失眠是指一种持续时间较长的睡眠质量不佳的状况。主要表现为睡眠困难、难以入睡、间歇性或过早觉醒而引发的睡眠不足[1]。失眠常会导致患者出现各类负面情绪，例如焦虑、抑郁等[2]。严重失眠还会提升高血压、心血管疾病死亡率和患癌的风险[3]。酸枣仁是常见的助睡眠食药同源物质，被形象地称之为“东方睡果”[4]。《神农本草经》中记载道：“酸枣仁有坚筋骨，补中益肝，助阴气之功效”[5]。有报道[6]指出，适量食用酸枣仁，有养肝敛汗、宁静安神之效。
市场上助睡眠的产品有很多，但助睡眠的酒类产品不多。《汉书·食货志》里说“酒为百药之长”，先民在饮酒的过程中逐渐发现，少量饮酒可以通经活血，振奋精神；量多则会麻醉神经，令人昏睡，因此酒最早是被作为兴奋剂和麻醉剂来使用[7]。酒应用于医药的记载最早见于长沙马王堆汉墓出土的帛书《五十二病方》，成书大约在战国时期，记载的283首药方中有酒疗方40首，制作方法包括用酒煮药物、浸渍药物等，使用方式有内服和外用[8]。
斑马鱼是可用来研究睡眠的新型生物，其与人类基因组序列相似度达到87%[9]。相比较其他实验用哺乳动物，斑马鱼具有身体透明易观察、用药少、易操作、周期短等优势[10-12]。近年来模式生物斑马鱼在肝毒性[10，13]、肾毒性[14]、神经毒性[16-15]、心脏毒性[16-17]等早期毒理学评价中的应用较广。斑马鱼和人类一样，具有正常的睡眠周期，兴奋类药物同样能够使斑马鱼快速失眠[18]，如对戊四唑（pentetrazol，PTZ）是γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）抑制剂，GABA是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，小剂量PTZ可诱导既有躁狂症又有抑郁症的双相精神障碍，从而造成失眠。以觉醒活动量（斑马鱼运动距离进行监测，反映其觉醒状态下的活动水平，失眠状态下，斑马鱼的觉醒活动量通常显著增加）和觉醒总时间（记录斑马鱼在实验期间处于清醒状态的时间段长度，作为衡量睡眠效率和睡眠结构紊乱的一个重要参数）作为样品对睡眠影响的评价指标[19-22]。
本研究以酸枣仁为主要原料，百合、枸杞为辅料，通过浸泡法制作的助眠酸枣仁复合保健酒，以斑马鱼为模型，以斑马鱼的觉醒活动量、觉醒总时间以及器官毒性发生率为评判指标进行助睡眠功效与安全性的研究。以期为酸枣仁复合保健酒申报保健食品奠定基础，为助睡眠产品的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酸枣仁复合保健酒（酸枣仁、百合、枸杞等成分）：亳州市重点实验室提供；阳性对照为某牌中药助眠保健品（与本品同为中药类助眠产品，且经预实验得出对正常受精后5 d野生型AB品系斑马鱼的最大耐受浓度（maximum tolerated concentration，MTC）为1 000 μg/mL）：购自当地药房；斑马鱼：杭州环特生物科技股份有限公司；6孔细胞培养板：浙江贝兰伯生物技术有限公司；96孔细胞培养板：无锡耐思生命科技股份有限公司；对戊四唑（pentetrazol，PTZ）：上海依赫生物科技有限公司；二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；甲基纤维素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实验所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SZX7解剖显微镜：日本OLYMPUS公司；VertA1电荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相机：上海土森视觉科技有限公司；CP214精密电子天平：美国OHAUS公司；ZebraLab3.3斑马鱼行为分析仪：法国ViewPoint公司；JP-010T超声波清洗机：深圳市洁盟清洗设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 斑马鱼饲养方法
斑马鱼均饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质要求：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450～550 μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO3），饲养管理符合国际实验动物饲养管理评估认证委员会认证的要求。
1.3.2 斑马鱼对酸枣仁复合保健酒最大耐受浓度测定
