乳制品虽含有丰富的营养，但是因为部分消费者体内缺乏乳糖酶，从而限制了他们对牛奶和乳制品的消费[1]。某些人群由于存在遗传变异，其小肠内乳糖酶的产生会随着时间的推移而减少，亚洲人、南非人和南美原住民其乳糖酶产生减少的发生率最高[2-3]。据调查，我国成人表现出乳糖不耐受症状的约为55%，缺乏乳糖酶的比例约为89%。该类人群可通过减少或避免牛奶及其衍生物的摄入，达到减少乳糖不耐受引起的胃肠道症状的目的[4]。
由于人体肠道内的乳糖酶活性低，极易受损，恢复也慢，因此与人类健康密切相关。目前国内乳制品企业通过添加β-半乳糖苷酶酶解乳制品中的乳糖，生产无乳糖酸奶，满足乳糖不耐消费者的需求[5]。消费者对不含乳糖的乳制品需求不断增长，无乳糖乳制品行业呈现增长趋势[6-8]。无乳糖宣称需要符合国标GB 28050—2011《预包装食品营养标签通则》的定义，乳糖含量低于0.5 g/100 g。无乳糖酸奶配合天然甜味剂不仅保留了酸奶的风味和营养，还提供较低的热量[9]。赤藓糖醇的外观是白色粉末，由葡萄糖发酵制得，甜度较低，但具有接近蔗糖的甜味，其特性有低热量值、无毒副作用、高耐受性等[10]。甜菊糖苷、罗汉果苷都是天然甜味剂，但添加量高会出现后苦味[11]，需进行合理的复配，为成品提供自然的甜味。该试验以赤藓糖醇、甜菊糖苷、罗汉果苷作为甜味原料，用乳糖酶分解酸奶中的乳糖，提高酸奶甜度，并采用响应面法对试验工艺进行优化，为无乳糖酸奶的研发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤藓糖醇：山东保龄宝生物有限公司；乳糖酶Maxilact LGX 5000（活力≥5 000 NLU/g）：帝斯曼贸易（上海）有限公司；乳酸菌YoFlex：科汉森有限公司；乳糖检测试剂盒（检出限8 mg/L，定量限10 mg/L）：北京智微科技有限公司；罗汉果苷：湖南华城生物股份有限公司；生牛乳：光明乳业有限公司；甜菊糖苷：莱茵生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
APV1000高压均质机：斯必克流体有限公司；LVDV-2T黏度计：广州市东南科创科技有限公司；SPX-250B生化培养箱：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 无乳糖酸奶制备工艺流程及操作要点
生牛乳→水合（加入赤藓糖醇、甜菊糖苷、罗汉果苷）→均质→杀菌→降温→接种（加入乳糖酶）→发酵→破乳→冷却→无乳糖酸奶
操作要点：
水合：以200 mL生牛乳为基准，赤藓糖醇、甜菊糖苷、罗汉果苷添加量为5%，0.005%，0.005%，持续搅拌至混合均匀。
均质：将混合液在低压5～8 MPa、高压20～25 MPa条件下均质二次。
杀菌：95 ℃杀菌10 min。
接种：料液冷却至42 ℃，加入乳酸菌YoFlex 0.01%及乳糖酶0.05%。
发酵：置于42 ℃恒温箱中进行酸奶发酵，发酵时间设定为5 h。破乳：发酵完成后，将酸奶搅拌均匀。冷却：放入4 ℃冰箱冷藏保存。
1.3.2 无乳糖酸奶指标的测定
酸度的测定：采用酚酞指示剂法检测酸度；乳糖的测定：采用试剂盒法检测乳糖残留量；黏度的测定：采用黏度计64#转子测定，扭矩10%～100%，转速40 r/min，测定时间30 s后读数。
1.3.3 产品感官评定
选定10名专业感官分析人员组成评定小组，样品以三位数字随机编码，取样品50 mL，置于品评杯中，在感官评定室进行品评。感官评定员对无乳糖酸奶的组织状态（满分25分），质地（满分25分），酸甜度（满分25分），风味（满分25分），进行打分，各项指标分数之和为总得分，将总得分取平均值作为最终得分，感官品质综合评价标准见表1。
表1 无乳糖酸奶感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation criteria of lactose-free yogurt
品评项目 评分标准 评分/分组织状态质地甜酸度风味无明显颗粒，无乳清析出（17～25）少量颗粒，少量乳清析出（9～16）明显颗粒，明显乳清析出（1～8）质地细腻、均匀（17～25）质地均匀，少量颗粒（9～16）质地粗糙，明显颗粒（1～8）酸甜适口，无甜味剂后苦，金属味等（17～25）酸甜略不协调，少量甜味剂后苦，金属味等（9～16）酸甜不协调，甜味剂后苦，金属味等（1～8）具有浓郁的酸奶发酵风味（17～25）具有酸奶发酵风味（9～16）酸奶发酵风味不足（1～8）25 25 25 25
1.3.4 单因素试验
