浓香型白酒发酵为固态密闭式发酵,发酵过程中起主要作用的菌株大多为兼性厌氧菌或厌氧菌[1-2],开窖取样或者打孔取样不但会有染菌风险,出酒率也会受到影响,且窖池中酒醅的上、中、下层发酵状态不同,如果进行取样需从多个层次多个方位进行取样,会影响白酒的密闭式发酵状态[3-4],因此,无法定时监测酒醅的发酵情况进而跟踪浓香型白酒的发酵状态。但有研究表明,发酵过程的黄浆水和酒醅具有强相关性,车路萍[5]研究发现,酒醅与黄浆水的理化指标具有强相关性,浓香型白酒发酵过程中,酒醅与黄浆水的挥发性总醇、总酸、总酯含量以及乳酸、乙酸含量的变化规律均大致相同;张榆俊等[6]研究发现,黄水的一些理化指标可以预测酒醅风味物质的变化趋势。相较于酒醅,黄水的采集方便快捷不会影响窖池的密闭发酵,且黄水来自于窖内所有酒醅,取样均一,因此发酵过程中可以通过定时监测黄浆水的理化指标和风味物质监测白酒发酵情况。
黄浆水是浓香型白酒发酵过程中料醅中的淀粉在微生物的作用下转变成乙醇,单位酒醅质量相对减少,结晶水游离出来,原料中的单宁、色素、可溶性淀粉、酵母自溶物、还原糖等溶于水中,流入底层形成的[7-8]。黄浆水因其颜色呈淡黄色,又名黄水。黄浆水中含有经长期驯化的己酸菌、酵母菌等多种有益微生物,还含有大量的糖分、酸类、醇类、酯类等物质[9],可用于改善白酒风味、提高酒质、养护窖泥、生物酯化等[10]。黄浆水中含有酒醅中的多种风味物质和分子[5],是连接窖池、窖泥和酒醅的重要介质,窖泥与酒醅中的各种营养分子、微生物以及他们代谢产生的风味成分通过黄水不断交流[11-12]。因此,如果能对黄浆水中的成分进行充分研究,不仅有利于黄浆水的开发利用,还可作为检测浓香型白酒发酵状况的指标,监测白酒发酵过程,为密闭生产过程提供可视化指示性数据。
本研究通过对浓香型白酒酿造过程中黄浆水主要理化指标和风味物的测定,考察其变化规律,以期为白酒的酿造过程提供参考,指导酿造工艺调整,并为白酒的生产和黄浆水的开发利用奠定基础。
1.1.1 材料
黄浆水:采自安徽古井贡酒酿酒车间,随机选取16条发酵效果良好的窖池,发酵开始后每隔一周进行黄水抽取,后期每隔两周进行一次取样,发酵周期为28周,样品保存于-80 ℃冰箱。
1.1.2 试剂
叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸(均为色谱纯):上海安谱有限公司;己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸、乳酸、丁酸、己酸、异丁醇、甲醇、仲丁醇、异戊醇、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、苯酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-丙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、2,4-二叔丁基苯酚、愈创木酚等标准品、乙醇(均为色谱纯):美国Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为国产分析纯。
7890型气相色谱(gas chromatography,GC)仪[配CPWAX 57 CB色谱柱(50 m×0.25 mm,0.2 μm)]、7890B-5977A型气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用仪[配DB-WAX毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)]:美国Agilent公司;SPME固相微萃取器手柄、30/50μmDVB/CAR/PDMS萃取头:美国Supelco公司;Acquity超高效液相色谱(ultra-high performance liquid chromatography,UPLC)[配光电二级阵列管检测器(photo-diode array,PDA)和Waters HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)]:美国Waters公司;Seven Compact S220-K型pH计:梅特勒-托利多仪器有限公司。
