晋西北酸粥是以糜米（Panicum miliaceum）为主料，经常温自然发酵而成的传统发酵食品[1]。晋西北酸粥，具有上千年的食用历史，不仅酸爽可口、风味独特[2]，而且具有消食健胃、生津止渴的作用，所以是当地居民主食中的必备佳品。
胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）指乳酸菌分泌到细胞外的荚膜多糖或粘液多糖[3]，其是一种安全的生物大分子[4]，具如下多种生物活性：①抗氧化。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）[4]、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）[4]、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）[4]、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）[4]、格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）[5]的EPS均对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼有不同程度的清除活性。②抗肿瘤。格氏乳杆菌的EPS 能抑制HeLa细胞的增殖[6]，植物乳杆菌NCU116的EPS能增加升高促凋亡基因的表达来抑制癌细胞增殖[7]。③抗炎。副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）和植物乳杆菌的EPS可以促进巨噬细胞增殖和促炎因子的释放[6]，戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）的EPS可促进肿瘤坏死因子-α、白介素的释放[8]。④降低胆固醇。副干酪乳杆菌的EPS可将胆固醇溶液中的胆固醇降低至70.78%[9]。⑤预防糖尿病。植物乳杆菌的EPS可降低胰岛素抵抗HepG2细胞株中α-淀粉酶的表达，增加葡萄糖转运蛋白-4、蛋白激酶B和腺苷酸活化蛋白激酶的基因表达，促进细胞对葡萄糖的吸收[10]。⑥抗病毒。德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）OLL1073R-1的EPS可上调猪肠上皮细胞中干扰素相关基因的表达，显著提高其抗病毒活性[11]。⑦作为免疫调节剂。瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）LZ-R-5的EPS能促进巨噬细胞增殖、增强酸性酶活性和促进细胞因子的产生来增强免疫调节活性[12]，干酪乳杆菌的EPS能使细胞免疫活性增强[13]。⑧抗生物膜。融合魏斯氏菌（Weissella confusa）的EPS对白色念珠菌SC5314的生物膜抑制率达到70%等[14]。因此，EPS在食品、化妆品、生物医药和组织工程等行业应用广泛[15]。
不同乳酸菌的胞外多糖产量不同。干酪乳杆菌的EPS产量为50～130 mg/L[16-18]，副干酪乳杆菌副干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）M5L 的EPS 产 量 为167.2 mg/mL[19]，发酵黏液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）的EPS产量为307.53 mg/L[20]，植物乳杆菌C88的EPS产量为2g/L[21]，植物乳杆菌LPC-1的EPS产量为2.06g/L[22]，长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp.infantis）BF66-16的EPS产量为513.06 mg/L[23]。迄今为止，对乳酸菌EPS的研究中，除了肠膜明串珠菌的右旋糖酐已工业化外，其他乳酸菌的EPS产量较低，制约了其发展。因此，需要不断摸索条件来提高EPS的产量。
研究表明，分离自我国西藏酸马奶酒中的短乳杆菌的EPS产量为160 mg/L[24]。该研究以分离自晋西北酸粥、并能产生胞外多糖（EPS）的短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）M-10为研究对象[25]，采用MRS培养基，在优化碳源、氮源的基础上，通过单因素试验和响应面试验，对短乳杆菌M-10产EPS的发酵工艺进行优化。分别考察发酵温度、发酵时间、初始pH值和接种量对菌株M-10产胞外多糖（EPS）的影响，旨在最大程度地获得胞外多糖（EPS），为短乳杆菌M-10胞外多糖开发为功能性食品奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）M-10：本实验室保存于含有甘油（30%，V/V）的MRS液体培养基中，-80 ℃保藏，使用前30 ℃活化3次。
