青金桔（Citrus microcarpa），又称青桔、山桔、年桔等，为芸香科柑橘族金柑属，是宽皮柑橘（Citrus reticulate Blanco）和金桔（Fortunella spp.）的杂交品种，原产于中国，目前主要分布于东南亚和中国热带地区，具有悠久的种植历史[1-2]。青金桔维生素尤其是维生素C（vitamin C，VC）含量丰富，经常饮用青金桔作为主要原料制备的饮料，可以达到美容养颜、止痰润喉、治咳嗽的效果[3-4]。因此，青金桔目前主要被用于榨汁。青金桔榨汁后产生约45%的皮渣副产物，由于缺乏相应的加工技术，其基本被丢弃，从而造成较大的资源浪费和环境污染[5]。
发酵作为生产和保存食物最古老、最经济的方法之一，可改善产品风味，提升产品营养品质，增加其功能活性，已成为果蔬精深加工产业研究的重点和热点[6-7]。本课题组前期研究发现[8]，采用自然发酵青金桔全果浆可实现对青金桔的100%利用，并促进总酚、总黄酮释放，提升其抑制消化相关酶活性的能力。但自然发酵存在发酵时间长、品质不稳定等缺点。人工接种进行纯种发酵可快速提升目标菌数，抑制其他杂菌生长，有利于产品品质控制、风味形成及功能活性的改善[9-10]。目前用于果蔬纯种发酵的菌种主要为酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等[11-13]，这些菌种发酵的最适pH值一般在4～6，低pH条件下其生长受到抑制甚至死亡。青金桔的酸度较高，全果浆pH值仅为2～3，一般菌种在此条件下很难生长。因此，寻找适宜青金桔全果浆发酵的菌株，是采用纯种发酵，实现发酵过程、产品质量可控的关键。研究表明，部分酵母菌在耐低pH环境、促进活性物质释放等方面表现出较大的潜力[14-15]，可作为青金桔全果浆纯种发酵的潜在菌种进行筛选。
因此，本研究拟采用传统分离、纯化方法对青金桔全果浆自然发酵液中的酵母菌进行分离纯化，通过菌落、细胞形态观察结合内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）测序对分离菌种进行鉴定，并评价其生长性能及对温度、pH和葡萄糖浓度的耐受性。采用分离鉴定的酵母菌对青金桔全果浆进行纯种发酵，比较发酵前后青金桔全果浆可溶性总酚、总黄酮含量、α-葡萄糖苷酶抑制率和抗氧化活性变化情况，考察分离菌株的发酵特性。以期得到发酵性能较好的酵母菌，解决自然发酵条件下青金桔酵素产品质量不稳定等问题，提高发酵青金桔品质，为后续优质青金桔产品的开发提供支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
青金桔鲜果：采购自当地市场。
1.1.2 化学试剂
葡萄糖、蛋白胨、琼脂、美蓝染色剂：北京索莱宝科技有限公司；酵母提取物：英国OXOID公司；三氯化铝（AlCl3）：美国阿拉丁公司；氯化钠（NaCl）、亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸钠（NaNO3）：西陇科学股份有限公司；甲醇（色谱纯）：德国CNW公司；α-葡萄糖苷酶（3×105 U/g）、1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS）自由基、新亚铜试剂、福林酚试剂、抗坏血酸：上海源叶生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：蛋白胨20.0 g，酵母提取物10.0 g，葡萄糖20.0 g，加水定容至1 L，pH自然，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
YPD固体培养基：YPD液体培养基添加2%琼脂。
1.2 仪器与设备
DMM-40型胶体磨：上海秦硕化工机械设备有限公司；LGJ-10NS/GC型冷冻干燥机：北京亚星仪科科技发展有限公司；HFsafe900型生物安全柜：上海力申科学仪器有限公司；DGL-50X型立式灭菌器：上海力辰仪器科技有限公司；SPH-200B型台式恒温培养振荡器：上海世平实验设备有限公司；YP5002型电子天平：上海越平科学仪器（苏州）制造有限公司；CX33型显微镜：日本Olympus公司；CenLee16X台式高速离心机：湖南湘立科学仪器有限公司；PLUS-E2-20TJ实验室级超纯水机：南京易普易达科技发展有限公司；FlexA-200酶联免疫分析仪：杭州优米仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 青金桔全果浆发酵样品的制备
选择新鲜、表皮略黄色或黄色、具有青金桔特有香味、无破裂、无发霉的青金桔，洗净、晾干至青金桔表面无水分，全果破碎，过70目筛后，放入5 L发酵罐中自然发酵。于第10天取样，得到青金桔全果浆自然发酵酵素成品。