1.3.1 黄浆水主要理化指标的检测
酸度的测定:称取1 g黄浆水用去离子水稀释10倍,以酚酞作为指示剂,用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至终点,以滴定消耗的NaOH的体积数与样品质量数之比作为黄浆水的酸度值;pH的测定:采用pH计;淀粉和酒精度的测定:参考文献[13]。
1.3.2 黄浆水中主要挥发性风味物质的检测
将黄浆水与体积分数80%的乙醇按照1∶9体积比混匀,于4 ℃冰箱醇沉12 h后,0.22 μm有机相滤膜过滤,采用气相色谱仪检测黄浆水中的主要挥发性风味物质[14]。
1.3.3 黄浆水中乳酸的检测
参考文献[15]中的超高效液相色谱法测定黄浆水中的乳酸含量。
1.3.4 黄浆水中酚类物质的检测方法
参考文献[16]中的顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法测定黄浆水中的酚类物质。
1.3.5 数据处理
每次试验重复测定三次,结果用“平均值±标准差”表示。采用SPSS 24.0进行差异显著性分析;采用Origin 2018进行绘图。
浓香型白酒入池发酵后,定时进行黄浆水取样并测定黄浆水的主要理化指标,结果见图1。由图1a可知,黄浆水酸度在发酵后迅速上升,发酵2~11周缓慢上升至最高点4.71 mL/g,之后下降并稳定在3.45~3.55 mL/g。由图1b可知,发酵第1~2周时pH迅速降低,之后有所上升,最后趋于稳定,在3.62~3.80范围内波动。由图1c可知,淀粉含量在发酵开始时急剧减少,之后逐渐减少,最后接近于0。由图1d可知,发酵前期酒精度增加,发酵第6周时达到最高,为13.99%vol,到发酵中期酒精度降低,发酵12周时降低至最低,为5.06%vol,发酵后期酒精度又增加,最后稳定在9.08%vol~9.36%vol。
图1 浓香型白酒发酵过程中黄浆水主要理化指标的变化
Fig.1 Changes of main physicochemical indexes in the Huangjiangshui during strong-flavor Baijiu fermentation
在发酵前期,微生物比较活跃,其中霉菌、酵母菌、乳杆菌等大量繁殖、代谢[17-18],快速消耗酒醅中的淀粉,产生大量的醇类、酸类等物质,这些醇类、酸类等物质随着游离水流入底层,增加了黄浆水的酒精度和酸度,降低了黄浆水的pH。随着发酵的进行,酒醅中氧气被消耗殆尽,酵母进行无氧呼吸产生酒精,第6周时黄浆水中的酒精度达到最高,之后乳酸菌开始占据主要优势地位[19],大量繁殖,通过代谢产生乳酸,因此酒醅中的酸度增加,从图1可以看出发酵第6~11周黄浆水的酸度值增加,但由于微生物的代谢产物也会影响环境的pH值,因此pH值略微升高[20]。这段时间由于窖池中酸和醇达到了一定浓度,通过酯化酶的催化,使酯类物质增加,pH上升,酒精度下降。随着发酵的进行,酒醅中的营养物质被消耗殆尽,酸类物质被作为营养物质参与微生物的代谢,黄浆水的酸度下降,pH趋于稳定,酒精度也趋于稳定。
