枸杞（Lycium barbarum）为茄科、枸杞属植物，是我国传统的药食两用植物，含有丰富的多酚、枸杞多糖、超氧化物歧化酶等物质，被证明对调节免疫能力、抑制肿瘤细胞的生长、治疗脂肪肝、调节血脂血糖、抗衰老具有积极作用[1-2]。
拐枣（Hovenia acerba）为鼠李科枳椇属植物，又名枳椇、鸡爪连、甜半夜等[3]。其膨大的肉质果柄部分可食用，甜味突出，总糖含量高达24.9%，是良好的高糖低脂食物。同时富含维生素、氨基酸及膳食纤维，综合营养价值较高[4-5]。现有研究表明，成熟的拐枣中富含生理活性物质如枳椇皂苷、黑麦草碱等，具有减轻酒精的肝脏毒性，抑制肿瘤细胞生长、调节免疫力、降低肿瘤发病风险等作用[6]。但与此同时，拐枣中单宁含量高，导致原汁带有浓重的涩味。目前阶段拐枣仍是以鲜食为主，未能发展出成规模的产业[7]。
为平衡拐枣自身的涩味，民间常将拐枣与枸杞或其他植物性成分共同泡制于烈酒中，以改善其感官特征，增进食疗保健效果[8-9]。利用拐枣与枸杞共同加工露酒可实现我国药食两用植物资源的高效利用，也符合我国酒类消费从粮食类酒、烈性酒向营养型酒、果酒转变的趋势。但目前阶段对枸杞拐枣露酒的原料添加量、泡制时间、基酒酒精度等因素仍缺乏系统性研究，加工工艺仍具有一定盲目性。
本试验以枸杞拐枣露酒感官品质及体外抗氧化活性为评价指标，通过单因素试验及响应面试验对枸杞拐枣露酒的加工工艺进行优化，以期对枸杞拐枣露酒的加工进行规范化的理论指导，在提升枸杞拐枣露酒的感官品质及抗氧化活性的前提下尽可能降低生产成本，助力枸杞及拐枣资源的规模化、产业化利用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干制枸杞：漳州初夏食品有限公司；野生拐枣：市售；63%vol白酒（基酒）：信阳市鸡公山酒业。
硫酸亚铁、过氧化氢（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；水杨酸（分析纯）：郑州派尼化学试剂厂；无水乙醇（分析纯）：诺维化工科技有限公司；Tris-Hcl、邻苯三酚（均为分析纯）：天津市博迪化工有限公司；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）（分析纯）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：合肥千盛生物科技有限公司；过硫酸钾（分析纯）：厦门海标科技有限公司。
1.2 仪器与设备
YH-M3003电子天平：瑞安市英衡电器有限公司；A390型紫外可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；TGL-16C台式离心机：上海安亭科学仪器厂；LDZM-80L-III立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；HW型远红外干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：常州越新仪器制造有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 枸杞拐枣露酒加工工艺流程及操作要点
操作要点：
原料分选及清洗：挑选圆润饱满、大小基本一致、无病害的干制枸杞及果柄大小一致、色泽深褐、表面略有干枯的野生拐枣，以蒸馏水冲洗后擦去表面水分备用。
基酒调配：以63%vol白酒为基础，与蒸馏水混合调配至所需酒精度。
避光浸提：称取一定量的枸杞及拐枣于容器中，添加500 mL已调配至相应酒精度的基酒，充分混匀，密封后储存于室温环境（20～25 ℃），避光浸提。
澄清过滤：室温浸提后添加55 ℃温水活化至乳状的膨润土，静置2 d澄清酒体。澄清后使用过滤机（0.22 μm聚丙烯滤芯）进行过滤，得到枸杞拐枣露酒。
1.3.2 枸杞拐枣露酒加工工艺优化单因素试验
以浸提时间9 d、基酒酒精度35%vol、枸杞添加量6 g/100 mL、拐枣添加量30 g/100 mL为初始条件，分别考察浸提时间（3 d、6 d、9 d、12 d、15 d）、基酒酒精度（25%vol、30%vol、35%vol、40%vol、45%vol）、拐枣添加量（20g/100mL、25 g/100 mL、30 g/100 mL、35 g/100 mL、40 g/100 mL）、枸杞添加量（2 g/100 mL、4 g/100 mL、6 g/100 mL、8 g/100 mL、10 g/100 mL）对枸杞拐枣露酒抗氧化活性及感官评价的影响[15]。
