川芎嗪是以老陈醋为代表的我国谷物固态发酵食醋中的功能成分之一，赋予了老陈醋降血压、活血化瘀和清除自由基的保健价值[1-2]。川芎嗪，学名四甲基吡嗪（tetramethy lpyrazine，TMP），是治疗血栓等疾病的新型药物，有抗血小板凝集、扩张小动脉、改善微循环和活血化瘀的作用，并对已聚集的血小板有解离作用[3-4]。乙偶姻是川芎嗪合成的重要前体物质[5]。XIAO Z等[6]研究表明，乙偶姻和铵是食醋中川芎嗪的前体物质，在发酵过程中积累，川芎嗪主要在熏醅后通过美拉德反应大量生成。将从醋醅中分离驯化具有产乙偶姻功能的微生物进行原位强化实验研究表明，镇江香醋中乙偶姻含量可提高1倍以上[7]。
目前，老陈醋的生产工艺主要为传统手工生产工艺和机械化生产工艺。传统老陈醋制作工艺采用瓮缸发酵，地炕炭火熏醅；机械化工艺是在保持老陈醋优良品质的前提下，采用发酵罐替代传统瓮缸发酵、机械化翻倒醅设备替代传统手工翻醅倒醅，蒸汽熏醅罐替代传统地炕煤烟火熏醅等方式。传统熏醅方式是将醋酸发酵结束的醋醅放入陶瓷缸中，在温度为80～90 ℃的条件下，连续焙烤4～5 d；而机械熏醅是蒸汽熏醅罐中，在110～120 ℃下连续熏制12～24 h下完成。刘卓飞等[8]研究表明，陈酿温度（20～50 ℃）的升高和初始乙偶姻含量（240～2 400 mg/L）的增加均能提高镇江香醋陈酿过程中川芎嗪的含量和生成速率。王家东等[9]研究表明，与85 ℃、105 ℃条件下熏醅相比，95 ℃熏醅3 d，四甲基吡嗪含量分别提高30%和17%。目前大多数研究集中在熏醅阶段对温度、时间进行优化以提高乙偶姻、川芎嗪含量，而对不同酿造工艺对川芎嗪、乙偶姻含量的研究报道较少。
本研究以山西老陈醋醋醅为研究对象，分别比较不同酿造工艺醋酸阶段对醋醅中乙偶姻、川芎嗪含量的影响，同时研究了不同熏醅方式下对乙偶姻和川芎嗪含量的影响，以期为老陈醋生产工艺实现自动化、智能化的一体化高质量发展提供关键技术及理论支撑，为老陈醋工艺改进提供数据参数，进一步提供老陈醋的品质。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
醋醅样品：山西紫林醋业股份有限公司；乙偶姻标准品（色谱纯）：西亚化学有限公司；川芎嗪标准品（色谱纯）：中国食品药品检定研究院；氢氧化钠、肌酸、甲萘芬（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
AR124CN电子天平：奥豪斯仪器有限公司；HH-4型水浴锅：常州荣华仪器制造有限公司；HPLC1260高效液相色谱仪（配紫外检测器）：安捷伦科技有限公司；紫外可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司。
1.3 方法
1.3.1 醋醅的取样方法
传统发酵工艺：拌醅完成后运送至陶瓷缸，采用人工翻醅，醅层厚度约为50～55 cm，开始进行老陈醋醋酸发酵，醋酸发酵温度在28～45 ℃。醋酸发酵周期为10 d，每隔2 d取样一次，分别在醋酸发酵0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d取样；山西老陈醋的传统熏醅工艺：温度为80～90 ℃的条件下，连续熏制4～5 d，故分别在熏醅0、1 d、2 d、3 d、4 d取样。
机械发酵工艺：机械工艺用条状池盛放醋醅，采用翻醅机翻醅，醅层厚度约为75～80 cm。醋酸发酵温度为28～47 ℃，醋酸发酵周期为14 d，每隔2 d取样一次，分别在醋酸发酵0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d取样；机械熏醅工艺在参考传统工艺的基础上确定为在110～120 ℃连续熏制12～24 h，在0、12 h、24 h（熏醅结束时）分别取样。
