近年来，随着我国经济从高速增长阶段转向高质量发展阶段，人们对优质葡萄酒的市场需求越来越多元化、细分化，消费更加理性[1-2]。然而，在储存和销售过程中，葡萄酒化学成分之间的相互作用和外界因素的影响会改变其稳定状态，产生失光、浑浊、沉淀等现象，从而影响货架期葡萄酒的饮用品质[3]，但消费者更喜欢澄清的葡萄酒[4]。因此，葡萄酒装瓶后，需要在尽量长的时间内，保持酒液澄清和稳定。
引起葡萄酒浑浊的因素主要包括生物因素和非生物因素[5]。由于卫生管理不当使酒液受到微生物污染所产生的生物浑浊，要求在葡萄酒酿造的各个阶段对微生物进行控制，以保证产品的质量和安全[6]。非生物浑浊主要由酒石酸、蛋白质、金属离子、果胶物质和色素等引起，这与葡萄酒酿造和储存过程中发生的各种物理和化学变化有关，很大程度上影响葡萄酒的外观、香气和口感质量。近年来，随着酿酒设备和加工技术的不断完善，以及专业技术人员水平的不断提升，葡萄酒酿造过程中出现的浑浊问题已得到有效控制[7]，而储存期间特别是葡萄酒装瓶后出现的浑浊现象日益引起人们的重视[8]。相关文献研究显示，葡萄酒中生物浑浊的鉴定多采用表型分类法[9]、基因型鉴定[10]等方法。非生物浑浊的鉴定多采用定性鉴定、稳定性实验、感官评价等方法[11]。但在实际的鉴定操作中，仅用1种方法很难将所有的浑浊物全部鉴定出来，通常需要用到2种或者多种方法来综合分析，才能最终确定浑浊物质的成分。
本研究以4款浑浊的年轻瓶装红葡萄酒为试材，通过对沉淀物的镜检和定性鉴定，酒样的理化分析和感官评价，研究浑浊酒样的特征表现及可能成因，为有效防止瓶装红葡萄酒出现浑浊问题、提升产品质量稳定性提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
4 款年轻瓶装浑浊红葡萄酒：智利原瓶进口酒，均为2019年灌装的单品种干红葡萄酒，包括‘赤霞珠’干红（2017和2018）、‘美乐’干红（2018）和‘佳美娜’干红（2018）葡萄酒；浑浊出现时间为2021年12月，酒液呈棕红色、浑浊失光、有棉絮状悬浮物和沉淀；样品检测时间为2022 年3 月。从葡萄酒酿造一直到出现瓶内浑浊，时间仅有3～4 年，故将其视为浑浊的年轻瓶装红葡萄酒。
1.1.2 化学试剂
（+）-儿茶素标准品（≥98%）、Trolox 标准品（97%）、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）（≥98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、菲洛嗪、对二甲氨基肉桂醛（4-dimethylaminocinnamaldehyde，DMACA）（≥96%）：美国Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Cary60 紫外可见分光光度计：美国安捷伦科技有限公司；FE20 pH计：瑞士梅特勒-托利多公司；BT25S分析天平：德国赛多利斯集团；BX1000生物显微镜：重庆中显光电仪器有限公司；DK-S24电热恒温水浴箱：上海森信实验仪器有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵：天津市津腾实验设备有限公司；CSAS-轻松感官分析软件系统：上海瑞芬智能科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 沉淀物的收集
一方面，用定性滤纸自然过滤，分别收集沉淀和滤液。另一方面，使用0.45 μm 的水相滤膜对样品进行抽滤，除去首先滤出的部分酒样；抽滤结束后，将沉淀和上清液分离，收集沉淀。
1.3.2 镜检
参照王华等[12]的方法，将沉淀物放至显微镜下观察，生物性沉淀多为细胞状，非生物性沉淀则呈现结晶状或非晶形沉淀；同时结合酒石和色素稳定性试验进行验证。
（1）生物性浑浊
在显微镜下观察酵母，放大600倍可以看清，样本不必做完固定手续，亦不必染色。在显微镜下观察细菌，至少要放大900 倍，才能看得清楚。做好固定手续，必要时进行革兰氏染色。若酒体中出现乳酸杆菌，在染色后菌体呈现紫色，若出现醋酸杆菌则呈现红色。
（2）非生物性浑浊