1.3.3 枸杞拐枣露酒加工工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，使用Box-Behnken中心原理设计试验，选取对枸杞拐枣露酒感官评分具有显著影响的基酒酒精度（A）、拐枣添加量（B）和枸杞添加量（C）为考察变量，以枸杞拐枣露酒感官评分（Y）为响应值，设计3因素3水平的响应面试验，考察各因素间交互作用对枸杞拐枣露酒感官评分的影响，响应面试验因素与水平见表1。
表1 枸杞拐枣露酒加工工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for preparation process optimization of Lycium barbarum-Hovenia acerba Lujiu
水平 A 基酒酒精度/%vol C 枸杞添加量/（g·100 mL-1）-1 B 拐枣添加量/（g·100 mL-1）01 35 40 45 30 35 40 681 0
1.3.4 测定方法
感官评价：选取20名具有食品背景的专业人员组建品鉴小组，参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》建立枸杞拐枣露酒的评价体系[14]。从外观、香气、滋味、典型性4个方面对枸杞拐枣露酒进行感官评分，满分100分。枸杞拐枣露酒感官评分标准见表2。
表2 枸杞拐枣露酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Lycium barbarum-Hovenia acerba Lujiu
项目 评价标准 分值/分外观（40分）香气（20分）滋味（20分）典型性（20分）淡黄色、酒液清亮、无明显沉淀物和浑浊现象淡黄色、酒液较清亮、稍有沉淀物和浑浊现象颜色异常、酒液浑浊，有较多沉淀物果香、酒香愉悦和谐果香、酒香较少，但无异香果香、酒香不足，有异香酒质柔和爽口，酸甜适当酒体协调，纯正无杂酒体寡淡不协调，有明显缺陷典型明确，风格良好有典型性，风格不突出无典型性25～40 15～25 0～10 15～20 5～15 0～5 15～20 5～15 0～5 15～20 5～15 0～5
羟基自由基清除率的测定：参考文献[10]；超氧阴离子自由基清除率的测定：参考文献[11]；ABTS+·清除率的测定：参考文献[12]；DPPH自由基清除率的测定：参考文献[13]。体外抗氧化活性测定结果以清除率（%）表示。
1.3.5 数据处理
采用SPSS 20软件进行数据处理。采用Design Expert 8.0.6进行响应面设计及显著性差异分析。采用Origin 2022软件作图。
2 结果与分析
2.1 枸杞拐枣露酒加工工艺优化单因素试验
2.1.1 浸提时间对枸杞拐枣露酒品质的影响
由图1可知，随着浸提时间的延长，枸杞拐枣露酒的感官评分呈现出先上升后下降的趋势；当浸提时间为12 d时，枸杞拐枣露酒色泽为金黄色且具有较好的拐枣风味，感官评分最高为71分；当浸提时间超过12 d时，酒体颜色整体变深且出现后苦，使得感官评分下降。
图1 浸提时间对枸杞拐枣露酒品质的影响
Fig.1 Effect of maceration time on the quality of Lycium barbarum-Hovenia acerba Lujiu
枸杞拐枣露酒的抗氧化活性与浸提时间整体呈正相关，在浸提初期（0～6 d），枸杞拐枣露酒的抗氧化活性上升较为平缓，除超氧阴离子自由基清除率外，其他DPPH、ABTS、羟基自由基的清除率上升均不足10%。在6～12 d内酒体抗氧化活性上升速率较快，显示出酒体抗氧化活性的明显提升。当浸提时间为12 d时，DPPH自由基清除率最高，达到80.85%。浸提时间超过12 d后，酒体的抗氧化活性基本稳定。为避免长时间浸提影响露酒的存储稳定性[16]，综合考虑枸杞拐枣露酒的感官评分及抗氧化活性，选择浸提时间为12 d进行后续试验。
2.1.2 基酒酒精度对枸杞拐枣露酒品质的影响
由图2可知，随着基酒酒精度的升高，枸杞拐枣露酒的感官评分呈现出先上升后下降的趋势；基酒酒精度为40%vol时枸杞拐枣露酒感官评分最高为79分；当基酒酒精度上升至45%vol时，枸杞拐枣露酒酒精味较重且入口出现灼烧感，严重影响了感官评分。
图2 基酒酒精度对枸杞拐枣露酒品质的影响
Fig.2 Effect of alcohol content in base liquor on the quality of Lycium barbarum-Hovenia acerba Lujiu
