刺梨（Rosa roxburghii Tatt.）属于蔷薇科植物，作为贵州特色水果资源，其在贵州省分布最广、产量最大，因刺梨富含维生素C、多酚和黄酮等营养活性成分，使其具有调节机体免疫功能、延缓衰老、抗肿瘤等功效，富含活性功效成分的刺梨在人体健康上的有益作用使其获得较多学者的研究和关注[1-4]。但刺梨口感酸涩苦、采收期短和不易贮藏的特点影响了其鲜果销售，需要对其二次加工，而早在清代已有刺梨果酒的酿制，现代研究表明，刺梨发酵成的果酒香气突出、酒体稳定而澄清，具有酿造刺梨果酒的优势[5-7]。
果酒是水果破碎或压榨后经发酵酿制而成的低酒精度（约7%vol～18%vol）发酵酒[8]，因其酒精度低、营养丰富、果香浓郁等特点而深受消费者喜爱[9]。刺梨果酒的研究集中在发酵方式对果酒品质影响[10]、疾病改善[11]、复合果酒[12-13]等方面。决定果酒品质的重要因素是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[14]，所以优质刺梨果酒酿造的关键是选择适宜的酿酒酵母。贺红早等[15]研究表明，采用M05活性贝酵母（Saccharomyces bayanus）发酵的刺梨果酒具有和谐的无籽刺梨果香；赵湖冰等[16-17]从刺梨中分离1株产香浓郁的非酿酒酵母菌株F13以及1株可增加刺梨果酒中挥发性物质的葡萄汁有孢汉逊酵母；于志海等[18-19]分离出1株与商用酵母类似性能的优良菌株Saccharomyces cerevisiae CZ，同时经过对比9株酵母菌（包括6株商用酿酒酵母、1株天然酿酒酵母和2株非酿酒酵母）的发酵特性发现，菌株Actiflore RMS2（Laffort）较适宜刺梨果酒酿造；本课题组从贵州不同地区刺梨中筛选出3株具有刺梨果酒酿造优势的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）GL14、热带假丝酵母（Candida tropicalis）GP21、热带假丝酵母GP24[20]。但是，还未筛选用于刺梨果酒发酵优良的商用酵母菌株。
本研究以刺梨原汁为研究对象，以3种商用酿酒酵母（安琪葡萄酒活性干酵母BV818，酿酒酵母ST，安琪葡萄酒果酒酵母SY）为发酵菌种制备刺梨果酒，对刺梨果酒发酵过程中的理化指标（总酸、残糖、甲醇、酒精度、总酯）以及挥发性风味物质进行分析，以期筛选出一种适宜刺梨果酒酿造的商用酿酒酵母，为刺梨的工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌株
刺梨原汁（pH为3.4，糖度为2.8°Bx）：贵州恒茂源生物科技有限公司；安琪葡萄酒活性干酵母BV818、安琪葡萄酒果酒酵母SY：安琪酵母股份有限公司；酿酒酵母ST：法国LAFFORT公司。
1.1.2 试剂
无水乙醇（分析纯）：昆山金城试剂有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；甲醇标准溶液、硫酸、酚酞、氯化钠、品红、草酸、磷酸、福林酚、2-辛醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；高锰酸钾、氢氧化钠（均为分析纯）：成都金山化学实验；无水葡萄糖、琼脂粉、蛋白胨、酵母浸粉（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：以10 g/L的酵母浸粉，20 g/L的蛋白胨，再加上20 g/L的无水葡萄糖，配制成溶液，在115 ℃、0.1 MPa的高压蒸汽灭菌锅中灭菌30 min。固体培养基中添加20 g/L的琼脂粉[21]。
1.2 仪器与设备