采用传统发酵工艺的醋醅用于传统熏醅和机械熏醅获得的样品分别命名为TTS、TMS；采用机械工艺醋醅用于传统熏醅和机械熏醅获得的样品命名为MTS、MMS。
1.3.2 理化指标的检测
总酸的测定：参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》的酸碱滴定方法[10]。
酒精度的测定：参照《酿酒分析与检测》[11]中的方法蒸馏，用福林斯Alkomat酒精检测仪测定馏出液。
1.3.3 功能成分分析
（1）乙偶姻的检测[12]
采用比色法测定醋醅中的乙偶姻，准确称取2.5 g乙偶姻，用去离子水定容至50 mL容量瓶中，配制成质量浓度为50 mg/mL的乙偶姻标准溶液，并稀释至不同倍数。分别取不同浓度的标准溶液100 μL，加入2.4 mL去离子水、0.5 mL 0.5%肌酸溶液、0.5 mL5%萘酚溶液、0.5 mL10%氢氧化钠溶液，混匀，于30 ℃水浴1 h后，测定于波长520 nm条件下的OD520nm值。以乙偶姻质量浓度（X）为横坐标，OD520nm值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，获得标准曲线回归方程Y=0.076X+0.01，R2=0.999 2。取稀释后的醋醅浸泡液样品100 μL，测定样品的OD520nm值，利用标准曲线回归方程计算乙偶姻含量。
（2）川芎嗪的检测
参照GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》中的方法测定[10]，计算公式如下：
式中：X为样品中川芎嗪（四甲基吡嗪）的含量，mg/L；C-由标准曲线求得样液中川芎嗪（四甲基吡嗪）质量浓度，μg/mL；V1为所取试样体积，mL；V2为试样最后定容体积，mL。
2 结果与分析
2.1 不同发酵工艺醋酸发酵过程中温度的变化
由图1可知，在醋酸发酵阶段，当发酵时间为0～4 d时，机械工艺发酵醋酸温度快速上升；当发酵时间为4～14 d时，温度呈先平稳上升后下降的趋势，在此期间，温度均＞40℃。其原因可能是，第0天时，使用麸皮和谷糠等辅料进行拌醅后，接入火醅，火醅中的微生物在新环境中获得了丰富的营养物质和生长因子。同时蓬松的新醅为微生物提供了充足的氧气和水分，因此在醋酸发酵前期，微生物可充分利用淀粉和酒精等物质来支撑微生物本身的生长繁殖和代谢活动[13]，所以发酵初期的温度快速增加。当发酵时间为0～2 d时，传统工艺温度快速上升；当发酵时间为2～10 d时，温度呈下降的趋势，发酵结束时，温度降低至34 ℃在醋酸发酵第2天传统工艺发酵温度高于机械，是因为两种工艺盛放醋醅的容器和醋醅量不同，传统工艺的陶瓷缸盛放醋醅量远低于条形池。盛放量少导致传统工艺在发酵初期醋醅中的氧气充足，有利于微生物活动的快速且充分的进行繁殖和代谢活动[14]，发酵后期传统工艺的温度低于机械工艺。因此，机械工艺条形池更有利于温度的保持。
图1 传统及机械发酵工艺下醋酸发酵过程中温度的变化
Fig.1 Changes in temperature during acetic acid fermentation using traditional and mechanical fermentation processes
2.2 不同发酵工艺醋酸发酵过程中酒精度、总酸的变化