枸杞拐枣露酒抗氧化活性与基酒酒精度间整体呈正相关，随着露酒的基酒酒精度在25%vol～40%vol不断提高，抗氧化活性物质的溶出效率也逐渐提升，使得总体抗氧化活性呈现升高趋势。基酒酒精度40%vol时超氧阴离子自由基清除率最大，为82.34%。当基酒酒精度＞40%vol时，枸杞拐枣露酒的DPPH自由基清除率出现了较大幅度的下降，ABTS、超氧阴离子、羟基自由基的抗氧化活性基本维持不变，露酒的抗氧化活性出现小幅度下降，推测可能与基酒内醛类，酸类等成分的含量升高有所关联[17]。综合考虑选择基酒酒精度为40%vol进行后续试验。
2.1.3 拐枣添加量对枸杞拐枣露酒品质的影响
由图3可知，随拐枣添加量的升高，枸杞拐枣露酒的感官评分呈现出先上升后下降的趋势；拐枣添加量为35 g/100 mL时枸杞拐枣露酒感官评分最高为75分；拐枣添加量超过35 g/100 mL后，枸杞拐枣露酒颜色明显加深，出现了较为明显的后苦，严重影响了感官得分。
图3 拐枣添加量对枸杞拐枣露酒品质的影响
Fig.3 Effect of Hovenia acerba addition on the quality of Lycium barbarum-Hovenia acerba Lujiu
枸杞拐枣露酒的抗氧化活性随拐枣添加量的增加而增加，在拐枣添加量超过35 g/100 mL后趋于稳定。拐枣添加量为35 g/100 mL时枸杞拐枣露酒的ABTS自由基清除率达到最高为81.95%，这一现象与唐兰芳等[19]的试验结果间具有部分一致性；当拐枣添加量超过35 g/100 mL后，枸杞拐枣露酒的超氧阴离子、DPPH自由基清除率出现了小幅下降，羟基、ABTS自由基清除率没有显著变化。综合考虑选择拐枣添加量为35 g/100 mL进行后续试验。
2.1.4 枸杞添加量对枸杞拐枣露酒品质的影响
由图4可知，随枸杞添加量增加，枸杞拐枣露酒的感官评分呈现出先上升后下降的趋势；枸杞添加量为8 g/100 mL时枸杞拐枣露酒的感官评分最高为78分；随着枸杞添加量的增加，枸杞拐枣露酒的颜色不断加深，同时甜味过于明显，严重影响了感官得分。
图4 枸杞添加量对枸杞拐枣露酒品质的影响
Fig.4 Effect of Lycium barbarum addition on the quality of Lycium barbarum-Hovenia acerba Lujiu
枸杞拐枣露酒的抗氧化活性与枸杞添加量间呈正相关趋势，DPPH、羟基、超氧阴离子自由基清除率在枸杞添加量为8 g/100 g时出现峰值，DPPH自由基清除率最高为83.94%，超过8 g/100 g后基本维持稳定。而ABTS自由基清除率在枸杞添加量超过8 g/100 g后出现了较大程度的下降。这可能是由于底物浓度较高时溶剂量不足，局部浓度过高引起的浑浊程度高于二者作用时产生的褪色，从而导致使吸光度值增大[18]。综合考虑选择枸杞添加量8 g/100 mL为最适添加量。
2.2 响应面试验结果与分析
2.2.1 枸杞拐枣露酒加工工艺优化响应面试验
基于单因素试验结果，选择枸杞拐枣露酒感官评分为响应值，设计3因素3水平响应面试验对枸杞拐枣露酒加工工艺进行优化。响应面试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 枸杞拐枣露酒加工工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for preparation process optimization of Lycium barbarum-Hovenia acerba Lujiu
试验号A 基酒酒精度/%vol B 拐枣添加量/（g·100 mL-1）C 枸杞添加量/（g·100 mL-1）Y 感官评分/分1234567891 0 11 40.00 40.00 40.00 40.00 35.00 40.00 35.00 40.00 45.00 35.00 40.00 35.00 40.00 35.00 30.00 35.00 35.00 30.00 30.00 35.00 40.00 40.00 8.00 10.00 8.00 6.00 10.00 8.00 8.00 10.00 10.00 8.00 6.00 82.63 83.56 81.50 75.00 78.63 85.69 75.60 77.56 71.55 76.50 78.63
续表
试验号A 基酒酒精度/%vol B 拐枣添加量/（g·100 mL-1）C 枸杞添加量/（g·100 mL-1）Y 感官评分/分12 13 14 15 16 17 45.00 45.00 40.00 45.00 40.00 35.00 35.00 30.00 35.00 40.00 35.00 35.00 6.00 8.00 8.00 8.00 8.00 6.00 74.38 75.40 82.69 77.20 81.81 72.50