以200 mL生牛乳为基准，设置基础条件为赤藓糖醇、甜菊糖苷、罗汉果苷、乳糖酶添加量分别为5%，0.005%，0.005%，0.05%，考察乳糖酶添加量（0.05%，0.06%，0.07%，0.08%，0.09%，0.10%，0.11%，0.12%，0.13%，0.14%，0.15%）、赤藓糖醇添加量（1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%）、甜菊糖苷添加量（0.001%，0.002%，0.003%，0.004%，0.005%，0.006%，0.007%，0.008%，0.009%，0.01%）、罗汉果苷添加量（0.001%，0.002%，0.003%，0.004%，0.005%，0.006%，0.007%，0.008%，0.009%，0.01%）对酸奶感官评分、pH、滴定酸度的影响。以上添加量均以质量分数计。
1.3.5 响应面法优化试验
以单因素试验的结果为基础，采用Box-Behnken中心组合设计原理，以赤藓糖醇（A）、甜菊糖苷（B）、罗汉果苷（C）、乳糖酶的添加量（D）为考察因素，感官评分（Y）为响应值，建立数学模型，采用4因素3水平的响应面优化，以获得无乳糖酸奶的最佳配方，响应面试验因素与水平见表2。
表2 无乳糖酸奶配方优化响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface experiments for formula optimization of lactose-free yogurt
因素A 赤藓糖醇/%B 甜菊糖苷/%C 罗汉果苷/%D 乳糖酶/%-1水平0 1 5 6 7 0.008 0.004 0.08 0.009 0.005 0.09 0.010 0.006 0.10
1.3.6 数据处理
试验重复3次，数据统计与分析使用Origin 2021及Excel软件，响应面使用Design Expert.V8.0.6.1软件进行方案设计及结果分析，数据采用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 乳糖酶添加量对无乳糖酸奶品质的影响
乳糖酶添加量对酸奶中乳糖残留量的影响见图1。
图1 乳糖酶添加量对酸奶中乳糖残留量的影响
Fig.1 Effect of lactase addition on the lactose residue of the yogurt
由图1可知，乳糖酶添加量为0.01%～0.05%时，乳糖残留量呈显著性差异（P＜0.05），当乳糖酶添加量为0.05%时，乳糖残留量低至0.08 g/100 g，酸奶中的乳糖水解完成，约提供相当于蔗糖1.5～2.0倍的甜度。乳糖酶添加量继续增大后，乳糖残留量趋于稳定。
综上可知，乳糖酶添加量超过0.05%时，都可以将酸奶内的乳糖酶解完全，符合相关国标GB 28050—2011《预包装食品营养标签通则》中无乳糖酸奶的定义，其含量低于0.5 g/100 g。有研究结果表明[12]，无乳糖酸奶具有较好的保水性、硬度和黏度等质地特性，乳糖酶的添加导致黏度的增加，口感发生变化，需进一步评价乳糖酶添加量＞0.05%时的酸度和感官评分，结果见图2。
图2 乳糖酶添加量对酸奶感官评分、pH、滴定酸度的影响
Fig.2 Effect of lactase addition on the sensory score, pH and titrated acidity of the yogurt
由图2可知，乳糖酶添加量为0.05%～0.15%时，感官评分随着乳糖酶添加量的增加呈现先升高后降低的趋势，乳糖酶添加量＞0.08%时，感官评分无显著性差异（P＞0.05）。随着乳糖酶添加量的增加，酸度逐渐上升（P＜0.05），pH逐渐下降。这是因为酸奶发酵过程中，在添加了乳糖酶的酸奶中，葡萄糖优先被乳酸菌利用进行发酵，产酸的速率呈加快趋势。该结果与文献[13]的研究结果一致。综上，当乳糖酶添加量为0.09%时，感官评分最高，甜酸比合适，质地均匀、细腻。
2.2 单因素试验结果与分析
2.2.1 赤藓糖醇添加量对无乳糖酸奶品质的影响
赤藓糖醇添加量对酸奶感官评分、pH、滴定酸度的影响见图3。由图3可知，赤藓糖醇的添加量为1%～6%时，感官评分逐渐升高，添加量为7%～10%时，感官评分呈降低趋势。酸奶的甜度随赤藓糖醇添加量的升高而升高，过低或者过高的甜度都会影响成品的感官评分，造成甜酸比失衡。滴定酸度随赤藓糖醇添加量的增加呈上升趋势，差异显著（P＜0.05），同时pH值下降，酸感逐渐上升。周金燕等[14-15]的研究表明，赤藓糖醇促进了乳酸菌的生长繁殖。乳酸菌的生长代谢也会促进乳酸的积累，从而抑制乳酸菌的生长。同时，赤藓糖醇添加量较高，在酸奶体系中形成较高的渗透压，会导致乳酸菌细胞内各种酶的活性被降低[16]。随着赤藓糖醇添加量的增加，酸奶的保水作用增强，凝胶作用也会更强，减少酸奶析水的产生。赤藓糖醇作为固形物溶解于酸奶中，总固形物的增加可以使酸奶的结构更稳定，有研究证实酸奶的硬度受到总固形物的影响，硬度随总固形物的增加而增加[17]。综上，在赤藓糖醇添加量为6%时，质地细腻，甜酸比例协调，发酵风味浓郁，感官评分最高。