UV-8000ST紫外线分光光度计：上海元析仪器有限公司；SHP-250恒温生化培养箱：上海森信实验有限公司；TD32手持式糖度仪、LDZF-30L立式高压蒸汽灭菌器、BGG-9410A鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；Agilent 7890B-5977A气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪：安捷伦科技（中国）有限公司；NHWY-2102卧式恒温摇床：常州洛基仪器有限公司；DL-CJ-2NDI超净工作台：上海川宏实验仪器有限公司；DK-S24恒温水浴锅：江苏中大仪器科技有限公司；ACS-D11电子分析天平：上海箐海仪器有限公司；25 mL附温度计密度瓶：崇明建设玻璃仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种的活化
无菌条件下分别取3种不同的商业酿酒酵母各1 g于25 ml试管中，加入10 mL冷却至室温的5%无菌糖水当中，在28 ℃、180 r/min条件下的卧式恒温摇床中培养30 min进行活化，将活化液置于40 ℃的恒温生化培养箱中培养30 min制备菌悬液[22-24]。
1.3.2 刺梨果酒的加工工艺流程及操作要点
刺梨原汁→成分调整→接种、发酵→成品
操作要点：
成分调整：刺梨原汁（pH为3.4，糖度为2.8°Bx），加入白砂糖浆调糖度为22°Bx，再加入100 mg/L的偏重亚硫酸钾（SO2质量浓度为50 mg/L），用柠檬酸调pH为4.6～5.0[22]。
接种：将活化后酵母菌悬液按照5%（V/V）的接种量接种于成分调整后的刺梨原汁，摇晃均匀[25]。
发酵：接种完毕后，置于28 ℃恒温培养箱中进行发酵，在发酵24 h后按8 g/100 mL向发酵液中补加白砂糖继续发酵，当发酵液不再产生气泡且酒精度稳定时结束发酵，发酵18 d即得刺梨果酒成品。
1.3.3 刺梨果酒理化指标及挥发性风味成分的检测
在刺梨果酒的发酵过程中，选择测定时间间隔为3 d，选取发酵时间分别为3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d的发酵液进行各项指标的测定。
（1）理化指标的测定
总酸含量的测定：参照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[26]；总酯含量的测定：参考GB/10345—2022《白酒分析方法》的中和滴定法[27]；甲醇含量的测定：参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》比色法[26]；残糖含量的测定：采用糖度计[28]；酒精度的测定：参考GB 5009.225—2023《酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》中的密度瓶法[29]。
（2）挥发性风味成分的测定
采用顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）结合GC-MS法测定刺梨果酒中的挥发性风味成分[30-31]。
顶空固相微萃取条件：在顶空瓶中加入样品10 mL，加入1.5 g氯化钠用以加快盐析速率，加入100 μL 2-辛醇（1.62 mg/L）作为内标物，振荡拧紧瓶塞。样品预热5 min，50 ℃萃取50 min，进行气质联用技术检测。
GC条件：VF-WAXms型色谱柱（250μm×60m×0.50μm）；载气为超纯氮气（N2），载气流速为1 mL/min；进样口温度为250 ℃，检测程序中升温程序为初始温度50 ℃，保持时间2 min，以5 ℃/min升温至180 ℃，以8 ℃/min升温至240 ℃，保持时间15 min；进样量为0.5 μL/min，分流比为1∶5；分流流量为7.5 mL/min。MS条件：采用电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，质量扫描范围35～550 m/z，扫描方式Scan。
定性定量分析：分析得到的离子图谱经Wiley谱库和美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology, NIST）2.0 谱库检索，仅保留匹配度60以上的物质定性；采用内标法定量。