1.1.2 化学试剂
葡萄糖、酵母膏、果糖、吐温-80、牛肉膏、蔗糖、胰蛋白胨、乙酸钠、蛋白胨、磷酸氢二钾、大豆蛋白、七水硫酸锰、苯酚、柠檬酸二铵、三氯乙酸、四水硫酸锰、无水乙醇、甘油、透析袋（截留分子质量8 000～14 000 Da）：索莱宝生物工程股份有限公司；浓硫酸、浓盐酸：山西国药集团有限公司。试验所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
MRS培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，乙酸钠5 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸镁0.58g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温-801mL/L，蒸馏水1 L，pH值调至6.2～6.4。121 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
SPX-250B-Z型生化培养箱、BXM-30R型高压蒸汽灭菌器：上海博迅工业有限公司医用设备厂；Centrifuge5430R型高速冷冻离心机：德国艾本德公司；TU-1810型紫外可见光分光计：北京普析通用仪器有限责任公司；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 短乳杆菌M-10的种子液及发酵液的制备
从甘油管中吸取50 μL菌液接种于3 mL MRS液体培养基，30 ℃静置活化培养12～16 h至对数中期，得到短乳杆菌M-10种子液。将短乳杆菌M-10种子液按3%（V/V）接种量接种于MRS培养基中，于30 ℃静置培养48 h，得到短乳杆菌M-10发酵液。
1.3.2 胞外多糖的制备及含量测定
胞外多糖提取方法参考XIU L等[13]方法稍作修改。将短乳杆菌M-10发酵液于4 ℃、10 000 r/min条件下离心20 min，取上清液加入体积分数为80%三氯乙酸去除蛋白，使其终浓度为4%，4 ℃静置12 h后于4 ℃、10 000 r/min条件下离心20 min。向上清液加入3倍体积的无水乙醇，4 ℃条件下静置12 h 后于4 ℃、10 000 r/min条件下离心20 min。将沉淀溶解于蒸馏水中，装入透析袋中透析48 h（每间隔4 h换一次水），再经真空浓缩、冷冻干燥即得到胞外多糖。
胞外多糖含量：采用苯酚-硫酸法[26]测定。
1.3.3 短乳杆菌M-10产胞外多糖培养基碳源及氮源优化
碳源种类及最佳碳源添加量对EPS产量的影响：向MRS培养基（初始pH 6.2）中接种2.0%（V/V）短乳杆菌M-10，设置葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖添加量均为20 g/L，于30℃静置培养48h，考察不同碳源对EPS产量的影响。在确定最佳碳源的基础上，设置最佳碳源添加量分别为10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，通过测定EPS产量确定最佳碳源的添加量。
氮源种类及最佳氮源添加量对EPS产量的影响：向MRS培养基（初始pH 6.2）中接种2.0%（V/V）短乳杆菌M-10，设置酪蛋白、胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白胨和氯化铵添加量均为10 g/L，于30 ℃静置培养48 h，考察不同氮源对EPS产量的影响。在确定最佳氮源的基础上，设置最佳氮源添加量分别为5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L，通过测定EPS产量确定最佳氮源添加量。
1.3.4 短乳杆菌M-10产胞外多糖发酵工艺优化
（1）单因素试验
发酵温度的选择：向MRS培养基接种2.0%（V/V）短乳杆菌M-10，分别在发酵温度20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃条件下培养，考察不同发酵温度对EPS产量的影响。
