拉曼光谱分析技术基于1928年分别由印度科学家RAMAN及前苏联科学家LANDSBERG和MANDELSTAM发现的拉曼散射效应[1]。光产生拉曼散射的原因是入射光子与构成物质的原子基团与化学键相互碰撞，导致散射光与入射光频率发生较大变化。不同物质所具有的原子团和化学键不同，光子与其碰撞产生的能量变化也不同。通过光电传感器收集这些能量发生变化的光子，可以绘制物质的拉曼光谱图[2-3]。使用计算机对收集到的拉曼光谱图进行处理和分析，可以获得混合物质中所含有的组分、分子振动与能级的信息[4]。拉曼光谱分析技术被广泛地应用于生物学[5-7]、农业[8]、食品与轻工业[9-13]等领域的物质分析实践中。
本文简单介绍了拉曼光谱在微生物细胞分析中的优势，主要总结了其在真菌（酵母、动植物病原真菌）、细菌（产芽孢细菌、病原细菌）和微藻细胞研究中的应用，并对拉曼光谱分析技术的发展前景进行展望，旨在概括拉曼光谱分析技术作为一种光学新技术的应用范围，为微生物代谢动态分析研究提供新的思路。
微生物（microorganism）是一类生物的统称，主要包括细菌、真菌、微藻，以及放线菌、病毒、支原体、衣原体和其他异养或自养原生生物等[14-15]，其多数由单细胞构成，个体微小，很难直接观察其生命活动。为了揭示微生物细胞活性分子在其生命活动中的变化过程，尤其是基因组在时间和空间上的表达、生物大分子装配成细胞器、细胞内部和外部的信号调控细胞生理活动等细胞代谢动态的基本问题[16-17]，需要一种快速、无损的分析手段，在对微生物生命活动影响最小的前提下，获得细胞的生命活动状态信息。传统的微生物分析方法需要对微生物进行预培养、杀死微生物细胞进行固定染色并镜检[18]；或通过聚合酶链式反应、基因芯片、组学分析等分子生物学研究手段对微生物群体进行异质性和转录表达等研究[19-21]。这些传统的分析方法耗时久、成本高，且无法获得微生物活细胞的代谢动态信息。而拉曼光谱可以实现实时、无损地分析活细胞，掌握活细胞的代谢特点。使用拉曼光谱分析完成后的生物样品并没有受到破坏，还可以继续用于其他生理生化研究[22-23]，极大地节约科研的时间、经济成本。因此，拉曼光谱作为一种高效的分析工具，在微生物的科研实践中运用广泛。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种模式微生物，也是现代发酵工业中被广泛应用的生物反应器，与人类的生产活动关系密切[24-27]。为了更深入地研究和利用酵母、开发其科研与生产潜力，需要实时监测其单细胞生命活动，以便更有效地掌握其细胞内分子代谢状态。
激光光镊拉曼光谱（laser tweezers Raman spectroscopy，LTRS）结合了拉曼光谱与光镊技术的特点，在监测动态发酵过程中酵母细胞代谢特点中具有独特优势，其作用原理是由多束近红外波长激光的光压[28]构建一个光阱，捕获并将待分析的细胞样本长时间禁锢在三维空间内相对固定的位置，且不对细胞产生伤害，而激光束同时激发样品的拉曼光谱，获得一段时间内细胞代谢的拉曼光谱数据，同时优化传感器收集拉曼散射光路的途径，可以显著提高所获拉曼光谱图像的信噪比，获得更准确的分析结果[29]。
