白对照组，测定其吸光度值（A0），以蒸馏水代替水杨酸，测得其吸光度值为A2。羟基自由基清除率计算公式如下：
（3）ABTS+自由基清除率的测定
参考孙悦等[22]的方法，吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL供试保健酒样品试管中，用蒸馏水补至2 mL，与2 mL ABTS溶液混合，室温静置30 min，以无水乙醇为参比，测定波长734 nm处的吸光度值（Ai）。以蒸馏水代替待测液作为空白对照，测定其吸光度值（A0）。ABTS+自由基清除率计算公式如下：
（4）总还原能力的测定
参考LUO Q Y等[23]的方法并稍作修改，吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL供试保健酒样品于试管中，用蒸馏水补至2 mL，加入1%的K3[Fe（CN）6]溶液2.5 mL，振荡混匀，50 ℃条件下反应20 min后用10%三氯乙酸终止反应，再向试管中加入0.1%FeCl3溶液0.5 mL静置显色10 min，在波长700 nm处测定吸光度值。以吸光度值反映总还原能力，其值越大，抗氧化活性越强。
1.3.8 数据处理
采用Microsoft Office Excel 2021记录及整理试验数据，利用IBM SPSS Statistics 22.0软件对数据进行差异显著性分析，使用Origin 2020进行图形绘制。每组试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 瓜蒌薤白保健酒渗漉工艺条件优化
2.1.1 单因素试验结果
由图1a可知，随着浸提溶液的增加，瓜蒌薤白的总黄酮含量以及浸出率逐渐增大；当料液比为1∶12（g∶mL）时，总黄酮含量以及浸出率达到最大值，分别为173.13 μg/mL和1.10%，其原因可能是，增加溶剂能够提高细胞内和溶剂之间的浓度差，促进有效物质更多、更快地溶出，当溶剂用量继续增加时，活性物质达到饱和，甚至造成其他杂质成分的更多溶出（如蛋白质等），从而降低活性物质的提取率[24]。因此，确定最佳料液比为1∶12（g∶mL）。
图1 料液比（a）、渗漉速度（b）、酒精度（c）和浸渍时间（d）对瓜蒌薤白保健酒总黄酮含量和浸出率的影响
Fig.1 Effects of material and liquid ratio (a), percolation rate (b),alcohol content (c) and maceration time (d) on the total flavonoids contents and extraction rates of Gualou Xiebai health wine
不同字母代表差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1b可知，随着渗滤速度的增加，瓜蒌薤白保健酒中的总黄酮含量和浸出率呈现先增加后减少的趋势。当渗漉速度为3 mL/min时，总黄酮含量达到最大值，为182.18 μg/mL，显著高于其他组（P＜0.05），此时，浸出率为0.76%。当渗漉速度为5 mL/min时，浸出率达到最大值，但考虑到总黄酮含量为瓜蒌薤白保健酒的主要有效成分，其优先考虑性高于浸出率。因此，确定最佳渗漉速度为3 mL/min。
由图1c可知，随着酒精度在20%vol～60%vol范围内的增加，总黄酮含量和浸出率呈现上升的趋势；当酒精度为50%vol时，总黄酮含量和浸出率分别为184.43 μg/mL和1.14%；当酒精度＞50%vol时，增加酒精度对瓜蒌薤白总黄酮含量并无显著影响，但仍可以提高浸出率，然而酒精度过高不利于一些水溶性活性物质的溶解，如皂苷类等[25]。因此，确定最佳酒精度为50%vol。
由图1d可知，随浸渍时间增加，瓜蒌薤白保健酒中总黄酮含量及浸出率而呈现先增加后降低的变化规律；当浸渍时间为24 h时，其含量达到最大值，分别为174.12 μg/mL和1.27%。当药材和溶剂充分接触后，活性物质得以充分溶出，达到平衡，延长浸渍时间并不能提高活性物质的溶出[26]。因此，确定最佳浸渍时间为24 h。
2.1.2 正交试验
在单因素试验结果基础上，以料液比（A）、渗漉速度（B）、酒精度（C）、浸渍时间（D）4个因素作为考察对象，以总黄酮含量和浸出率为考察指标，采用正交试验设计优化渗漉工艺条件，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 渗漉工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for percolation process optimization