图3 赤藓糖醇添加量对酸奶感官评分、pH、滴定酸度的影响
Fig.3 Influence of erythritol addition on the sensory scores, pH and titrated acidity of the yogurt
2.2.2 甜菊糖苷添加量对无乳糖酸奶品质的影响
甜菊糖苷添加量对酸奶感官评分、pH、滴定酸度的影响见图4。
图4 甜菊糖苷添加量对酸奶感官评分、pH、滴定酸度的影响
Fig.4 Effects of stevioside addition on the sensory score, pH and titrated acidity of the yogurt
由图4可知，甜菊糖苷添加量为0.001%～0.01%时，酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势，酸度呈逐渐升高趋势，差异显著（P＜0.05），pH逐渐降低。甜菊糖苷添加量0.001%～0.004%时，添加量较少，成品酸奶甜度不足，感官评分较低；添加量为0.01%时，成品酸奶甜度过高，造成甜酸比失衡。吕乐等[16-18]的研究表明，添加了甜菊糖苷的酸奶的酸度会增高，这是因为甜菊糖苷对乳酸菌的生长繁殖有促进作用。DAVOUDI S等[19]研究发现，添加合适浓度的甜菊糖苷比蔗糖和葡萄糖更容易促进乳酸菌的生长。综上，当甜菊糖苷添加量为0.009%时，感官评分最高，甜酸比合适，酸奶风味协调性好。
2.2.3 罗汉果苷添加量对无乳糖酸奶品质的影响
罗汉果苷添加量对酸奶感官评分、pH、滴定酸度的影响见图5。由图5可知，感官评分随着罗汉果苷添加量的增加呈现先升高后降低的趋势，添加量为0.001%～0.003%时，甜味明显不足，感官评分偏低；在添加量为0.005%时，感官评分最高，添加量为0.006%～0.01%时甜度过高，感官评分降低。罗汉果苷添加量为0.001%～0.01%时，酸度呈逐渐升高趋势，且差异显著（P＜0.05），pH逐渐降低。祝玉婷等[20]的研究表明，添加罗汉果苷的酸奶黏度会升高，黏度指标受到酪蛋白凝胶性的影响。发酵过程中，乳糖被乳酸菌分解，产生了乳酸，导致酸度上升，pH值下降。当pH下降至酪蛋白的等电点以下时，酪蛋白凝集成立体网状结构[21-22]，并出现黏度上升。随着酸奶的发酵，乳酸菌产生胞外多糖，进一步提高了酸奶黏度。胞外多糖分子间形成的静电排斥力，加粗了酪蛋白骨架，粒子出现碰撞结合，形成了立体网状结构，使体系黏度上升[23-25]。随着罗汉果苷添加量的增加，酸奶出现少量的析水。这可能是造成罗汉果苷酸奶感官评分下降的原因之一。综上，当罗汉果苷添加量为0.005%时，感官评分最高，甜酸比合适，质地均匀、细腻。
图5 罗汉果苷添加量对酸奶感官评分、pH、滴定酸度的影响
Fig.5 Effect of momorrhodoside addition on the sensory score, pH and titrated acidity of the yogurt
2.3 响应面优化试验结果
根据以上单因素试验的结果，由于试验因素对感官评分影响较大，因此以酸奶感官评分为评价指标对无乳糖酸奶的赤藓糖醇、甜菊糖苷、罗汉果苷、乳糖酶复配组合采用响应面方法进行4因素3水平工艺优化试验设计，利用软件设计出29组试验，试验结果见表3，方差分析见表4。
表3 无乳糖酸奶配方优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for formula optimization of lactose-free yogurt
试验号 A B C D 感官评分/分1234567891 0-1 0-1 101100-000-1-1-1 100-10110-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 000100111000-1 011100110-100--1 11000000-101000001-1 0 -1010-1 0 -1010010000-10-1 0 -10-1000000-100-100 100-10 1100 1010 85 81 92 89 84 86 78 85 84 77 85 88 81 90 79 77 78 92 62 90 89 90 67 90 69 80 80 75 90