XIE C等[30]以聚苯乙烯微粒小球作为对照参考，使用LTRS捕获活的人血细胞、活酵母细胞和死亡酵母细胞并对其进行拉曼光谱图像分析，结果表明，LTRS可以高灵敏、高精度地监测单个细胞的生活状况、生理生化特点，为酵母单细胞差异的研究提供了技术基础。赖钧灼等[31]采用LTRS对酵母产乙醇的动态过程进行检测，分别收集了酵母细胞内的核酸、蛋白质等生物大分子和葡萄糖、乙醇的特征拉曼信号并对其进行分析，结果表明，LTRS可以有效地监测接入发酵培养基后的酵母细胞的线粒体呼吸水平变化强度、葡萄糖消耗与乙醇产生速率、蛋白质二级结构变化的生理指标。欧海声等[32]利用LTRS采集了三个不同酵母菌株在乙醇发酵过程中的不同时段的单细胞拉曼光谱，并利用多元曲线分辨-交替最小二乘法（multivariate curve resolution-alternating least squares，MCR-ALS）分析发酵过程中三株酵母菌的乙醇发酵性能差异，并证明了LTRS与MCR-ALS的结合可以用在生产应用中快速分析酵母细胞在发酵过程中代谢水平的变化、代谢产物和外部环境对细胞发酵性能的影响。上述研究结果表明，LTRS能够长时间实时稳定地监测酵母细胞的动态发酵过程，及时便捷地获取细胞代谢的信息，在利用酵母生产乙醇的生产实践中具有广阔的应用前景。
胁迫（stress）是指外界不利的环境对细胞生长造成的负面影响。酵母细胞作为生物反应器发酵生产的过程中，容易受高温、高渗透压、氧化应激反应等负面影响的胁迫[33]。而LTRS的实时性特点可以用于分析胁迫过程中酵母细胞的生理生化动态，从而进一步避免胁迫对细胞的负面影响，同时根据胁迫期间的细胞代谢特点优化工艺流程。SINGHG P等[34]利用LTRS分别获取了热胁迫、高渗透压胁迫和正常培养条件下的酵母细胞的拉曼光谱图像。结果表明，在胁迫条件下，酵母细胞内的甘油和乙醇含量均会增加，这有利于了解酵母细胞在胁迫环境下的抗逆机制。本研究团队分别采集高浓度蔗糖乙醇发酵48 h（此时乙醇含量最高）的工业酿酒酵母原始高产酵母细胞[35]（已用于企业年产50 000 t甘蔗糖蜜乙醇）和突变株细胞（产酒精性能比原始菌株优良）的拉曼信号，结果表明，突变株的海藻糖拉曼光谱（849 cm-1或1 081 cm-1）比原始菌株高，高浓度酒精对酵母细胞有损伤甚至杀死细胞，而海藻糖对细胞具有一定保护作用。因此，拉曼光谱分析技术的高效性可以为建立高通量选育优良酵母提供理论依据。
许多真菌会侵染植物或动物，造成动植物病害，严重影响农业生产甚至危害人类健康。因此，对病原真菌进行快速的分类鉴定、掌握其代谢特点有助于对动植物病害开展针对性的防治措施，拉曼光谱分析技术的特性有助于研究者快速掌握病原真菌的分类和代谢特点。拉曼光谱在家蚕微孢子虫（Nosemabombycis，Nb）和炭疽菌（Colletotrichum spp.）这两类病原真菌防治研究中的应用如下。
Nb是一种细胞内专性寄生的真菌病原体，其侵染家蚕会导致家蚕微粒子病。由于其专性寄生的特性，难以分离培养，因此针对家蚕微粒子病防治的研究长期难以开展[36-37]。而使用拉曼光谱分析技术的免培养性，可以直接分析家蚕微孢子虫的代谢特点，以根据这些特点采取有效手段防治家蚕微粒子病。张宇等[38-39]使用LTRS无接触、免培养地在单细胞水平上分析不同消毒剂处理的家蚕微孢子虫的拉曼光谱，结果表明，次氯酸钙（漂白粉的有效成分）会造成Nb孢子破裂，海藻糖、蛋白质和核酸的拉曼特征峰减弱或消失，从而使Nb孢子无法发芽；二氧化氯进入Nb孢子内部后，蛋白质α螺旋结构的拉曼特征峰明显减弱，肽键无规则折叠的拉曼峰增强，导致Nb孢子的蛋白质错误折叠，从而使孢子无法进行正常生命活动；而经过甲醛处理后的Nb孢子各物质的表征拉曼峰虽然没有发生变化，但孢子的发芽率明显降低，其中的分子作用机制仍有待深入研究。MIAO Z B等[40]使用LTRS分析了甲醛和戊二醛2种醛类消毒剂对Nb发芽的影响，结果表明，甲醛和戊二醛的醛基与蛋白质结合的特征峰增加。因此，醛类消毒剂抑制Nb发芽的主要机制是通过醛基与孢子细胞壁蛋白发生作用，导致孢子细胞壁蛋白成分发生交联从而抑制孢子的发芽。