将镜检结果与《果酒和果汁饮料实用显微图谱》[13]和葡萄酒中可能出现的非生物性沉淀的显微特征[11]进行对照，判断非生物性浑浊的类型。
1.3.3 酒样基本理化指标的测定[14-15]
总糖、还原糖含量：采用斐林试剂滴定法（以葡萄糖计）测定；总酸（以酒石酸计）和挥发酸（以醋酸计）含量：采用酸碱滴定法测定；酒精度：采用密度瓶法检测；游离SO2、总SO2含量：采用氧化法检测；pH 值：采用酸度计法；总铁含量：利用课题组前期构建的改良菲洛嗪法测定。
1.3.4 颜色参数的测定
色度、色调的测定：参照CLIFF M A等[16-17]的方法，采用紫外可见分光光度计测定，计算时扣除酒样浊度的影响。使用1 mm光程石英比色皿，测定样品在波长420 nm、520 nm、620 nm、700 nm 处的吸光度值，读数校正乘以10，色度和色调计算公式如下：
色度=（[A420-A700）+（A520-A700）+（A620-A700）]×10
色调=（A420-A700）（/A520-A700）
辅色花色苷、单体花色苷、聚合花色苷和总花色苷的测定：检测波长为520 nm，取20 μL 体积分数20%的乙醛加入2 mL酒样中，室温条件下静置45 min 后，使用1 mm 比色皿测定乙醛的吸光度值（A乙醛）；用模拟酒（7.0 mmol/L酒石酸和11.0 mmol/L酒石酸氢钾溶解到12%vol乙醇水溶液，并用1.0 mol/L HCl、NaOH将溶液pH调至3.5）将酒样稀释20倍，取稀释样置于1 cm比色皿中测定酒样的吸光度值（A酒样），计算时乘以稀释倍数20；将160 μL 5%二氧化硫溶液加入2 mL酒样中，静置10 min后，使用1 mm比色皿测定二氧化硫的吸光度值（A二氧化硫）。不同种类花色苷含量的计算公式如下：
辅色花色苷=（A乙醛-A700）×10-（A酒样-A700）×20
单体花色苷=（A酒样-A7700））×20-（A二氧化硫-A700）×10
聚合花色苷=（A二氧化硫-A700）×10
总花色苷=（A乙醛-A700）×10
参照李运奎等[18]的方法检测葡萄酒颜色空间参数。将葡萄酒样经0.22 μm滤膜过滤后，采用2 mm 光程玻璃比色皿，以去离子水作参比，用紫外分光光度计扫描酒样在可见光区波长400～780 nm处的吸收光谱，间隔1 nm。CIELab颜色参数计算选用10°观察者视场，D65 标准白光源。将吸收光谱中波长450 nm、520 nm、570 nm、630 nm处的吸光度值校正到1 cm光程后，计算颜色参数L*（明度）、a*（红色/绿色）、b*（黄色/蓝色）、C*ab（饱和度）、hab和ΔE（色差），其计算公式如下：
式中：X、Y、Z为样品三刺激值；Xn、Yn、Zn为D65标准白光三刺激值，分别取94.825、100.000、107.381。
1.3.5 酚类物质和抗氧化活性的测定
参照LI H等[19]的方法，测定总酚含量（福林-肖卡法）、总黄烷醇含量（对二甲氨基肉桂醛法）和总类黄酮含量（亚硝酸钠-氯化铝法），结果以（+）-儿茶素当量值（mg/L）表示；采用ABTS和DPPH自由基清除法测定葡萄酒抗氧化活性，结果以Trolox当量值（μmol/L）表示。
1.3.6 感官评价
参考杨洁等[20-21]的方法，对品评员进行培训、考核和筛选。评价员经过葡萄酒品评、风味参比样辨别测试与定量描述性分析等训练后，借助Panel Check 软件评估品评员和品评小组表现，组建可靠品评小组：共13 人，年龄在18～25 岁，主要由西北农林科技大学葡萄酒学院大三、大四本科生和研究生组成。品评地点为西北农林科技大学葡萄酒学院感官分析实验室。
香气的定量描述性分析：所有酒样采用随机三位数编码，对于提供的每一个样品，要求每位评价员使用3～5 个香气描述符评价该款酒的特征香气。然后，采用0～5 标度法（其中“0”代表没有感觉，“1”代表弱，“2”代表稍弱，“3”代表平均，“4”代表稍强，“5”代表强）对使用的每一个描述符进行强度定量。样品品评中间最好休息2 min，并提供纯净水和无盐饼干。
根据品酒设计，提前将酒样编号、香气描述符、定量描述性分析方法等录入“CSAS-轻松感官分析软件系统轻松感官分析软件”。评价员利用电脑在线操作，完成评价后软件自动收集感官数据。
1.3.7 数据统计分析