由图2可知，醋酸发酵过程中，酒精度和总酸变化趋势相反，酒精度呈快速下降趋势后趋于平缓，总酸含量呈快速增加趋势后趋于平缓；传统和机械发酵工艺结束时，醋醅酒精度分别为0.37%vol、0.75%vol，总酸含量分别为4.85 g/100 mL、4.25 g/100 mL。这是由于两种工艺盛放醋醅的容器和醋醅量是不同的，其中传统工艺用陶瓷缸盛放醋醅，采用人工翻醅，醅层厚度约为50～55 cm，机械工艺用条状池盛放醋醅，采用机械翻醅，醅层厚度约为75～80 cm。传统工艺的陶瓷缸盛放醋醅量远低于条形池，机械工艺条状池的醋醅盛放量是传统陶瓷缸的180～250倍[15]。因此传统工艺醋酸发酵过程中氧气充足，有利于微生物活动的快速且充分的进行繁殖和代谢活动，使得醋酸发酵周期较短，这也导致两工艺周期不同，传统工艺醋酸发酵周期比机械的短。
图2 传统（a）及机械（b）发酵工艺下醋酸发酵过程中酒精度和总酸的变化
Fig.2 Changes in alcohol content and total acid during acetic acid fermentation using traditional (a) and mechanical (b)fermentation processes
2.3 不同发酵工艺醋酸发酵过程中乙偶姻、川芎嗪含量的变化
乙偶姻作为川芎嗪的前体物质，直接影响川芎嗪的生成。由图3可知，采用传统发酵方式的醋醅在发酵时间为1～6 d时，乙偶姻含量呈快速增加趋势；当发酵到第6天时，醋醅中的乙偶姻含量达到最大值，为3 666 mg/L；当发酵时间＞6 d时，乙偶姻快速下降后又有所反升，发酵结束时乙偶姻含量为706.67 mg/L。采用机械发酵方式的醋醅在发酵时间为1～4 d时，乙偶姻含量较稳定，当发酵时间为4～14 d，乙偶姻含量快速增加，发酵结束时乙偶姻含量为2 933.33 mg/L。采用传统发酵方式的醋醅在发酵时间为1～4 d时，川芎嗪含量较稳定；当发酵时间＞4 d时，川芎嗪含量逐渐增加，发酵结束时川芎嗪含量0.38 mg/L。采用机械发酵方式的醋醅在发酵时间为1～7 d时，川芎嗪含量较稳定；当发酵时间为7～14 d，川芎嗪含量快速增加。醋酸发酵结束时，机械工艺生产方式醋醅中的川芎嗪含量为1.33 mg/L，明显高于传统工艺生产，根据前文不同酿造工艺醋酸发酵过程中温度的变化可知，发酵温度影响乙偶姻和川芎嗪的含量，这与刘娜[16]研究结果一致。很多研究也表明一定范围的温度下，发酵温度会影响乙偶姻的积累[17]。
图3 传统及机械发酵工艺下醋酸发酵过程中乙偶姻和川芎嗪含量的变化
Fig.3 Changes in acetoin and ligustrazine during acetic acid fermentation using traditional and mechanical fermentation processes
2.4 不同熏醅方式对乙偶姻、川芎嗪的影响
2.4.1 传统醋酸发酵工艺下不同熏醅工艺对乙偶姻和川芎嗪的影响
由图4a可知，醋醅初始乙偶姻、川芎嗪的含量分别为766.67 mg/L、0.411 mg/L。传统熏醅方式下，随着熏醅时间的延长，乙偶姻呈现下降趋势，川芎嗪含量增加，熏醅结束时，川芎嗪含量增加至3.15 mg/L，乙偶姻减少至200.23 mg/L；由图4b可知，机械熏醅方式下，随着熏醅时间的延长，乙偶姻、川芎嗪含量均呈上升趋势，熏醅结束时，川芎嗪含量增加至11.18 mg/L，乙偶姻的减少至10.45 mg/L。与传统熏醅方式相比，乙偶姻在机械熏醅时呈上升趋势，这是由于传统醋酸发酵后期温度持续下降导致乙偶姻呈下降趋势，在机械熏醅阶段持续高温熏制，使醋酸发酵时添加的辅料转化为熟料，在激活酶系的同时，原料中残余的淀粉、半纤维素及蛋白质、菌体等物质继续水解，促进了乙偶姻的合成[18-22]。与机械熏醅方式相比，传统工艺川芎嗪含量增长的趋势较慢，是因为机械熏醅虽然时间缩短，但是熏醅温度高，促进了乙偶姻向川芎嗪转化，因此，相比传统熏醅方式，机械熏醅方式更加促进乙偶姻的转化和川芎嗪的生成。