炭疽菌这一类病原真菌会导致橡胶树炭疽病，染病的橡胶树叶片和果实腐烂，产胶量下降，造成经济损失[41]。而橡胶树炭疽病主要由多种炭疽菌形成的复合菌群所引起，使橡胶树炭疽病的病原体分类和鉴定工作较为困难，难以在农业生产实践中针对性地开展防治工作[42]，因此需要一种高效的手段分类鉴定导致橡胶树炭疽病产生的炭疽菌株类型，以及时采取针对性的防治措施，减少损失。徐鑫泽等[43]使用共聚焦显微拉曼技术（confocal Raman spectroscopy，CRS）基于1 005 cm-1、1 155 cm-1和1 515 cm-1 3个主要的特征拉曼峰结合主成分分析（principal component analysis，PCA）实现了快速区分热带炭疽菌（Colletotrichum tropicale）菌株HN15、暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）菌株HN08、尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）菌株HN02的孢子。因此，拉曼光谱分析技术在病原真菌防治中具有重要作用。
芽孢是产芽孢细菌在恶劣环境下生成的休眠体，具有很强的抗逆性，处于合适的条件下芽孢可以萌发为具有完整生命活动的细菌[44-45]。一些产芽孢的细菌如肉毒梭菌（Clostridium botulinum）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和产气荚膜杆菌（Clostridium perfringen）会污染食物，造成食品安全问题；艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile）对物理化学消毒手段的抗性使医院内的交叉感染风险增加；被用于生物武器的炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）的芽孢会污染土壤和水源长达数十年且难以得到净化[46-49]，对人类生命健康造成威胁。另一些产芽孢细菌如苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种被广泛应用的生物杀虫剂，可以产生对昆虫有毒害作用的蛋白晶体[50]，由于其被人类发现和利用的历史较长，对人体无害，可以作为模式生物用于研究消毒剂对芽孢的作用机制。
MALYSHEV D等[51]使用二氧化氯、过氧乙酸和次氯酸钠几种常用的消毒剂处理Bt芽孢，利用LTRS观察消毒剂处理期间芽孢状态结果表明，二氧化氯处理组并没有监测到相应的拉曼光谱变化，过氧乙酸处理组的拉曼光谱显示脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）/吡啶二羧酸（dipicolinic acid，DPA）特征峰随处理时间的增加而下降，大约有20%左右的芽孢被过氧乙酸降解，而次氯酸钠处理组的拉曼光谱显示，在第20分钟，DNA/DPA峰突然下降，并且芽孢外膜也出现部分的结构性损伤，对芽孢的影响较为明显。这项研究对医学实践中的消毒剂和消毒时长的选择提供了一定的参考。