李璇等[19-22]研究发现,酒醅的酸度在发酵前3周有所增长,随着发酵的进行,前中期酸度继续小幅增长,达到一个最大值,后酸度小幅下降并趋于稳定;酒醅pH在发酵前20 d整体呈下降趋势,之后虽有增减但总体在3.5~3.7之间浮动,变化不大;酒醅淀粉含量在前2周以较快速度被消耗,随后消耗速度比较平缓;酒醅中酒精度前期快速积累,并在20~25 d达到最大值,之后略有下降并保持稳定。综上所述,比较黄浆水和酒醅的酸度、pH、淀粉含量和酒精度,黄浆水的理化指标变化趋势与发酵酒醅变化趋势基本相同,因此,黄浆水的理化指标可以作为监测酒醅理化变化的良好材料。
2.2.1 主要风味物质总含量的变化规律
浓香型白酒发酵过程中黄浆水主要风味物质(包括醛类、酯类、酸类、醇类和酚类)总含量的变化见图2。由图2可知,黄浆水中主要风味物质的总含量在发酵1~5周呈上升趋势,发酵6~8周总体保持平稳状态,随后升高,发酵第9周时达到峰值(58 549.57 mg/L),随着发酵的进行,总含量又有所下降,后又上升并有所波动,但在50 240.69~60 561.74 mg/L范围内。由图2亦可知,黄浆水中酸类物质占比较高,其次是酯类物质、醇类物质,酚类和醛类物质含量占比较少。黄浆水中主要风味物质总含量前期之所以增加,是因为发酵前期霉菌、酵母菌、乳酸菌等微生物大量繁殖,分解有机物,转化为醇和酸,这些物质随着游离水流入底层,增加了黄浆水的醇和酸的含量。随着酸和醇的增加,酯化反应也在加速进行,因此酯类物质的含量也在增多,发酵第10周时酯类物质含量达到顶峰。发酵第9周之后总含量逐渐减少,主要是因为淀粉等物质几乎消耗殆尽,微生物对底物进行分解代谢导致。发酵后期经过微生物代谢产生大量的酸类物质逐渐积累增多流入池底,增加了黄浆水中酸类物质的含量,因此后期黄浆水中主要风味物质的总含量增多并趋于稳定。与酒醅不同的是黄浆水中含有大量的酸类物质,且占比较高,其次是酯类和醇类物质,酒醅中大部分为水分,其次是淀粉、还原糖、醇类等,但其占主要成分的酸类物质、醇类物质、酯类物质的总体变化趋势与酒醅大体相同[22]。
图2 浓香型白酒发酵过程中黄浆水主要风味物质类别总含量的变化
Fig.2 Changes of the total contents of main flavor substances types in the Huangjiangshui during strong-flavor Baijiu fermentation
2.2.2 酸类物质的变化规律
浓香型白酒发酵过程中黄浆水中酸类物质含量的变化见图3。由图3可知,黄浆水中酸类物质主要成分为乳酸,其次是乙酸,还含有少量的丁酸和己酸等。浓香型白酒发酵前5周,乳酸菌大量繁殖,代谢产生乳酸,因此乳酸含量随着发酵的进行而增加。随着乳酸的增加,以乳酸为底物代谢生成乙酸、己酸、丁酸等物质,因此该时期乙酸、己酸、丁酸等物质的含量也在上升,同时酯化反应也在进行,结合图2可知,酯类物质含量也在增加。之后酯类物质合成达到平衡状态,酸类物质含量积累,在发酵第9周时,乳酸含量积累到47 412 mg/L,乙酸、丁酸、己酸含量分别达到4495mg/L、583mg/L、1311mg/L,总含量达到54160.75mg/L,随后由于菌体的代谢作用,乳酸、己酸、丁酸等酸类物质作为底物,为菌体提供能量等,因此其含量有所下降。随着发酵的进行后期处于动态平衡中,乳酸含量维持在45 000 mg/L左右。乙酸在发酵26周时达到最大,为7 832 mg/L,丁酸在发酵22周时含量达到最大,为1 135 mg/L,己酸在发酵26周时达到最大,为1 614 mg/L。酒醅中主要的酸也是乳酸,其次是乙酸、己酸、丁酸,发酵周期内,乳酸含量在发酵初期快速增加,之后乳酸含量增速变缓,在发酵后期乳酸含量有略微下降的趋势;乙酸则在发酵初期快速增加,之后略有缓慢增加趋势[22-23]。根据对黄浆水酸类物质的研究发现其与酒糟的酸类物质变化趋势大体相同,可以作为监测酒糟发酵的指标。另外从图中可以看出黄浆水中主要成分为乳酸,它是白酒发酵中的一种重要有机酸,是白酒的主要呈味物质之一,其含量的高低直接影响着浓香型白酒的口感和后味[7],因此研究黄浆水中乳酸的含量对于白酒的酿造具有重要的意义。