表4 回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14 ABCDA B*******AC AD BC BD CD A2 B2 1 560.66 80.08 954.08 48 5.33 0.25 6.25 6.25 72.25 6.25 16 122.93 203.66 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 111.48 80.08 954.08 48 5.33 0.25 6.25 6.25 72.25 6.25 16 122.93 203.66 15.67 11.25 134.09 6.75 0.75 0.035 0.88 0.88 10.15 0.88 2.25 17.28 28.62＜0.000 1 0.004 7＜0.000 1 0.021 1 0.401 2 0.854 0 0.364 5 0.364 5 0.006 6 0.364 5 0.155 9 0.001 0 0.000 1******
续表
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性C2 D2 22.59 9.50 0.000 3 0.008 1****残差失拟项纯误差总误差160.76 67.6 99.62 83.58 16.03 1 660.27 111 4 10 4 28 160.76 67.6 7.12 8.36 4.01 2.09 0.249 5
使用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行数据分析，通过软件对表中数据进行多项式对数据进行回归拟合，得到感官评分（Y）与自变量赤藓糖醇（A）、甜菊糖苷（B）、罗汉果苷（C）、乳糖酶（D）的回归方程式为：
Y=90.04+2.58A+8.92B+2.00C+0.67D-0.25AB+1.25AC+1.25AD-4.25BC-1.25BD-2.00CD-4.35A2-5.6B2-4.98C2-3.23D2
为检测回归方程的有效性，对方程的有效性进行分析，分析可得模型P值＜0.000 1，说明该模型极显著，失拟项不显著（P值=0.249 5＞0.05）。模型的决定系数R2为0.94，调整决定系数R2=0.88，该模型与实际情况拟合较好，表明试验可靠性高。由表4可知，由P值可知，一次项A、B，交互项BC，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）；一次项C对结果影响显著（P＜0.05）；其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，影响感官评分的因素次序为：甜菊糖苷（B）＞赤藓糖醇（A）＞罗汉果苷（C）＞乳糖酶（D）。
2.4 多因素交互作用响应面分析
各因素交互作用对酸奶感官评分影响的响应面和等高线分析结果见图6。由图6可知，各响应曲面呈向上的凸面，说明感官评分存在极大值，甜菊糖苷与罗汉果苷交互作用响应曲面陡峭，其交互作用对感官评分影响显著（P＜0.05），其他因素间交互作用响应曲面较陡峭，对感官评分有一定影响。
图6 各因素交互作用对无乳糖酸奶感官评分影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the sensory score of the lactose-free yogurt
经过响应面软件Design-Expert.V8.0.6.1分析可得最佳配方参数为赤藓糖醇添加量6.26%、甜菊糖苷添加量0.009 8%、罗汉果苷添加量0.004 9%、乳糖酶添加量0.093%，感官评分预测值为93.9分。为方便实际操作，将无乳糖酸奶配方修正为：赤藓糖醇添加量6%、甜菊糖苷添加量0.01%、罗汉果苷添加量0.005%、乳糖酶添加量0.09%。在此优化条件下，无乳糖酸奶感官评分实际值为94分，与预测值接近，说明响应面法优化的结果可信度较大，数据结果拟合度良好。
2.5 理化及微生物指标
酸奶中蛋白质含量3.1 g/100 g，乳糖含量为0.08 g/100 g，符合相关国标GB 28050—2011《预包装食品营养标签通则》无乳糖酸奶的定义（乳糖含量低于0.5 g/100 g）。微生物指标可以判定成品饮料的安全性。成品饮料菌落总数、大肠杆菌、霉菌及酵母等常见微生物均未检出，无食品安全风险，符合GB/T 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》要求。
3 结论
本研究以赤藓糖醇、甜菊糖苷、罗汉果苷作为甜味剂，使用乳糖酶酶解酸奶中的乳糖制备无乳糖酸奶。经响应面优化得出的最佳方案为赤藓糖醇添加量6%、甜菊糖苷添加量0.01%、罗汉果苷添加量0.005%、乳糖酶添加量0.09%，此条件下的无乳糖酸奶感官评分为94分，与预测值拟合度高，结果可信度较大。本研究为无乳糖酸奶开发技术及甜味剂应用提供了技术及理论支持。
[1]BURGESS K.Milk and dairy products in human nutrition[J].Dairy Technol,2014,67:303-304.