1.3.2 酵母菌的分离纯化
自然发酵青金桔样品连续稀释，取100 μL梯度稀释液涂布于YPD固体培养基中，28 ℃培养3 d。采用平板划线法分离，直到获得纯种，接种于斜面培养基和液体培养基，28℃培养1～2 d，纯种分别进行4 ℃斜面保藏和-80 ℃甘油管冻藏备用。
1.3.3 酵母菌的鉴定
形态学观察：采用平板培养24 h，观察菌落形态；取样，涂片，用美兰染色后显微镜下观察细胞形态。
分子生物学鉴定：采用ITS鉴定，送至青岛鹏翔生物科技有限公司进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增测序。
1.3.4 分离酵母菌在青金桔全果浆中生长性能测定
分离酵母菌分别接种于YPD液体培养基中，30 ℃培养48 h。4 ℃、1 800×g条件下离心，沉淀用0.85%生理盐水洗涤2次后，得到菌种用0.85%生理盐水稀释成107 CFU/mL的菌悬液。
分别取以上菌悬液以1%（V/V）的接种量接种到50 mL经115 ℃、15 min高压蒸汽灭菌的青金桔全果浆中，于30 ℃条件下培养10 d。取发酵后样品与无菌生理盐水混合制成10倍稀释液。采用平板计算法，计算发酵10 d后样品中相应活菌数，测定酵母菌在青金桔全果浆条件下的生长性能。
分离酵母菌生长曲线的测定：参照章之柱等[16]的方法并进行调整，取种子液以1%（V/V）接种量，在无菌条件下接种于YPD液体培养基中，培养温度30 ℃，每隔2 h取发酵液，采用分光光度计测定其OD600nm值。以培养时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制酵母菌的生长曲线。
1.3.5 分离酵母菌耐受性能分析
参照赵广河等[17]的方法并进行调整，取种子液按照2%（V/V）的接种量分别接种到不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）、温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、葡萄糖含量（100 g/L、200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L）的YPD液体培养基中，28 ℃恒温培养3 d，采用分光光度计测定其OD600 nm值，测定3个平行，取平均值，根据OD600 nm值来确定不同条件下酵母菌的生长情况。
1.3.6 分离酵母菌发酵特性评价
选取上述分离纯化的酵母菌，接种于YPD液体培养基中，培养48 h。4 ℃、1 800×g条件下离心，沉淀用0.85%生理盐水洗涤2次后，得到菌种。菌种用0.85%生理盐水稀释成107 CFU/mL的悬浮液。分别取以上菌悬液以1%（V/V）的接种量接种到50 mL经115 ℃、15 min高压蒸汽灭菌的青金桔全果浆中，于30 ℃条件下培养10 d。取发酵后的样品存放于-80 ℃冰箱中12 h，在真空度30 Pa、冷阱温度-60 ℃条件下，冷冻干燥48 h。准确称取冷冻干燥后的样品0.2 g于15 mL离心管中，加入10 mL体积分数为70%甲醇复溶，将样品置于超声清洗器中，360 W、50 ℃超声30 min，用0.22 μm孔径滤膜过滤得到样品提取液。对比发酵前后总酚、总黄酮含量、α-葡萄糖苷酶抑制率、抗氧化活性的变化，考察分离菌株的发酵特性。
1.3.7 分析检测
总酚含量（以没食子酸计）测定：采用张红建等[8]的方法，利用福林酚显色法测定，结果以mg没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）/100 g冻干样品表示。
总黄酮含量（以芦丁计）测定：采用张红建等[8]的方法，利用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定，结果以mg芦丁当量（rutin equivalent，RE）/100 g冻干样表示。
α-葡萄糖苷酶抑制率的测定：采用张红建等[8]的方法。10 μL 样品提取液与50 μL α-葡萄糖苷酶（1.0 U/mL溶于0.1 mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液中）添加到96孔板中，振动均匀，于37 ℃条件下孵化15 min。然后将50 μL的对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，pNPG）（5 mmol/L 溶于0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH6.8）中）添加到96 孔板中，振动均匀，继续于37 ℃条件下孵化15 min。添加150 μL 0.5 mmol/L的碳酸钠溶液终止反应，于波长415 nm处测吸光度值。α-葡萄糖苷酶活力以从pNPG中释放的p-硝基酚表示。α-葡萄糖苷酶抑制率（inhibition ratio，IR）计算公式如下：