除上文提到的Bt是一种被广泛应用的生物杀虫剂外，球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus，Ls）也作为一种生物杀虫剂被广泛用于灭杀幼蚊。作为活的生物细胞制剂，其杀虫效果与芽孢萌发率、细胞存活率有关，而这两个因素又受到外界的许多物理化学因子影响。为了探究外部因素对Ls芽孢萌发的影响，获得更好的杀蚊效果，李翠梅[52]使用LTRS和差分干涉显微镜（differential interference contrast microscope，DIC）分析了紫外光照射、湿热处理、二氧化氯和戊二醛4种物理和化学因子抑制Ls芽孢萌发的作用机理，同时通过拉曼光谱分析了不同Ls菌株芽孢的萌发异质性。结果表明，使用相同萌发剂的不同菌株的芽孢萌发过程不一致，并且在不同萌发剂中相同菌株芽孢萌发过程也不完全一致。根据上述结果，可以推测造成Ls不同菌株萌发异质性的原因是不同菌株之间芽孢内吡啶二羧酸钙（Ca-pyridine dicarboxylic acid，CaPDA）含量有所差异，但芽孢的受体蛋白、通道蛋白和皮层水解酶的含量和活性差异也可能影响不同菌株的萌发异质性。上述研究表明拉曼光谱可以在分子水平上阐述消毒手段的抗性和逆境对芽孢萌发的影响，为人类深入认识产芽孢细菌提供了一定的参考。
形态学与分子生物学鉴定是微生物分类鉴定的常用方法，但传统的形态学与分子生物学鉴定方法步骤复杂，流程较长，花费时间较多，尤其是专性寄生的病原细菌、不可培养的病原细菌和多种细菌共同作用导致的复合型感染疾病，给医学临床微生物分类鉴定增加了困难。在医学临床治疗中，需要对感染的病原微生物进行快速鉴定、分类并开展有效的治疗措施，而传统的鉴定分类方法往往无法满足病原微生物鉴定的时效。因此，拉曼光谱的原位性分析有助于在医学实践中快速鉴定病原微生物[49，53-55]。
窦雪晨等[56]使用共聚焦显微拉曼光谱（CRS）技术建立了一种在单个细菌细胞水平上快速分析鉴定病原微生物的方法，通过大肠杆菌（Escherichia coli）优化了CRS的激光激发波长，并分析存放了不同时间的大肠杆菌、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的单个细菌细胞的拉曼光谱信息，并使用支持向量机（support vector machine，SVM）模型学习算法与获得的单细胞的拉曼光谱数据进行归属分析，结果表明，532 nm波长的激光激发单细胞拉曼光谱效率和信噪比相比起过去常用的633和785 nm这2个拉曼探测波长更好，SVM模型对5种不同细菌的单细胞拉曼光谱分析的整体准确率达98.25%，表明CRS结合SVM模型算法可以实现快速准确的微生物分类。
多种不同病原细菌侵入尿道会引发复合型的尿路感染，需要快速鉴定导致复合感染的病原菌革兰氏染色型以开展针对性的用药治疗[57]。DRAGOUNOVÁ K A等[58]使用拉曼光谱对复合型尿路感染患者的干燥尿液滴进行分析，并使用主成分分析（principal component analysis，PCA）和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）方法处理所获得的拉曼光谱数据，结果表明，PCA和LDA联用处理拉曼光谱数据对导致复合型尿路感染的病原细菌的革兰氏染色型的分析结果准确率达到75%以上。表明拉曼光谱技术可以在医学临床治疗上快速鉴定复合型感染的多种致病细菌的革兰氏染色型，为复合型感染提供用药指导。
微藻（microalgae）是一种广泛存在于海洋中的自养原生生物，生理学和生化特性多样，可以产生蛋白质、脂类、多糖、活性小分子物质及多种微量元素。与细菌和真菌等微生物相比，微藻作为生物资源的开发和利用潜力巨大，仍有待深入研究[59-60]。目前，我国已经建立起了全球首个微藻拉曼组数据库，该数据库可以实现简单操作、高度自动化、高通量和精确探测微藻细胞代谢表型组到基因组的全面信息，并且可以快速采集单个微藻细胞的拉曼光谱信息，以进行微藻种质资源的分析和筛选，该数据库的投入使用有利于微藻资源的深度开发与利用[61]。但微藻细胞难以扩大和富集培养、其生物反应器设计和开发困难、遗传背景过于简单而难以进行遗传操作成为了微藻资源得到深入开发利用的阻碍[62]。