随机选取受精后5 d野生型AB品系斑马鱼于6孔细胞培养板中，每孔均喂养30尾斑马鱼，且每孔喂养体系为3 mL，实验组设计5个样品浓度梯度[初始浓度为0.20 μL/mL（每mL喂养体系中加入0.20 μL样品），每个浓度梯度间隔2倍]，正常对照组的样品添加量为0，28 ℃喂养1 d后，进行斑马鱼活动状态的观察，确定样品对斑马鱼的MTC。
1.3.3 酸枣仁复合保健酒对模型斑马鱼改善睡眠功效评价
随机选取受精后5 d（5 dpf）野生型AB品系斑马鱼于6孔细胞培养板中，每孔均喂养30尾斑马鱼，且每孔喂养体系均为3 mL，6孔分别为正常对照组、阳性对照组、模型对照组和从1.3.2中获得的三个不同浓度的实验组。正常对照组不做任何处理；阳性对照组为每mL喂养体系中加入1 000 μg的阳性对照；模型对照组为正常对照组在后期水溶给予（直接放入培养体系中）PTZ所建的模型；实验组为加入对应浓度的酸枣仁复合保健酒。各组28 ℃处理1 d后，每个组分别随机选取10尾斑马鱼转移至96孔板中，每孔一尾斑马鱼，每孔的喂养体系均为200 μL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予20 μL的PTZ（浓度为5 mol/L），之后立刻利用行为分析仪测定1 h内斑马鱼的觉醒活动量和觉醒总时间，评价酸枣仁复合保健酒对模型斑马鱼的改善睡眠效果。结果采用“平均值±标准差”表示。用SPSS 26.0软件进行统计学分析，P＜0.05表明差异具有统计学意义。
1.3.4 酸枣仁复合保健酒对正常斑马鱼改善睡眠功效评价
随机选取受精后5 d野生型AB品系斑马鱼于6孔细胞培养板的任意3个孔中，每孔均喂养30尾斑马鱼，且每孔喂养体系均为3 mL，3孔分别为正常对照组、阳性对照组和实验组。正常对照组不做任何处理；阳性对照组为每mL喂养体系中加入1 000 μg的阳性对照品；实验组为在喂养体系中加入从1.3.3中获得的最佳浓度的样品。28 ℃处理1 d后，每个组别随机选取10尾斑马鱼转移至96孔细胞培养板中。利用行为分析仪测定1 h内斑马鱼的觉醒活动量和觉醒总时间，评价样品对模式斑马鱼及正常斑马鱼的改善睡眠效果。结果采用“平均值±标准差”表示。用SPSS 26.0软件进行统计学分析，P＜0.05表明差异具有统计学意义。
1.3.5 酸枣仁复合保健酒安全性评价
（1）酸枣仁复合保健酒对斑马鱼的最大非致死浓度和10%致死浓度
随机选取受精后2 d（在2 dpf时，斑马鱼心脏处于比较敏感阶段，因此比较适合用于研究心血管毒性）野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔均喂养30尾斑马鱼，且每孔喂养体系均为3 mL，设置对照组和实验组（初始添加量为0.78 μL/mL，每个浓度梯度间隔2倍，直至100 μL/mL），28 ℃处理3 d后，根据死亡率，用Origin 8.0统计学软件绘制最佳的“浓度-死亡率”效应曲线，并计算酸枣仁复合保健酒样品对斑马鱼的最大非致死浓度（maximum nonlethal concentration，MNLC，是在确保不引起斑马鱼死亡的前提下，样品能够达到的最高浓度）和10%致死浓度（10%lethal concentration，LC10，是指在特定暴露条件下，导致斑马鱼群体中10%个体死亡的样品浓度）[23-25]。
（2）急性毒性实验
随机选取受精后2 d野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均喂养30尾斑马鱼。且每孔喂养体系均为3 mL，参考黄峥蕊[26]的研究报告设置对照组和实验组（分别以1/9 MNLC、1/3 MNLC、MNLC、LC10给予量水溶给予样品），28 ℃处理3 d，每天统计各实验组的斑马鱼死亡数量并及时移除。实验结束后，在解剖显微镜下观察各实验组斑马鱼心脏、循环系统、出血及血栓、脑、下颌、眼睛、肝脏、肾脏、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、身体着色、体长、鳍、耳等反应情况，采集典型毒性器官照片，并统计毒性发生率。以各器官的毒性发生率评价酸枣仁复合保健酒对斑马鱼的急性毒性，并鉴别毒性靶器官。
2 结果与分析
2.1 斑马鱼对酸枣仁复合保健酒最大耐受浓度
斑马鱼对酸枣仁复合保健酒最大耐受浓度测定结果见表1。由表1可知，在本实验条件下，给予斑马鱼的酸枣仁复合保健酒体积分数在3.12 μL/mL时，斑马鱼活动状态不佳，在1.56 μL/mL时正常，故酸枣仁复合保健酒的MTC为1.56 μL/mL。
表1 斑马鱼对酸枣仁复合保健酒最大耐受浓度
Table 1 Maximum tolerance concentration of zebrafish to complex healthy liquor of spina date seed