发酵时间的选择：向MRS培养基接种2.0%（V/V）短乳杆菌M-10，分别在发酵时间为36 h、48 h、60 h、72 h、84 h条件下培养，考察不同发酵时间对EPS产量的影响。
初始pH值的选择：向MRS培养基接种2.0%（V/V）短乳杆菌M-10，分别在5.0、5.5、6.0、6.5、7.0初始pH值条件下培养，考察不同初始pH值对EPS产量的影响。
接种量的选择：向MRS培养基中分别接种0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（V/V）短乳杆菌M-10，于30 ℃静置培养72 h，考察不同接种量对EPS产量的影响。
（2）响应面试验
在单因素试验基础上，利用Design-Export 12.0软件设计Box-Behnken试验，选取发酵温度（A）、发酵时间（B）、初始pH值（C）、接种量（D）为自变量，以EPS产量（Y）为响应值，优化短乳杆菌M-10产EPS发酵工艺。Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation process optimization
因素A 发酵温度/℃B 发酵时间/h C 初始pH值D 接种量/%-1水平0 1 30 36 6.2 0.5 35 48 6.5 1.0 40 60 6.8 1.5
1.3.5 数据处理
结果以“平均值±标准差”表示，通过SPSS 17.0软件利用Ducan多重比较法分析差异的显著性。
2 结果与分析
2.1 MRS培养基碳源和氮源的优化
2.1.1 碳源对短乳杆菌M-10EPS产胞外多糖影响
由图1A可知，五种糖为碳源短乳杆菌M-10均可产EPS，但产量差异显著（P＜0.05）；其中葡萄糖EPS产量最高，为（0.523±0.007）g/L。碳源是除水分之外微生物需要量最大的结构性营养物，构成微生物体有机分子的骨架，也是大多数微生物的能源物质。异养微生物所能利用的碳源是有机碳，其中糖类包括单糖、双糖、多糖等，这些都是优先利用的种类。异养微生物可以利用的碳源会随微生物种类的变化而变化。
图1 碳源种类（A）及葡萄糖添加量（B）对胞外多糖产量的影响
Fig.1 Effects of carbon source types (A) and glucose addition (B)on exopolysaccharides yield
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1B可知，在葡萄糖添加量为10～20 g/L时，EPS产量随之上升；葡萄糖添加量为20 g/L时，EPS产量最大，为（0.588±0.024）g/L；葡萄糖添加量＞20 g/L之后，EPS产量反而呈现下降的趋势。在葡萄糖添加量较低时，EPS产量较低，原因可能是葡萄糖仅够微生物维持基本的生长和繁殖。而随着葡萄糖添加量的增加，产生EPS的前体物质充足，因而EPS产量增大。因此，最适葡萄糖添加量为20 g/L。
2.1.2 氮源对短乳杆菌M-10EPS产胞外多糖的影响
由图2A可知，三种氮源均可以被短乳杆菌M-10所利用代谢产生EPS，但是产量差异显著（P＜0.05）。其中，蛋白胨为氮源的情况下EPS产量最高，为（0.601±0.001 3）g/L。由此可见，蛋白胨是短乳杆菌M-10生产EPS的最适氮源。
图2 氮源种类（A）及蛋白胨添加量（B）对胞外多糖产量的影响
Fig.2 Effects of nitrogen source types (A) and peptone addition (B)on exopolysaccharides yield
由图2B可知，在蛋白胨添加量为5～10 g/L时，EPS产量随之上升；在蛋白胨添加量为10 g/L 时，EPS产量达到峰值，为（0.396±0.033）g/L；在蛋白胨添加量＞10 g/L之后，EPS产量有所下降。这可能是合成微生物重要生命物质所必需的氮源缺乏，造成微生物基本的生长繁殖受限，进而对EPS的合成造成影响。在提高蛋白胨含量后，EPS产量也随之上升。因此，最适蛋白胨添加量为10 g/L。
2.2 短乳杆菌M-10EPS产胞外多糖发酵工艺优化单因素试验
由图3A可知，随着发酵温度在20～35 ℃范围内的升高，EPS产量逐步上升；在发酵温度为35 ℃时，EPS产量最高，为（0.690±0.011）g/L；在发酵温度＞35 ℃之后，EPS产量开始下降。这说明低温和高温均会显著影响短乳杆菌M-10EPS的产量，低温时菌体生长缓慢，而高温时合成EPS的酶活性降低。因此，最适发酵温度为35 ℃。
图3 发酵工艺条件对胞外多糖产量的影响