式中：IR为α-葡萄糖苷酶抑制率，%；A控制为酶与底物反应的吸光度值；A控制空白为不加酶时底物的吸光度值；A样品为样品、酶与底物反应的吸光度值；A样品空白为样品与底物反应的吸光度值。
DPPH自由基清除能力测定：参考王露[18]的方法并进行调整。质量浓度分别为（4 mg/mL、8 mg/mL、12 mg/mL、16mg/mL、20mg/mL）的60μL样品提取物（对以上0.2g/10mL样品提取液稀释得到），分散于96孔板中，并分别与40 μL 1mmol/L的DPPH溶液（DPPH溶于甲醇中）混合，再加入150 μL的甲醇溶液。室温条件下暗处反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度值。以维生素C（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL）为阳性对照。半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值定义为清除50%DPPH自由基所需的样品提取液的最小浓度。DPPH自由基清除能力计算公式如下：
式中：Ac为未加样品时DPPH溶液的吸光度值；As为DPPH溶液和样品反应后的吸光度值。
ABTS+自由基清除能力测定：参考王露[18]的方法并进行调整。将7 mmol/L ABTS 溶液（水配制）与2.4 mmol/L 过硫酸钾溶液等体积混合，温室条件下、暗处反应12～16 h，制备新鲜的ABTS+自由基溶液。使用前，将新鲜制备的ABTS+溶液用甲醇稀释至波长734 nm处吸光度值为0.7±0.02。150 μL ABTS+稀释液与30 μL样品提取液混合（质量浓度分别为2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL），室温、暗处反应10 min，波长734 nm处测定吸光度值。以维生素C为阳性对照，IC50值定义为清除50%ABTS+自由基所需的样品提取液的最小浓度。ABTS+自由基清除能力计算公式如下：
式中：Ac为未加样品时ABTS+溶液的吸光度值，As为ABTS+溶液和样品反应后的吸光度值。
铜离子还原能力测定：参考CELIK S E等[19]的方法并进行调整，在96孔酶标板中，依次加入25 μL样品、50 μL 10 mmol/L CuCl2、50 μL 7.5 mmol/L的新亚铜试剂溶液、50 μL 1 mol/L醋酸铵缓冲液（pH7），最后加入30 μL水，温室条件下反应30 min，以体积分数为70%甲醇作空白，于波长450 nm处测定吸光度值。分别精密吸取质量浓度为0.5 g/L没食子酸对照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成系列质量浓度的没食子酸对照品溶液。以吸光度值（y）为纵坐标，没食子酸质量浓度（x）为横坐标，绘制没食子酸标准曲线，得线性回归方程y=0.003 3x+0.002 2，相关系数R2=0.996 4。结果以μgGAE/g样品表示。
1.3.8 数据处理
采用MEGA 7.0软件建立相关种的ITS rDNA序列系统发育树，IBM SPSS Statistics 26.0进行数据处理、方差分析及差异显著性分析，采用Origin 2018绘图。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的形态和分子生物学鉴定
经过分离纯化、初筛，从自然发酵青金桔中共分离出3株酵母菌，分别编号为Y1、Y14、Y15，其菌落形态和细胞形态如图1所示，菌株Y1、Y14、Y15在YPD液体培养基中产生沉淀；菌落为乳白色、圆形、微凸，菌落质地黏稠、易挑取；通过显微镜观察，细胞形态均为椭圆形。
图1 分离菌株Y1、Y14及Y15的菌落形态和细胞形态
Fig.1 Colony and cell morphology of isolated strains Y1, Y14 and Y15
将菌株Y1、Y14和Y15 的ITS rDNA序列片段测序结果递交至美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）的GenBank数据库进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比对，基于ITS rDNA序列采用MEGA 7.0软件建立相关种的系统发育树，如图2所示，菌株Y1与Pichia terricola KY495764.1聚于一支，同源性达72%，菌株Y14与Hanseniaspora opuntiae OR091284.1聚于一支，同源性达99%，菌株Y15与Hanseniaspora opuntiae OR091284.1聚于一支，同源性达99.86%。因此，菌株Y1被鉴定为特立科拉毕赤酵母（Pichia terricola），菌株Y14、Y15均被鉴定为仙人掌有孢汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae），3株菌均为非酿酒酵母（non-Saccharomyces）。