组别 体积分数/（μL·mL-1）死亡数/尾死亡率/%表型正常对照组-酸枣仁复合保健酒0.20 0.39 0.78 1.56 3.12 00 0 0 0 0 00 0 0 0 0未见明显异常与正常对照组状态相似与正常对照组状态相似与正常对照组状态相似与正常对照组状态相似较正常对照组状态差
2.2 酸枣仁复合保健酒对模式斑马鱼改善睡眠功效评价
各实验组斑马鱼在1 h内的运动轨迹荧光图见图1。由图1可知，模型对照组的红色线明显比正常对照组和阳性对照组的长且频繁，说明PTZ建模成功，且通过给予助睡眠的药品能够明显减少斑马鱼的快速运动距离和频率，而在给予酸枣仁复合保健酒时斑马鱼的快速运动情况也明显得到缓解，说明酸枣仁复合保健酒同样能够缓解斑马鱼的兴奋、失眠的症状。
图1 各处理组模式斑马鱼在1 h内的运动轨迹典型图
Fig.1 Typical diagram of model zebrafish movement trajectory of each treatment group within 1 h
黑色线为慢速运动距离、绿色线为中速运动距离、红色线为快速运动距离。
不同组实验斑马鱼在1 h内的觉醒活动量和觉醒总时间见表2。由表2可知，正常对照组和阳性对照组的觉醒活动量和觉醒总时间均与模型对照组存在极显著的差异（P＜0.01），说明PTZ建模成功，通过给予助睡眠的药品能够极显著减低斑马鱼的觉醒活动量和觉醒总时间，同理，酸枣仁复合保健酒给予体积分数在0.78 μL/mL、1.56 μL/mL时觉醒活动量和觉醒总时间均与模型对照组存在显著的差异（P＜0.05），且酸枣仁复合保健酒给予体积分数在1.56 μL/mL时觉醒活动量和觉醒总时间均低于0.78 μL/mL时觉醒活动量和觉醒总时间，说明酸枣仁复合保健酒在给予体积分数在0.78μL/mL、1.56 μL/mL时对模式斑马鱼具有改善睡眠的功效，而且酸枣仁复合保健酒在给予体积分数1.56 μL/mL时效果更好。
表2 酸枣仁复合保健酒改善模式斑马鱼睡眠的功效评价实验结果
Table 2 Results of function evaluation experiments of complex healthy liquor of spina date seed on improving sleep of model zebrafish
注：与模型对照组比较，“*”表示差异显著（P＜0.05），“**”表示差异极显著（P＜0.01），“***”表示差异高度显著（P＜0.001）。
组别 体积分数/（μL·mL-1）觉醒活动量/mm觉醒总时间/s正常对照组模型对照组阳性对照组/（μg·mL-1）0.62±0.11***18.50±2.86 8.60±0.93**9.24±1.17 8.59±1.43*8.49±0.94*--酸枣仁复合保健酒1 000 0.39 0.78 1.56 16.30±3.07***610±86.30 224±25.70**296±32.80*308±54.90*287±32.80*
2.3 酸枣仁复合保健酒对正常斑马鱼改善睡眠功效评价
为探究酸枣仁复合保健酒对正常斑马鱼的助睡眠效果，在上述实验结果的基础上，向正常斑马鱼给予体积分数为1.56 μL/mL样品，酸枣仁复合保健酒改善正常斑马鱼睡眠的功效评价实验结果见表3。由表3可知，阳性对照组的觉醒活动量和觉醒总时间均与正常对照组存在高度显著差异（P＜0.001），而酸枣仁复合保健酒觉醒活动量和总时间实验结果虽然明显低于正常对照组，但无显著性差异（P＞0.05），说明酸枣仁复合保健酒具有改善正常斑马鱼睡眠的趋势。
表3 酸枣仁复合保健酒改善正常斑马鱼睡眠的功效评价实验结果
Table 3 Experimental results of function evaluation of complex healthy liquor of spina date seed on improving sleep of normal zebrafish
注：与正常对照组比较，“***”表示差异高度显著（P＜0.001）。
组别 体积分数/（μL·mL-1）觉醒活动量/mm觉醒总时间/s正常对照组阳性对照组酸枣仁复合保健酒1.93±0.38 0.52±0.08***1.15±0.19-1 000 1.56 53.51±8.96 15.10±2.35***35.76±5.97
各实验组斑马鱼在1 h内的运动轨迹荧光图见图2。由图2可知，斑马鱼的快速运动距离和频度排序为正常对照组＞酸枣仁复合保健酒＞阳性对照组，说明通过给予助睡眠的药品和酸枣仁复合保健酒均能够使斑马鱼更加平静。
图2 各处理组正常斑马鱼在1 h内的运动轨迹典型图
Fig.2 Typical diagram of normal zebrafish movement trajectory in each treatment group within 1 h
黑色线为慢速运动距离、绿色线为中速运动距离、红色线为快速运动距离。