试验号 A B C D 总黄酮含量/（μg·mL-1）浸出率/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1 145.09 163.07 154.61 141.50 153.98 156.09 182.32 154.69 149.54 1.46 1.57 1.69 1.69 1.80 1.49 2.08 1.73 1.64总黄酮含量k1 k2 k3R k1浸出率k2 k3R 154.26 150.52 162.18 11.66 1.57 1.66 1.82 0.25 156.30 157.25 153.41 3.84 1.74 1.70 1.61 0.13 151.96 151.37 163.64 12.27 1.56 1.63 1.86 0.30 149.54 167.16 150.27 17.62 1.63 1.71 1.70 0.08
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
指标 方差来源平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性总黄酮3.867 0.435 5.221 10.847 0.061 0.660 0.031 0.004***浸出率液料比渗漉速度酒精度浸渍时间误差液料比渗漉速度酒精度浸渍时间误差425.292 47.873 574.242 1 193.014 494.917 0.184 0.061 0.285 0.023 0.037 2 2 2 2 8 2 2 2 2 8 212.646 23.936 287.121 596.507 54.991 0.092 0.031 0.143 0.011 0.004 22.445 7.465 34.721 2.777＜0.001 0.012＜0.001 0.115*****
由表3可知，由极值R可知，影响瓜蒌薤白保健酒总黄酮含量的因素依次为浸渍时间＞酒精度＞料液比＞渗漉速度，理想最优组合为A3B2C3D2；影响瓜蒌薤白保健酒浸出率因素依次为酒精度＞料液比＞渗漉速度＞浸渍时间，理想最优组合为A3B1C3D2。由表4可知，渗漉速度对总黄酮含量没有显著影响（P＞0.05）。由于考虑到渗漉速度对总黄酮含量影响不显著，而总黄酮作为瓜蒌薤白保健酒主要的有效成分，其优先考虑性高于浸出率这一指标，且在总黄酮含量变化不大的情况下，可适当加大渗漉速度，可加快提取的时间，创造更多的经济收益。因此，理论最佳组合A3B2C3D2为瓜蒌薤白保健酒渗漉工艺的最佳条件，即料液比1∶14（g∶mL），渗漉速度3 mL/min，酒精度60%vol，浸渍时间24 h。将所得最佳组合A3B2C3D2进行验证，测得瓜蒌薤白保健酒总黄酮含量和浸出率分别为179.63 μg/mL和1.92%，与表3正交试验结果中的最大值无显著差异（P＞0.05）。
2.2 调配工艺优化
2.2.1 基酒类型对瓜蒌薤白保健酒感官评分的影响
由图2可知，清香型、浓香型和酱香型基酒所制备的瓜蒌薤白保健酒的感官评分无显著差异（P＞0.05）。由于清香型酒口感纯净[26]，以之为基酒更有利保留瓜蒌和薤白的药香味，使瓜蒌薤白保健酒香味更协调。因此，确定基酒类型为清香型。
图2 基酒类型对瓜蒌薤白保健酒感官评分的影响
Fig.2 Effect of base liquor types on the sensory scores of Gualou Xiebai health wine
2.2.2 酒精度对瓜蒌薤白保健酒感官评分的影响
由图3可知，随酒精度的逐渐增加，感官评分呈先升高后下降的趋势，当酒精度为36%vol时，瓜蒌薤白保健酒的感官评分最高，为70.67分。其原因可能是过高的酒精度会导致辣味、刺激感增强，致使感官评分降低[27]，而当酒精度过低时，会使其酒味平淡，影响口感，而酒体自带的一些香气物质和有效物质难溶于水，导致保健酒酒体出现浑浊、产生失光等现象[28]。因此，确定最佳酒精度为36%vol。
图3 酒精度对瓜蒌薤白保健酒感官评分的影响
Fig.3 Effect of alcohol content on the sensory scores of Gualou Xiebai health wine
2.2.3 糖度对瓜蒌薤白保健酒感官评分的影响