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
方差来源模型Y 感官评分平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性**ABCA B AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和245.93 2.76 19.00 14.55 0.20 20.07 1.40 129.96 5.41 39.00 23.30 12.26 11.04 269.23 91111111117341 6 27.33 2.76 19.00 14.55 0.20 20.07 1.40 129.96 5.41 39.00 3.33 4.09 2.76 8.21 0.83 5.71 4.37 0.06 6.03 0.42 39.04 1.62 11.71 0.005 6 0.392 7 0.048 2 0.074 9 0.812 3 0.043 8 0.536 7 0.000 4 0.243 2 0.011 1** ***1.48 0.347 2
根据表3响应值可得枸杞拐枣泡制酒的感官评分的多元二次回归方程为：Y=82.86-0.59A+1.54B+1.35C+0.23AB-2.24AC+0.59BC-5.56A2-1.13B2-3.04C2。
由表4可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明模型与试验结果拟合度较好[20]。决定系数R2=0.913 5，调整决定系数R2Adj=0.802 2，感官评分的预测值与实际值之间的拟合度较高[21-22]。信噪比=8.290＞4，说明该模型能较好的在变量范围内进行枸杞拐枣露酒的感官评分（Y）预测[23]。由F值可知，3因素对感官评分的影响顺序为B＞C＞A，即拐枣添加量＞枸杞添加量＞基酒酒精度。由P值可知，二次项A2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项B、二次项C2及交互项AC对结果影响显著（P＜0.05）。
使用Design-Expert 8.0.6进行数据处理，得出基酒酒精度（A）、拐枣添加量（B）及枸杞添加量（C）交互作用对感官评分（Y）的响应面及等高线如图5所示。由图5可知，AB、AB、BC交互作用在感官评分响应面3D图上均存在极大值，AC间交互作用的响应面3D图坡度趋势相对于其余因素更为陡峭，说明基酒酒精度与枸杞添加量间的交互作用对感官评分的影响更大，与方差分析结果一致。
图5 各因素间交互作用对枸杞拐枣露酒感官评分影响的响应面及等高线图
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on sensory score of Lycium barbarum-Hovenia acerba Lujiu
2.2.2 响应面试验优化验证
根据模型获得枸杞拐枣露酒的最佳加工工艺为基酒酒精度39.48%vol，拐枣添加量38.78 g/100 mL，枸杞添加量8.67 g/100 mL。此条件下枸杞拐枣露酒的理论感官得分为83.70分。为方便实际操作，修改加工工艺为基酒酒精度39.5%vol，拐枣添加量38.8g/100mL，枸杞添加量8.7g/100mL，在此条件下进行3次平行验证试验，测得枸杞拐枣露酒实际感官得分84分，与理论值间相差不大，所得酒体颜色为较浅的金黄色，具有清甜的果香，酒体协调无异味，口感较好，构建的响应面模型真实可靠，具有一定的参考价值[25]。最佳工艺条件获得的枸杞拐枣露酒ABTS、DPPH、羟基、超氧阴离子自由基清除率分别为83.73%、82.87%、85.21%、83.92%，表明该露酒具有一定的体外抗氧化活性。
3 结论
通过单因素试验研究了浸提时间、基酒酒精度、拐枣添加量、枸杞添加量对枸杞拐枣露酒感官评分及体外抗氧化活性的影响，进一步利用Box-Behnken响应面试验优化了浸提工艺。所获得的枸杞拐枣露酒最佳加工工艺为基酒酒精度39.5%vol，拐枣添加量38.8 g/100 mL，枸杞添加量8.7 g/100 mL，此条件下获得枸杞拐枣露酒酒体色泽为浅金黄色，具有清甜的枸杞及拐枣果香，酒体协调无异味，口感较好，感官评分为84分，ABTS、DPPH、羟基、超氧阴离子自由基清除率为83.73%、82.87%、85.21%、83.92%，具有一定的体外抗氧化活性。
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