2 结果与分析
2.1 刺梨果酒发酵过程中残糖含量及酒精度的变化
刺梨果酒发酵过程中残糖含量及酒精度的变化见图1。果酒中的残糖含量是评价菌种酿造性能的重要指标之一，残糖量越低说明该菌株的发酵能力越强[32]。由图1a可知，从开始发酵到发酵时间分别为12 d、9 d、15 d时，残糖含量均呈现先快速下降趋势；之后酵母ST、BV818、SY残糖含量趋于稳定，这是由于酵母在发酵期间生长繁殖需要糖类物质提供能量，因此残糖量会随发酵时间的增加而降低[33]。当发酵结束时，酵母BV818、ST、SY发酵果酒的残糖含量分别为8.6°Bx、9.4°Bx、10.7°Bx，酵母BV818在其中发酵能力较强且发酵速度较快，其次是酵母ST，酵母SY发酵能力较弱，残糖量最高。
图1 刺梨果酒发酵过程中残糖含量（a）及酒精度（b）的变化
Fig.1 Changes of residual sugar content (a) and alcohol content (b)of Rosa roxburghii wine during fermentation process
酿酒酵母的产酒精能力是权衡酵母发酵性能的重要指标，葡萄糖在酿酒酵母的作用下通过糖酵解分解成为丙酮酸，丙酮酸在脱氧氢酶的催化下生成乙醛和二氧化碳，乙醛被还原成为乙醇[33]。由图1b可知，酵母ST、BV818、SY从开始发酵到发酵时间分别为12 d、9 d、15 d时，酒精度均呈现先快速增加的趋势；之后酒精度趋于稳定，发酵结束时，酵母BV818、ST、SY制备果酒的酒精度分别为12.6%vol、12.3%vol、11.3%vol，结果表明，酵母BV818发酵能力较强。
2.2 刺梨果酒发酵过程中总酸含量的变化
刺梨中富含的酸性物质影响刺梨果酒的口感风格和典型性，有效降酸有利于提高刺梨果酒口感平衡度[34-35]。刺梨果酒发酵过程中总酸含量的变化见图2。由图2可知，酵母ST、BV818、SY从开始发酵到发酵时间分别为15 d、15 d、12 d时，总酸含量均呈现先快速下降的趋势；之后总酸含量趋于稳定，其原因可能是刺梨果酒中的酸与发酵产生的乙醇发生酯化反应，酸类物质被消耗，直到发酵结束[36]。发酵结束时，制备果酒的总酸含量分别为8.3 g/L、6.9 g/L、10.2 g/L。其中，酵母BV818降酸效果最明显，其次是酵母ST，而酵母SY降酸效果相对较弱。根据NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》[37]，标准规定果酒中总酸含量为4～9 g/L，酵母BV818和ST发酵果酒总酸含量符合该标准，而酵母SY发酵果酒的总酸含量偏高。结果表明，酵母BV818降酸效果最明显，且总酸含量符合相关行业标准。
图2 刺梨果酒发酵过程中总酸含量的变化
Fig.2 Change of total acid content in Rosa roxburghii wine during fermentation process
2.3 刺梨果酒发酵过程中总酯含量的变化
酯类是果酒的主要香味物质，一般发酵液中的侧链脂肪酸转化为酮酸，生成的酰基辅酶A与醇类物质形成特殊的脂肪酸酯[38]。刺梨果酒发酵过程中总酯含量的变化见图3。由图3可知，随着发酵时间延长，刺梨果酒的总酯含量总体上均呈现先升高后下降的趋势；酵母BV818、ST、SY分别在发酵时间为9 d、15 d、12 d时，果酒总酯含量均达到最大值，分别为0.17 g/L、0.14 g/L、0.15 g/L；之后略有下降然后趋于稳定；发酵结束时，酵母BV818、ST、SY制备果酒的总酯含量分别为0.13 g/L、0.14 g/L、0.13 g/L。随着发酵时间的延长，刺梨果酒中的总酯含量略有下降，这可能是由于酿酒酵母发酵速度快，在发酵结束后酯类物质发生了分解[39]。而酵母BV818在峰值所生成的酯类物质最多的原因可能有还原性糖的影响，发酵所消耗还原性糖浓度越大，果酒中总酯含量也会越高[40]。因此，酵母BV818发酵过程中酯类物质峰值较高，产酯能力较强，3株酵母发酵刺梨果酒中最终总酯含量接近。