由图4可知，随着糖度的增加，瓜蒌薤白保健酒的感官评分呈先上升后下降的趋势，当糖度为8%时，感官评分达到最大值，为75分，瓜蒌、薤白均是带苦味的药材，糖度过低，导致苦味较重，而糖量过大使得保健酒甜腻，影响回味和口感[29]。因此，确定最佳糖度为8%。
图4 糖度对瓜蒌薤白保健酒感官评分的影响
Fig.4 Effect of sugar content on the sensory scores of Gualou Xiebai health wine
2.3 瓜蒌薤白保健酒制备工艺稳定性
瓜蒌薤白保健酒叠加色谱图见图5。由图5可知，共确定了25个共有峰。以样品S1对照指纹图谱为参照，对5批瓜蒌薤白保健酒的指纹图谱进行相似度评价，结果见表5。由表5可知，与对照指纹图谱相比，样品S2～S5相似度为0.927～0.950，相似度均＞0.9，符合指纹图谱的要求[30]。结果表明，本研究所制备的不同批次瓜蒌薤白保健酒的整体质量较为接近，制备工艺稳定性较好。
图5 瓜蒌薤白保健酒色谱图
Fig.5 Chromatogram of Gualou Xiebai health wine
图6 不同保健酒的DPPH（a）、羟基（b）、ABTS+（c）自由基清除率和总还原能力（d）
Fig.6 DPPH (a), hydroxyl (b), ABTS+(c) radicals scavenging rates and total reducing ability (d) of different health wines
小写字母表示不同添加量下，同种保健酒的抗氧化活性差异显著（P＜0.05）；大写字母表示相同添加量下，不同保健酒的抗氧化活性
差异显著（P＜0.05）。
表5 瓜蒌薤白保健酒指纹图谱的相似度
Table 5 Similarity of fingerprint of Gualou Xiebai health wine
批号 S1 S2 S3 S4 S5 S1 S2 S3 S4 S5 1.000 0.927 0.950 0.927 0.947 0.927 1.000 0.927 0.929 0.939 0.950 0.927 1.000 0.935 0.950 0.927 0.929 0.935 1.000 0.947 0.947 0.939 0.950 0.947 1.000
2.4 瓜蒌薤白保健酒抗氧化活性的测定
随着瓜蒌薤白保健酒、单瓜蒌保健酒和单薤白保健酒添加量的增加，各保健酒的抗氧化活性呈上升趋势，其中瓜蒌薤白保健酒对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS+自由基的清除率和总还原能力均显著优于单瓜蒌和单薤白保健酒。当添加量为1.0 mL时，所制得的瓜蒌薤白保健酒的DPPH、ABTS+、羟基自由基清除率和总还原能力分别为90.32%、91.47%、91.53%和1.441，相较于单瓜蒌和单薤白保健酒，瓜蒌薤白保健酒对DPPH自由基清除率分别提高了12.98%和56.38%，羟基自由基清除率分别提高了2.10%和22.52%，ABTS+自由基清除率分别提高了9.40%和48.90%，总还原能力分别提高了19.92%和85.77%。可见，瓜蒌和薤白两者配伍时具有协同作用[31]，可增加其活性物质[32]，从而提高瓜蒌薤白保健酒的抗氧化活性。相较于某市售保健酒，瓜蒌薤白保健酒的羟基自由基清除率和总还原能力分别提高了33.90%和53.57%，而DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力与某市售保健酒无显著性差异（P＞0.05）。综上所述，瓜蒌薤白保健酒具有较好的抗氧化活性。
3 结论
本研究确定瓜蒌薤白保健酒的最佳渗漉工艺条件为：液料比1∶14（g∶mL），渗漉速度3 mL/min，酒精度60%vol，浸渍时间24 h；在该工艺条件下，筛选出最佳调配工艺为：基酒类型为清香型，酒精度为36%vol、糖度为8%，指纹图谱相似度＞0.9。抗氧化分析结果表明，当瓜蒌薤白保健酒添加量为1 mL时，对DPPH·的清除率为90.32%，对·OH的清除率为91.53%，对ABTS+的清除率为91.47%，总还原能力为1.441，可见瓜蒌薤白保健酒具有较强的抗氧化活性。综上所述，本研究所确定的瓜蒌薤白保健酒制备工艺高效稳定，所制备的瓜蒌薤白保健酒抗氧化能力较好，具有较高的开发潜力。
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