图2 基于ITS基因序列构建的分离菌株系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of isolated strains based on ITS gene sequences
2.2 分离酵母菌在青金桔全果浆中生长性能测定
将分离菌株Y1、Y14和Y15以1%（V/V）的接种量分别接种到50 mL的灭菌青金桔全果浆中，于30 ℃条件下培养10 d，采用平板计算法（培养基为YPD固体培养基），计算样品中相应活菌数，结果表明，筛选得到的酵母菌Y1、Y14、Y15在灭菌青金桔全果浆中培养5 d后活菌数分别为1.1×109 CFU/mL、5.7×108 CFU/mL、3.4×108 CFU/mL，均能达到108 CFU/mL以上，生长良好。
2.3 分离酵母菌的生长曲线
酵母菌的生长一般都经历了延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。3株分离酵母菌的生长曲线见图3。由图3可知，在酵母菌的生长过程中，前4 h酵母菌Y14和Y15基本都处于延滞期，菌株Y1延滞期为前6 h。延滞期后开始进入对数生长期，菌株Y14和Y15在4～24 h之间为对数生长期，从24 h之后趋于稳定，逐渐进入衰亡期。菌株Y1生长较慢，从8 h后才开始进入对数生长期，8～32 h左右为对数生长期，32 h之后对数生长期基本结束，进入稳定期。
图3 分离酵母菌的生长曲线
Fig.3 Growth curves of isolated yeasts
2.4 分离酵母菌的耐受性实验
温度是影响酵母菌生长的重要因素，可以影响酵母的数量、种类及存活时间等，不同酵母菌的最适生长温度存在差异[20]。耐热性是微生物在食品工业中使用时面临的一个基本挑战[21]。分离酵母菌的耐受性实验结果见图4。
图4 分离酵母菌对温度（a），pH值（b）及葡萄糖质量浓度（c）耐受性实验结果
Fig.4 Tolerance experiments results of isolated yeasts to temperature (a), pH (b) and glucose mass concentration (c)
由图4a可知，3株分离酵母菌的生长情况随温度升高先增加后降低。温度在20～30 ℃时，菌株Y1的OD600nm值随着温度升高而增加，当温度为30 ℃时达到最大值，表明菌株Y1的最适温度为30 ℃；温度在20～25 ℃时，菌株Y14、Y15的OD600 nm值随着温度升高而增加，当温度为25 ℃时达到最大值，表明菌株Y14、Y15的最适温度为25 ℃；当温度达到40 ℃时，3株酵母菌受到抑制几乎不生长。冯文倩等[22]研究发现，汉逊酵母属是耐高温酵母属之一，能在40 ℃高温条件下正常生长，与本实验结果不一致。可能的原因是在40 ℃时，酵母菌的三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATP）等酶活受到抑制，影响了酵母正常生长。
pH也是影响酵母菌生长的重要因素之一，会影响酵母菌对营养物质的吸收、细胞膜通透性、酶的活性以及代谢途径[23]。由图4b可知，菌株Y1在pH 4条件下OD600nm值最大，与其他pH情况下的OD600nm值差异并不显著（P＞0.05）；菌株Y14在pH 4情况下OD600 nm值最大，在pH 2情况下OD600 nm值稍有降低；菌株Y15在pH2情况下OD600nm值最小，随着pH值升高OD600 nm值逐渐增大。3株酵母具有较好的低pH值耐受性，其中Y1和Y14的耐酸性相比Y15更强，与潘庆珉等[24]对毕赤酵母的研究结果一致。徐伟等[25]研究发现，耐低pH酵母菌中过氧化氢酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力有所增加，促进了酵母菌的抗氧化能力，进而抵制了酸胁迫。青金桔全果浆的pH值通常在2～3，需要酵母菌具有较强的耐酸性能，因此3株酵母的低pH值耐受性应用于青金桔发酵方面有很大的前景。
由图4c可知，酵母菌的生长随着葡萄糖浓度的增加而逐渐减慢，当葡萄糖质量浓度达到400 g/L，3株菌的OD600nm值显著降低（P＜0.05），说明3株菌的生长受到一定的抑制，但依然能够正常生长。此结果与杜沁岭等[26]研究结果不一致，可能原因是非酿酒酵母对葡萄糖的利用能力较差，且葡萄糖浓度过高形成高的渗透压，造成酵母菌的细胞破裂，活性降低[27]。