图3 刺梨果酒发酵过程中总酯含量的变化
Fig.3 Change of total ester content in Rosa roxburghii wine during fermentation process
2.4 刺梨果酒发酵前后甲醇含量的变化
国家标准GB 15037—2006《葡萄酒》中规定红葡萄酒中甲醇含量＜400 mg/L，白葡萄酒中甲醇含量＜250 mg/L[41]。目前，我国对葡萄酒以外其他果酒中甲醇含量并无明确限量，因此多采用葡萄酒的标准来指导发酵果酒的生产[42]。刺梨果酒发酵结束后的刺梨果酒中均出现了甲醇，其中酵母BV818、ST、SY发酵果酒中甲醇含量分别为9mg/L、15 mg/L、28 mg/L，但都远低于甲醇含量规定要求。这是因为在酿酒过程中果胶分解时会产生甲醇，而本实验中采用刺梨原汁进行发酵，刺梨原汁中果胶含量少，使得刺梨果酒发酵过程中所生成的甲醇相对较少[43]。因此，酵母BV818在刺梨果酒发酵过程中产甲醇含量最低，对人体毒性较小。
2.5 不同酵母发酵刺梨果酒中挥发性风味成分分析
不同酵母发酵刺梨果酒中挥发性风味成分检测结果见表1。由表1可知，刺梨果酒中共检出23种挥发性风味成分，其中，酯类11种，醇类7种，酸类3种，醛酮类2种。3种酵母共同含有的挥发性风味成分有17种。其中酿酒酵母BV818发酵刺梨果酒中检测出挥发性风味成分23种，种类最丰富，酵母ST检出19种，而酵母SY检出18种；酵母BV818发酵的刺梨果酒中挥发性风味成分总含量最高（7 370.94 μg/L），其次是酵母SY（6 479.36 μg/L），最低的为酵母ST（5 102.47 μg/L），此外，酯类、醇类和酸类是刺梨果酒中含量较多的挥发性风味成分，其中酯类物质的含量为（1 253.62～2 132.13）μg/L，醇类物质的含量为（2 259.69～3 322.37）μg/L，酸类物质含量为（1 149.04～1 879.80）μg/L。
表1 不同酵母发酵刺梨果酒中挥发性风味成分检测结果
Table 1 Detection results of volatile flavor components in Rosa roxburghii wine fermented by different yeasts
注：“a”，香气特征参考http：//www.Thegoodscentscompany.com/；“-”表示未检测出该物质。
种类 化合物名称 气味描述a[44] 含量/（μg·L-1）BV818 ST SY酯类乙酸乙酯辛酸乙酯壬酸乙酯乳酸乙酯癸酸乙酯丁酸乙酯月桂酸乙酯肉桂酸乙酯棕榈酸乙酯丁二酸二乙酯己酸乙酯凤梨香果香、脂肪香葡萄香、玫瑰香脂肪香葡萄香苹果香树叶香水果香奶油香葡萄香菠萝香144.74-97.77 101.59 115.16 608.22--醇类葡萄香麦芽香蘑菇味蜜香香料味青草香酸类脂肪香奶香水果香376.96-138.49 360.07 394.49 355.30 203.20-106.09 110.93 86.60 2 132.13 280.99 531.54 519.08 450.49 376.73 308.60-2 467.43 1 538.61 137.99 203.20 1 879.80醛酮类小计乙醇2-丁醇异戊醇1-庚醇异丁醇苯乙醇顺-3-乙烯醇小计乙酸癸酸辛酸小计5-羟甲基糖醛2-壬酮小计总计甘菊花味热牛奶味122.25 193.40 132.70 234.49 134.60 103.56 365.11 120.72 97.90 145.55 98.70 1 748.98 319.36 167.93 594.46 455.40 98.85 1 448.17 238.20 3 322.37 1 057.18 51.12 40.74 1 149.04 82.16 1 068.39 1 150.55 7 370.94 23.55 87.38 75.21 1 253.62 250.64 264.85 742.60 124.37 354.59 343.26 179.38 2 259.69 1 208.18 60.34 110.74 1 379.26-209.90 209.90 5 102.47-- 0 6 479.36