Fig.3 Effect of fermentation process conditions on exopolysaccharides yield
微生物均有自己的生长周期，不同生长周期的代谢产物不同。因此，研究获得微生物代谢物的最佳时间是非常必要的。由图3B可知，发酵时间在36～48 h时，EPS产量随之上升；发酵时间在48 h时，EPS的产量最大，为（0.459±0.008）g/L；发酵时间＞48 h之后，EPS产量有所下降，可能是菌体产生酶分解EPS的原因[22]。因此，最适发酵时间为48 h。
合适的初始pH值是微生物正常生长代谢的保障，这主要是因为初始pH值可以影响营养物质的离子化程度和细胞膜功能。由图3C可知，初始pH值为5.0～6.5时，EPS产量随之上升；初始pH值为6.5时，EPS产量最高，为（0.601±0.006）g/L；初始pH值＞6.5之后，EPS产量有所下降。这可能是乳酸菌合成EPS相关反应的酶活受到初始pH值的影响，继而对EPS产量产生影响。因此，最适初始pH值为6.5。
微生物代谢物的产量直接受接种量的影响。由图3D可知，接种量在0.5%～1.0%时，EPS产量随之升高；在接种量为1.0%（V/V）时，EPS产量最高，为（0.742±0.001）g/L。接种量＞1.0%之后，EPS产量开始缓慢回落。这说明较低的接种量会导致代谢产物产生过少；而过高的接种量则在培养基中加速了养分的消耗[17]，也使得EPS产量出现了较大幅度的下滑。因此，最适接种量为1.0%（V/V）。
2.3 短乳杆菌M-10EPS产胞外多糖发酵工艺优化响应面试验
2.3.1 发酵工艺优化Box-Behnken试验结果
在单因素试验基础上，利用Design-Export 12.0软件设计Box-Behken试验，选取发酵温度（A）、发酵时间（B）、初始pH值（C）、接种量（D）为自变量，以胞外多糖（EPS）产量（Y）为响应值，优化短乳杆菌M-10产胞外多糖（EPS）发酵工艺。Box-Behnken试验设计与结果见表2，方差分析见结果表3。
表2 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation process optimization
编号 A 发酵温度/℃B 发酵时间/h C 初始pH值D 接种量/%Y EPS产量/（g·L-1）1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40 30 40 35 35 35 35 30 40 30 40 35 35 35 35 30 40 30 40 35 35 35 35 35 35 35 35 35 36 36 60 60 48 48 48 48 48 48 48 48 36 60 36 60 48 48 48 48 36 60 36 60 48 48 48 48 48 6.5 6.5 6.5 6.5 6.2 6.8 6.2 6.8 6.5 6.5 6.5 6.5 6.2 6.2 6.8 6.8 6.2 6.2 6.8 6.8 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 1.5 1.5 0.5 0.5 1.5 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 1.5 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.81 2.04 1.70 2.20 1.24 1.05 1.22 1.49 1.32 1.10 1.20 1.45 2.07 2.12 2.27 1.78 2.16 1.50 1.30 2.42 1.52 1.30 1.63 1.47 2.45 2.45 2.44 2.46 2.45
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14 ABCDA B*****AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项净误差总离差6.88 0.124 0 0.049 4 0.000 0 0.072 1 0.018 2 0.792 1 0.055 2 0.072 9 0.000 9 0.052 9 0.902 5 0.164 5 0.666 3 5.25 0.163 7 0.136 0 0.027 7 7.04 111111111111111 4 42.04 10.61 4.23 0.000 0 6.16 1.56 67.75 4.72 6.24 