图4 传统醋酸发酵工艺下传统熏醅（a）及机械熏醅（b）对乙偶姻、川芎嗪的影响
Fig.4 Effects of traditional fumigation (a) and mechanical fumigation(b) on acetoin and ligustrazine under traditional acetic acid fermentation process
2.4.2 机械醋酸发酵工艺下不同熏醅工艺对乙偶姻和川芎嗪的影响
由图5a可知，醋醅初始乙偶姻、川芎嗪的含量分别为2 800.00 mg/L、0.96 mg/L。传统熏醅方式下，乙偶姻含量呈先上升后下降的趋势，川芎嗪含量增加，当熏醅结束时，川芎嗪含量增加至4.73 mg/L，乙偶姻减少至1 663.63 mg/L；由图5b可知，机械熏醅方式下，乙偶姻呈下降趋势，川芎嗪含量增加，当熏醅结束时，川芎嗪含量增加至17.63 mg/L，乙偶姻减少至137 mg/L；与机械熏醅方式相比，在乙偶姻含量较高的情况下进行不同工艺的熏醅，传统工艺乙偶姻变化幅度小且川芎嗪生成少；而机械熏醅使乙偶姻含量迅速下降且川芎嗪迅速增加。因此在醋酸发酵结束乙偶姻含量较高的条件下，机械熏醅变化的趋势较快，说明熏醅温度高有利于乙偶姻向川芎嗪转化。在较高的乙偶姻含量下，提高熏醅温度更有利于乙偶姻向川芎嗪的转化[23-25]。因此，熏醅温度、乙偶姻浓度会影响川芎嗪的生成。综上所述，采用机械条形池更有利于温度的保持且发酵结束乙偶姻的含量高，所以采用机械发酵及熏醅工艺有利于川芎嗪含量的提高，更有利于食醋品质的提升。
图5 机械醋酸发酵工艺下传统熏醅（a）及机械熏醅（b）对乙偶姻、川芎嗪的影响
Fig.5 Effects of traditional fumigation (a) and mechanical fumigation(b) on acetoin and ligustrazine under mechanical acetic acid fermentation process
3 结论
本研究对分别对传统、机械工艺下醋酸发酵过程中酒精度、总酸、乙偶姻、川芎嗪的变化及不同熏醅方式下乙姻和川芎嗪的含量变化情况进行跟踪检测。结果表明，在传统醋酸发酵工艺下，发酵结束时，醋醅酒精度、总酸、乙偶姻、川芎嗪含量分别为0.37%vol、4.85 g/100 mL、706.67 mg/L、0.38 mg/L；在机械醋酸发酵工艺下，发酵结束时，酒精度、总酸、乙偶姻、川芎嗪含量分别为0.75%vol、4.25 g/100 mL、2 933.33 mg/L、1.33 mg/L。在传统醋酸发酵工艺条件下，发酵结束时，传统、机械熏醅工艺醋醅乙偶姻、川芎嗪的含量分别为200.23 mg/L、3.15 mg/L，10.45 mg/L、11.18 mg/L；在机械醋酸发酵工艺条件下，发酵结束时，传统、机械熏醅工艺醋醅乙偶姻、川芎嗪的含量分别为1 666.63 mg/L、4.73 mg/L，137 mg/L、17.63 mg/L。结合山西老陈醋传统酿造工艺高温固态醋酸发酵的特点，可通过控制醅层高度，适当提高醋酸发酵阶段和熏醅温度，保障老陈醋中川芎嗪的含量，提升食醋品质，为下一步发酵工艺的改进提供数据支撑，为老陈醋生产工艺实现自动化、智能化的一体化高质量发展提供理论及关键技术支撑。
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