2.5.1 酯类物质
酯类物质是果酒发酵过程以及陈酿期间的酸类物质与醇类物质发生酯化反应所形成，是果酒中香气形成的重要物质之一[45]。在3种酿酒酵母发酵的刺梨果酒中，酵母SY所发酵的刺梨果酒中酯类物质总含量最高，为2 132.13μg/L，其次是酵母BV818（1 748.98 μg/L），酵母ST最低（1 253.62 μg/L），这与图4结果相符。其中乙酸乙酯、壬酸乙酯、乳酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、棕榈酸乙酯、丁二酸二乙酯和己酸乙酯是3种酿酒酵母发酵的刺梨果酒中共有的酯类物质。大多数酯类具有花香、果香、脂肪香，酵母BV818发酵的果酒中独特含有辛酸乙酯（193.40 μg/L）和肉桂酸乙酯（120.72 μg/L），可赋予果酒令人愉快的花果香气、杏子香气。因此，酵母SY所发酵的刺梨果酒中酯类物质总含量较高，而酵母BV818中种类较丰富，含有2种独特的酯类香味物质。
2.5.2 醇类物质
酵母BV818发酵刺梨果酒醇类物质含量最高，为3 322.37 μg/L、其次是酵母SY（2 467.43 μg/L）、酵母ST（2 259.69 μg/L），共有的醇类物质为乙醇、2-丁醇、异戊醇、1-庚醇、异丁醇、苯乙醇。高级醇是刺梨果酒各香气成分中易挥发出的物质，刺梨果酒中含量较高的高级醇有呈麦芽香的异戊醇（519.08～742.60 μg/L），高于其余高级醇的含量。异戊醇在果酒中呈现出麦芽酒香，是果酒香气成分中的代表物质之一[45]。此外，酵母BV818发酵刺梨果酒中的苯乙醇含量（1 448.17 μg/L）约为其余两种酵母的4倍，可赋予果酒独特香味，具有玫瑰香、紫罗兰香、茉莉花香等多样风味[46]。
2.5.3 酸类物质
酵母SY发酵刺梨果酒酸类含量最高，为1 879.80 μg/L，其次是酵母ST（1 379.26 μg/L）、酵母BV818（1 149.04 μg/L），共有的酸类物质为乙酸、辛酸、癸酸。其中，脂肪酸会与果酒发酵产生的不良风味产生联系，高浓度时则会出现腐败的刺激性气味，浓度较低时挥发出奶油等令人愉悦的风味，根据刘玮等[47]的研究，辛酸的浓度过高，会给果酒的口感带来很大的影响。酵母BV818发酵刺梨果酒中总酸含量低，其中辛酸含量较低（40.74 μg/L），较适于刺梨果酒发酵，而酵母ST和酵母SY中辛酸含量较高，分别为110.74 μg/L和203.20 μg/L。
以上结果表明，酵母BV818所发酵刺梨果酒中香气物质总含量最高，香味物质种类较丰富，特别含有花果香气、杏子香气的辛酸乙酯和肉桂酸乙酯，其具有玫瑰香、紫罗兰香的苯乙醇含量约为其余两种酵母的4倍，此外，其富含甘菊花味的5-羟甲基糖醛和热牛奶味的2-壬酮。
3 结论
本文采用3种不同的商用酿酒酵母发酵刺梨果酒。结果表明，酵母BV818在发酵过程中发酵能力较强，经其发酵的刺梨果酒中具有较低的残糖含量（8.6°Bx）和较高的酒精度（12.6%vol），该刺梨果酒中总酸含量为6.9 g/L，总酯含量为0.13 g/L，甲醇含量较低。此外，GC-MS测定结果表明，酵母BV818发酵刺梨果酒中挥发性风味物质总含量最高（7.37 mg/L），香味物质种类丰富，果酒中特别含有酯类物质辛酸乙酯和肉桂酸乙酯。综上，相比于酵母ST和酵母SY，酵母BV818更适用于刺梨果酒的酿制，本研究为发酵刺梨果酒酵母的选用提供一定参考。
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