0.0770 4.52 77.19 14.07 56.99 448.65＜0.000 1 0.005 7 0.059 0 1.000 0 0.026 3 0.232 3＜0.000 1 0.047 5 0.025 6 0.785 5 0.051 7＜0.000 1 0.002 1＜0.000 1＜0.000 1**** ********10 4 28 0.491 5 0.124 0 0.049 4 0.000 0 0.072 1 0.018 2 0.792 1 0.055 2 0.072 9 0.000 9 0.052 9 0.902 5 0.164 5 0.666 3 5.25 0.011 7 0.013 6 0.006 9 1.96 0.269 7
通过Design-Expert 12.0软件对表2数据进行多元线性回归分析，得到二次多项式回归模型方程为：Y=2.52+0.1017A-0.0642B+0.0000C+0.0775D+0.0675AB+0.4450AC+0.117 5AD-0.135 0BC+0.015 0BD+0.115 0CD-0.373 0A2-0.159 2B2-0.320 5C2-0.899 2D2。
由表3可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项P值=0.269 7＞0.05，不显著，表明模型具有良好拟合度；模型决定系数R2=0.976 8，调整决定系数R2adj=0.953 5，说明该模型可以解释响应值95.35%的变化。由P值可知，一次项A，交互项AC，二次项A2、B2、C2、D2对EPS产量影响极显著（P＜0.01）；一次项D，交互项AD、BC对EPS产量影响显著（P＜0.05）。由F值可知，对EPS产量影响的因素从大到小依次为：发酵温度（A）＞接种量（D）＞发酵时间（B）＞初始pH值（C）。
2.3.2 各因素交互作用响应面分析
响应曲面的斜度变陡，说明响应值受发酵因素的影响变大；等高线呈椭圆状，表示响应值受两个因素交互作用的影响较大；等高线呈圆形，则表示在响应值上，两个因素的交互作用对其的影响不大[34]。
利用Design-Expert 12.0软件得到各因素交互作用对短乳杆菌M-10产EPS影响的响应面及等高线，结果见图4。由图4a、4e、4f可知，三维曲面均有最高点出现，EPS产量呈现先增后减的规律，等高线图接近椭圆形，但等高线不密集且响应曲面较为平缓，显示发酵温度和发酵时间、发酵时间和接种量、初始pH值和接种量的交互作用对EPS产量无显著影响。图4b呈现椭圆形等高线，且响应曲面最为陡峭，表明EPS的产量受发酵温度与初始pH值交互作用的影响极显著。图4c、4d 的响应面较为陡峭，显示发酵温度和接种量的交互作用对EPS产量有显著影响，以及发酵时间和初始pH值的交互作用。这与方差分析结果一致。
图4 各因素间交互作用对胞外多糖产量影响的响应面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on exopolysaccharides yield
2.3.3 短乳杆菌M-10产EPS最佳发酵工艺条件的验证
短乳杆菌M-10经Box-Behnken试验优化后预测产生EPS的最佳发酵工艺条件为：发酵温度36.410 ℃，发酵时间45.015 h，初始pH值6.261，接种量为1.04%（V/V）。在此条件下，EPS产量预测值为（2.541±0.034）g/L。为方便实际操作，将最优发酵工艺条件调整为：发酵温度36 ℃、发酵时间46 h、初始pH值6.2、接种量1.0%（V/V）。在此优化条件下进行3次平行验证试验，EPS产量实际值为（2.54±0.13）g/L，与预测值接近，EPS产量与优化前（（0.74±0.08）g/L）相比，提高了2.42倍。
3 结论
本研究确定了短乳杆菌M-10产胞外多糖（EPS）的最佳碳源、氮源分别为20 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨。在单因素试验基础上，通过Box-Behnken响应面优化试验，得到短乳杆菌M-10产胞外多糖（EPS）的最佳发酵工艺条件为：发酵温度36 ℃、发酵时间46 h、初始pH值6.2、接种量1.0%。在此优化条件下，EPS产量为（2.54±0.13）g/L，比优化前提高了2.42倍。该研究为该胞外多糖的结构表征、生物功效和机理解析奠定了基础，同时也为工业化制备短乳杆菌M-10胞外多糖提供了技术参考。
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