2.5 分离酵母菌发酵特性评价
酵母菌发酵特性评价情况结果见表1。由表1可知，由酵母菌发酵的青金桔全果浆的总多酚、总黄酮、DPPH、ABTS自由基清除率、铜离子还原能力和α-葡萄糖苷酶抑制率相比较0 d对照均显著提高（P＜0.05）。其中菌株Y1发酵青金桔全果浆总酚、总黄酮、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、铜离子还原能力、α-葡萄糖苷酶抑制率分别提高20.65%、87.15%、20.45%、43.94%、34.08%、20.34%；Y14发酵青金桔全果浆总酚、总黄酮、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、铜离子还原能力、α-葡萄糖苷酶抑制率分别提高19.22%、51.90%、18.31%、39.39%、25.94%、24.82%；Y15发酵青金桔全果浆总酚、总黄酮、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、铜离子还原能力、α-葡萄糖苷酶抑制率分别提高19.97%、70.01%、22.92%、34.85%、30.85%、13.53%。
表1 酵母菌发酵青金桔全果浆10 d后总酚、总黄酮含量、抗氧化能力和抑制α-葡萄糖苷酶活性的变化
Table 1 Changes of total phenolic and total flavonoid contents, antioxidant capacity, and α-amylase inhibitory activities of Citrus microcarpa whole fruit pulp fermented by yeasts for 10 d
项目 0d（对照）总酚含量/（mgGAE·100 g-1）总黄酮含量/（mgRE·100 g-1）DPPH清除率/%ABTS自由基清除率/%铜离子还原能力/（μgGAE·g-1）α-葡萄糖苷酶抑制率/%973.08±3.18b 0.817±0.02d 58.78±1.35b 47.07±1.03c 1.056±0.03d 56.24±1.89d菌株Y1 1 174.03±24.86a 1.529±0.08a 70.81±1.69a 63.11±1.03a 1.520±0.01a 67.68±1.85b 10 d菌株Y14 菌株Y15 1 160.11±16.35a 1.241±0.04c 69.54±3.19a 59.28±0.74b 1.472±0.04b 70.20±1.69a 1 167.42±15.33a 1.389±0.02b 72.25±1.29a 61.59±1.52a 1.424±0.01c 63.85±0.76c
发酵食品的总酚含量的增加可能是由于一些酵母菌株，能够以某种方式从头从氨基酸合成多酚化合物，其抗氧化能力与总酚及黄酮类化合物存在正相关性[28-29]。LIU B等[30]利用土壤伊萨酵母（Issatchenkia terricola）发酵柠檬汁，发酵结束时柠檬汁柠檬酸含量降低了84.28%，总酚、总黄酮含量以及抗氧化性能相比对照组均呈上升趋势，与本实验结果一致。结果表明，纯种发酵青金桔全果浆产品有一定的体外抗氧化能力，具有开发应用价值，能够应用于健康食品的研发。
3 结论
本研究从青金桔自然发酵液中通过传统分离、纯化分离得到3株酵母菌株Y1、Y14和Y15，经过生长性能测定发现在灭菌青金桔全果浆中均能良好生长。通过菌落形态和细胞形态观察结合ITS测序鉴定，菌株Y1为特立科拉毕赤酵母（Pichiaterricola），菌株Y14、Y15为仙人掌有孢汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae）。3株酵母菌能耐受35 ℃、400 g/L葡萄糖和pH 2.0的环境条件。利用3株酵母纯种发酵青金桔全果浆均能显著提升其总酚含量、总黄酮含量和抗氧化能力，可以抑制α-葡萄糖苷酶活性。本研究筛选获得的3株酵母菌在青金桔全果浆中具备较好的发酵性能、生长特性与耐受能力，在后续优质青金桔产品开发的利用上具有巨大潜力。
但目前，以上3株酵母的潜在功能特征，如：毒力因子、对人类和动物临床相关的抗微生物药物的耐药性、已知有毒代谢物的产生、代谢通路、碳水化合物活性酶功能等亦不明确。在后续的研究工作中，需要对酵母菌纯种发酵的条件进行优化，对主要代谢产物和挥发性物质等进行检测，对菌株的全基因组测序及益生特性等进行评价，全面、准确掌握3株酵母菌的潜在功能特性，将其开发成工程菌，实现在青金桔发酵产品生产中的推广应用和生产过程精准化控制。
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