图3 浓香型白酒发酵过程中黄浆水酸类物质含量的变化
Fig.3 Changes of acids contents in the Huangjiangshui during strong-flavor Baijiu fermentation
2.2.3 醇类物质的变化规律
浓香型白酒发酵过程中黄浆水中醇类物质(不含乙醇)含量的变化见图4。由图4可知,黄浆水中的醇类物质含量在发酵过程中整体呈先增加后减少的趋势,发酵1~5周窖池中菌群迅速繁殖代谢,产生醇类物质,发酵6~8周醇类物质保持稳定,发酵9~11周随着菌群的代谢,酯化反应达到平衡,醇类物质逐渐积累,发酵11周时达到最高,为1 901 mg/L,发酵12~22周由于菌体代谢作用,醇类物质有所降低,发酵24~28周醇类物质含量稳定在707.50~790.26 mg/L。黄浆水中醇类物质的主要成分为2,3-丁二醇,其中左旋2,3-丁二醇占比较大,其次是丙二醇,再次是异戊醇、正丙醇、异丁醇等。其中2,3-丁二醇、丙二醇的含量在发酵过程中均呈先增加后减少的趋势,且都在发酵10~11周达到最大值。酒醅中醇类物质代谢规律是前期快速增长,中期较为平稳,后期缓慢下降[24]。从醇类物质的变化规律上看,黄浆水中醇类物质与酒醅中醇类物质变化趋势基本符合。
图4 浓香型白酒发酵过程中黄浆水醇类物质含量的变化
Fig.4.Changes of alcohols contents in the Huangjiangshui during strong-flavor Baijiu fermentation
2.2.4 酯类物质的变化规律
浓香型白酒发酵过程中黄浆水中酯类物质含量的变化见图5。由图5可知,酯类物质的含量在前期迅速增加,之后缓慢增加,到第10周时达到最高,为3 307.24 mg/L,之后含量下降并稳定在1 990.90~2 266.28 mg/L之间。因浓香型白酒酿造过程中黄浆水中乳酸和乙酸含量相对较多,经过酯化后导致黄浆水中乳酸乙酯和乙酸乙酯含量也相对较多,在黄浆水酯类物质中占比较大。其中,乳酸乙酯含量在发酵前期逐渐增多,特别是前几周增长迅速,发酵第10周时含量达到2 740 mg/L,这是因为前5周乳酸菌大量繁殖、代谢产生乳酸,再经过酯化形成乳酸乙酯的缘故。后期乳酸乙酯含量有所下降,是因为当酸和醇的浓度过高时,高浓度的酸和醇将影响酯化酶结构的稳定性,抑制酯化反应的进行,酯化率及总酯含量下降[25-28]。黄浆水中乙酸乙酯含量随发酵逐渐增多,到后期含量相对较多。高江婧等[22]研究发现,酒醅中乳酸乙酯和乙酸乙酯含量在发酵初期呈现显著增加趋势,后期则逐渐趋于平稳;赵荣寿等[29]研究发现,乳酸乙酯在发酵前期就已经大量存在,随发酵时间延长变化不大,乙酸乙酯的含量逐渐增加,但是生成速度逐渐降低。综上所述,黄浆水中乳酸乙酯前期显著增加与酒醅变化规律一致,后期其含量有所降低与酒醅中乳酸乙酯的变化有所差别。乙酸乙酯的含量逐渐在增加,后期含量相对较多,与酒醅一致。
图5 浓香型白酒发酵过程中黄浆水酯类物质含量的变化
Fig.5 Changes of esters contents in the Huangjiangshui during strong-flavor Baijiu fermentation
2.2.5 酚类物质的变化规律
浓香型白酒发酵过程中黄浆水中酚类物质含量的变化见图6。
图6 浓香型白酒发酵过程中黄浆水酚类物质含量的变化
Fig.6 Changes of phenols contents in the Huangjiangshui during strong-flavor Baijiu fermentation