[2]FORSGARD R A.Lactose digestion in humans:intestinal lactase appears to be constitutive whereas the colonic microbiome is adaptable[J].Clin Nutr,2019,110:273-279.
[3]ENATTAH N S,SAHI T,SAVILAHTI E,et al.Identification of a variant associated with adult-type hypolactasia[J].Nat Genet,2002,30:233-237.
[4]BAYLESS T M, BROWN E, PAIGE D M.Lactase non-persistence and lactose intolerance[J].Curr Gastroenterol,2017,19:23.
[5]MOREIRA T C TRANSFELD S Á,FAGUNDES C,et al.Elaboration of yogurt with reduced level of lactose added of carob(Ceratonia siliqua L.)[J].LWT-Food Sci Technol,2017,76:326-329.
[6]JORGENSEN C E,ABRAHAMSEN R K,RUKKE E O,et al.Processing of high-protein yoghurt-a review[J].Dairy J,2019,88:42-59.
[7]NEVES L N,DE OLIVEIRA M A L.Assessment of enzymatic hydrolysis of lactose in lactose-free milk production-a comparative study using capillary zone electrophoresis and cryoscopy[J].LWT-Food Sci Technol,2021,138:110585.
[8]SKRYPLONEK K,HENRIQUES M,GOMES D,et al.Characteristics of lactose-free frozen yogurt with κ-carrageenan and corn starch as stabilizers[J].Dairy Sci,2019,102:7838-7848.
[9]王艳宏，栾宁，樊建，等.中药功能性软糖的研究进展[J].中国中药杂志，2019，44（24）：5345-5351.
[10]肖素荣，李京东.赤藓糖醇的特性及应用[J].中国食物与营养，2008（5）：26-28.
[11]刘杰.甜菊糖苷中莱鲍迪A苷的研究[D].无锡：江南大学，2010.
[12]BERBER M,GONZALEZ-QUIJANO G K,ALVAREZ V B.Whey protein concentrate as a substitute for non-fat dry milk in yogurt[J].Food Process Technol,2015,6:1000530.
[13]贾凌云，胡志和，薛璐，等.不同温度发酵无乳糖酸奶与普通酸奶差异性比较[J].食品科学，2019，40（23）：79-90.
[14]周金燕.甜菊糖甜味特性与食品应用研究[D].无锡：江南大学，2011.
[15]陈文，刘璇，杨春晓，等.赤藓糖醇生产及在食品工业上应用的研究进展[J].食品工业，2018，39（2）：266-269.
[16]吕乐，张可毅，赵鹏，等.乳酸菌USTB-08的高效培养和生产乳酸[J].北京科技大学学报，2012，34（5）：602-607.
[17]范宇，陈历俊，赵常新.酸奶质构影响因素研究进展[J].中国乳品工业，2009，37（7）：30-34.
[18]吴惠娟.天然甜味剂甜菊糖的应用与发展前景[J].食品界，2019，9（1）：96-98.
[19]DAVOUDI S,BEHBAHANI M,SHIRANI E,et al.Influence of sucrose,glucose,stevia leaf and sativoside on the growth and lactic acid production by Lactobacillus plantarum,Lactobacillus brevis and Lactobacillus casei[J].Iran J Sci Technol,2016,40(4):275-279.
[20]祝玉婷，胡志和，霍辰辰，等.添加复配糖对凝固型酸奶品质的影响[J].食品工业科技，2022，43（12）：268?282.
[21]沈辉.酸乳发酵凝乳过程中的理化性质和生物活性[J].无锡轻工大学学报，2000，19（5）：443-445.
[22]杨同香，王芳，李全阳.温度对酸乳中乳酸菌胞外多糖作用机制的研究[J].食品工业科技，2012，33（9）：58-61.
[23]HOSSAIN M K,KEIDEL J,HENSEL O,et al.The impact of extruded microparticulated whey proteins in reduced-fat,plain-type stirred yogurt:Characterization of physicochemical and sensory properties[J].LWTFood Sci Technol,2020,134:1099776.
[24]李佳伟，虞宁馨，于连升，等.乳酸菌胞外多糖在食品工业中的应用研究[J].中国酿造，2023，42（6）：17-21.
[25]陈娟，于斌，郭宗明，等.植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌微胶囊酸奶的研制[J].中国酿造，2024，43（1）：210-215.