2.4 酸枣仁复合保健酒对斑马鱼的最大非致死浓度和10%致死浓度
由表4 可知，给予酸枣仁复合保健酒3 mL，保健酒体积分数分别为0.78 μL/mL、1.56 μL/mL、3.12 μL/mL、6.25 μL/mL时，无斑马鱼死亡；给予酸枣仁复合保健酒体积分数分别为12.5 μL/mL、25.0 μL/mL、50.0 μL/mL、100 μL/mL，均有30尾斑马鱼死亡，死亡率为100%。根据死亡率，用Origin 8.0统计学软件绘制最佳的“体积分数-死亡率”效应曲线见图3。通过计算得出样品对斑马鱼的MNLC和LC10分别为8.48 μL/mL和8.67 μL/mL。
图3 酸枣仁复合保健酒给予量与斑马鱼死亡率相关性
Fig.3 Correlation of administration of complex healthy liquor of spina date seed and mortality of zebrafish
表4 酸枣仁复合保健酒给予量对斑马鱼死亡率的影响
Table 4 Effect of administration amount of complex healthy liquor of spina date seed on mortality of zebrafish
组别 体积分数/（μL·mL-1） 死亡数/尾 死亡率/%正常对照组-酸枣仁复合保健酒0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 25.0 50.0 100.0 000003 0 00000 30 30 30 100 100 100 100
2.5 急性毒性检测结果
酸枣仁复合保健酒对斑马鱼的急性毒性检测结果见表5、图4及图5。
B=脑；H=心脏；J=下颌；In=肠道；L=肝脏；Y=卵黄囊；E=眼睛。图4 各处理组斑马鱼组织器官急性毒性表型图
Fig.4 Acute toxicity phenotypic diagram of zebrafish tissues and organs of each treatment group
图5 各处理组斑马鱼肌肉及体节急性毒性表型图
Fig.5 Acute toxic phenotypic diagram of zebrafish muscle and body segment of each treatment group
表5 酸枣仁复合保健酒急性毒性实验结果
Table 5 Results of acute toxicity experiments of complex healthy liquor of spina date seed
注：“-”表示未见明显异常。
畸形类型 正常对照组毒性发生率/%0.942 2.83 8.48 8.67心脏 心包水肿心律异常血流变慢循环缺失--循环系统出血及血栓脑下颌眼睛10 10 13 13肝脏畸形短小眼变小缺失肝肿大肝变性卵黄囊吸收延迟水肿肠腔异常弯曲肌肉变性异常-- - - -- - - 1肾脏肠道躯干/尾/脊索肌肉/体节身体着色体长变短耳（畸形）鳍死亡0- - - 1异常缺失-- - - - - - - - - - - - - - - - - -- - --- - - - - - - - - - - - - - - - - -- - --- - - - - - - - - - - - - - - - - -- - --- - - - - - - - - - - - - - -- - -0-- - -
由表5、图4及图5可知，酸枣仁复合保健酒在1/9 MNLC、1/3 MNLC给予量下均未出现斑马鱼畸形；在MNLC给予量下诱发心血管毒性，具体表现为心律异常和血流变慢；在LC10浓度下诱发心血管毒性、肝脏毒性和肌肉变性，肝脏毒性具体表现为卵黄囊吸收延迟。故在1/3 MNLC（2.83 μL/mL）给予量下对于斑马鱼是安全的，超过MNLC（8.48 μL/mL）给予量时对斑马鱼产生毒性作用。
3 结论
酸枣仁复合保健酒对于给予PTZ建立的斑马鱼失眠模型在体积分数分别为0.78 μL/mL、1.56 μL/mL时具有显著改善模型斑马鱼睡眠的功效（P＜0.05）。但对于正常斑马鱼来说，在体积分数为1.56 μL/mL时具有改善正常斑马鱼睡眠的趋势，未达到显著效果（P＞0.05）。在毒理性方面，酸枣仁复合保健酒对于受精后2 d的斑马鱼其MNLC和LC10分别为8.48 μL/mL和8.67 μL/mL时，这两个给予量均会对斑马鱼产生急性毒性；在0.942 μL/mL和2.83 μL/mL给予量下不诱发急性毒性。说明酸枣仁复合保健酒需要进一步限定合理饮用量。通过斑马鱼的功效和毒理性预实验，说明这款酒具有改善睡眠的功效，但在建议饮用量的设置方面需要继续细化实验。
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