由图6可知,黄浆水中酚类物质的含量在发酵过程中总体呈上升趋势,发酵1~7周基本保持稳定,8~28周呈快速增长趋势,发酵28周时达到最高,为12 652 μg/L。在酚类物质中占比最多的是4-甲基苯酚,较多的是苯酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚,较少的是愈创木酚、4-丙基愈创木酚、4-乙烯愈创木酚和2,4-二叔丁基苯酚。4-甲基苯酚的含量前期变化不大,随着发酵的进行,后期含量逐渐增多并趋于稳定。苯酚的含量前期随着发酵的进行逐渐增多,在发酵10周时达到2 132 μg/L,之后急剧减少,随后又逐渐增多,在发酵28周时达到2 660 μg/L。4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚在发酵前期变化不大,发酵后期积累较多,4-甲基愈创木酚含量在发酵28周时达到1 991.93 μg/L,4-乙基愈创木酚含量在发酵24周时达到708.18 μg/L。4-乙烯愈创木酚在发酵前期含量较多,后期经还原酶转化成4-乙基愈创木酚,其含量逐渐减少,4-乙基愈创木酚含量增多[30]。浓香型白酒酒醅中4-甲基苯酚的含量在发酵前期变化不大,在发酵后期有升高趋势[31];苯酚和4-乙基苯酚的变化规律未见报道;4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚发酵前期变化较小,后期含量显著增加,4-乙烯愈创木酚在发酵前期含量较多,后期减少[32];愈创木酚、4-丙基愈创木酚和2,4-二叔丁基苯酚的变化规律鲜有报道。综上所述,黄浆水中4-甲基苯酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙烯愈创木酚的变化规律与酒醅中基本相似,可做为检测白酒发酵的参考指标之一。
本研究从浓香型白酒发酵良好的窖池中随机挑选多个窖池进行研究,检测不同发酵阶段(28周)黄浆水主要理化指标和风味物质含量的变化。发酵前期黄浆水的酸度快速上升,pH快速降低,发酵2~28周,酸度维持在3.45~4.71 mL/g,pH在3.47~3.91;淀粉含量在发酵开始时急剧减少,之后逐渐减少,最后接近于0;酒精度在发酵前期增加,发酵第6周时达到最高(13.99%vol),发酵中期降低,后期增加并稳定在9.08%vol~9.36%vol。主要风味物质的总含量在发酵前期增多,中后期降低,后期增加并稳定在50 240.69~60 561.74 mg/L之间;酸类物质发酵前期增加,到第9周时增加到54 160.75 mg/L,之后含量降低,最后在43 811.51~57 237.04 mg/L范围内波动;醇类、酯类物质的含量在发酵前期增长,在发酵9~11周达到最高值并有所波动,后趋于稳定,醇类物质含量稳定在707.50~790.26 mg/L之间,酯类物质含量稳定在1 990.90~2 266.28 mg/L之间;酚类物质含量前期基本保持不变,中期增长,后期稳定并达到最高(12 652 μg/L)。黄浆水的理化指标和部分风味物质变化与酒醅的成分变化接近,因此,可以用黄浆水替代酒醅检测发酵过程的变化,为浓香型白酒的发酵提供参考依据。本研究通过检测发酵过程中黄浆水理化指标及风味成分的变化趋势,为白酒的发酵过程的监测提供理论化可视数据,指导酿造工艺调整,并为白酒的生产和黄浆水的开发利用奠定基础。
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Changes of physiochemical indexes and flavor substances of Huangjiangshui during brewing process of strong-flavor Baijiu