微藻在重金属离子、高渗透压、低温、氮素等条件胁迫下会产生多种具有特殊功能的微藻多糖、脂肪酸和蛋白质，对其在胁迫条件下进行代谢应答与应激响应是微藻生物质资源开发与利用的重要内容[63-64]。陈凯[65]使用拉曼光谱结合特征提取方法对微藻总油脂含量和微藻油脂累积分布进行可视化分析，并分析了微藻细胞在缺乏氮无机盐胁迫的条件下脂肪酸含量随着胁迫时间和胁迫程度的变化规律，为提高微藻脂肪酸产量提供参考。PANDEY S等[66]使用显微拉曼光谱研究了无机盐胁迫对莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）细胞内类胡萝卜素物质生成和积累的影响，结果表明，叶黄素和玉米黄素含量会随着培养时间和无机盐浓度胁迫程度的增加而增加，研究表明，拉曼光谱技术可以实时、非侵入和无损地检测莱茵衣藻在无机盐胁迫下的类胡萝卜素产量，有助于在实际生产中优化莱茵衣藻的无机盐胁迫条件和胁迫时间，以获得更高的类胡萝卜素产量。
在水体富营养化的情况下，有些微藻会大量繁殖导致赤潮的产生，使海洋生物大量死亡、破坏海洋生态环境[67-68]。因此，对微藻进行单细胞水平上的分析，深入探究微藻的生理生化特性，可以对赤潮或其他水体污染的防治提供新的思路和方法。章帅[69]以斜生四链藻（Tetradesmus obliquus）为研究材料，采用单细胞分析仪进行电化学分析，并结合CRS对无机盐高渗透压胁迫下微藻单细胞的氧化应激反应进行研究。结果表明，斜生四链藻在高盐胁迫下会产生过氧化氢，并且过氧化氢的产量会随无机盐胁迫的浓度增加而增加，同时抗氧化色素消耗量和叶绿素受到破坏的程度也增加。因此认为，结合单细胞分析和CRS可以使斜生四链藻作为生物传感器检测水体无机盐污染状况。为进一步开发微藻作为生物传感器用于预防水体污染的应用提供了一定的参考。
如何提高拉曼光谱的信噪比，获得更精确的分析结果一直是拉曼光谱分析技术的未来发展方向。目前，在科研实践中获取拉曼光谱的工具有手持式拉曼光谱仪[70]、表面增强拉曼光谱仪[71]、拉曼探头[72]等。这些工具极大提升了拉曼光谱的获取效率。而更进一步所获拉曼光谱图像的信噪比、优化数据处理方法以提高分析精度仍然有待科学家深入研究。
在新时代促进多学科交叉融合发展的大背景下[73]，拉曼光谱与人工智能机器深度学习融合发展的技术研究与应用已有报道[74]。目前，已有多种基于人工智能与机器深度学习优化拉曼光谱数据处理和分析的方法获得了国家专利认证[75-79]。人工智能与机器深度学习与拉曼光谱分析结合的微生物分析方法已经应用于海洋微生物的快速分类鉴别[80]、分辨不同分子结构的胆汁酸比例以分析肠道菌群结构是否失衡[81]、快速分类冠状病毒变种[82]、细菌抗生素耐药性的鉴定[83]和不同的病原体细菌囊泡种类分类[84]等多种微生物活细胞研究实践。由此可见，拉曼光谱分析技术与人工智能机器深度学习融合发展的技术是富有潜力的发展方向。
综上所述，拉曼光谱可以实现无损、原位、免培养分析和鉴定微生物代谢特征与分类特征，以及获得生物细胞在特定环境下的代谢特点，掌握生物细胞代谢的第一手生理生化变化信息。因此，拉曼光谱是一种高效的微生物科研分析工具。进入新的多学科交叉融合深度发展时代，拉曼光谱与人工智能深度融合发展将在生物反应器的研究、微生物的识别与分类、临床疾病诊断与疾病发生机理探究、传染病防治和生物安全等领域展现出更大的发展潜力和更广阔的应用前景。
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