数据汇总整理及图表制作采用Microsoft Excel 2019，使用统计分析软件DPS V6.55 进行数据的差异显著性分析，P＜0.05 表示差异达到显著性水平，并进行相关性分析；借助数据处理软件DPS V6.55和Origin 2019软件对感官评价结果进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。
2 结果与分析
2.1 4款年轻瓶装红葡萄酒中浑浊沉淀的定性鉴定
4款年轻瓶装红葡萄酒中浑浊、沉淀在显微镜下的图片镜检结果见图1。由图1可知，初步判断4款年轻瓶装红葡萄酒浑浊、沉淀为非生物性浑浊。根据色素和酒石的稳定性试验结果可知，4款酒样色素和酒石均不稳定，酒样沉淀中含有色素沉淀和酒石沉淀，且均含有很少的纤维沉淀。李泽福等[22]的研究显示，酒石稳定性和色素稳定性均受温度变化影响。与相关文献[22-23]的显微镜镜检结果比较发现，2018‘赤霞珠’干红葡萄酒中存在铁沉淀；2017‘赤霞珠’、2018‘美乐’、2018‘佳美娜’干红葡萄酒中均有酒石酸钙晶体；2018‘美乐’干红葡萄酒中含有酒石酸钾钠、硫酸钙晶体。
图1 4款年轻瓶装红葡萄酒中沉淀显微结果
Fig.1 Microstructure of turbidity and precipitation occurred in 4 young bottled red wines
A、B、C、D 按顺序依次为2017‘赤霞珠’干红、2018‘美乐’干红、2018‘佳美娜’干红和2018‘赤霞珠’干红。
2.2 4款年轻瓶装红葡萄酒的基本理化指标
4款年轻瓶装红葡萄酒的基本理化指标见表1。
表1 4款年轻瓶装红葡萄酒的基本理化指标
Table 1 Basic physiochemical indicators of 4 young bottled red wines
注：表中同一列不同字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。下同。
酒样 游离SO2/（mg·L-1）总SO2/（mg·L-1）总糖/（g·L-1）（g·L-1） pH值 总酸/（g·L-1）还原糖/挥发酸/（g·L-1）总铁/（mg·L-1）实测酒精度/%vol酒标酒精度/%vol 2017赤霞珠2018美乐2018佳美娜2018赤霞珠平均值1.36±0.28b 2.92±0.28a 1.17±0.01b 1.95±0.28a 1.85 14.0 13.5 13.5 13.5 13.5 7.45±1.11c 24.93±1.10b 13.24±0.55c 21.03±2.75a 16.66 6.70±0.14a 6.52±0.40a 6.30±0.14a 6.70±0.14a 6.56 5.27±0.18d 5.52±0.05c 6.11±0.01b 6.36±0.06a 5.82 3.44±0.01a 3.36±0.01c 3.45±0.01a 3.40±0.01b 3.41 5.84±0.10a 5.88±0.05a 5.91±0.05a 5.35±0.08b 5.75 0.73±0.01b 0.50±0.01c 0.78±0.02a 0.47±0.04c 0.62 2.58±0.01c 2.81±0.11c 3.19±0.06b 3.67±0.02a 3.06 13.35±0.24a 12.37±0.23b 12.69±0.23ab 12.69±0.23ab 12.78
由表1可知，4款年轻瓶装红葡萄酒的酒精度、总糖、还原糖、总酸含量均符合国家标准（GB/T 15037—2006《葡萄酒》）的规定[24]，且均为干型葡萄酒（总糖≤4.0 g/L的葡萄酒或者总酸与总糖的差值≤2.0 g/L时，总糖最高为9.0 g/L的葡萄酒）。然而，酒样中总SO2含量为7.45～24.93 mg/L，游离SO2含量为1.17～2.92 mg/L。SO2在葡萄酒中具有抑菌和抗氧化作用，而其有效质量浓度通常为20～40 mg/L[25]。
4款年轻瓶装红葡萄酒总铁含量为2.58～3.67 mg/L。研究显示，微量铁可以加速酚类物质的氧化，引起葡萄酒氧化褐变，严重影响葡萄酒的感官质量[26]。同时，与酒瓶标签上的酒精度相比，4 款酒样的酒精度均有不同程度的下降。
2.3 4款年轻瓶装红葡萄酒的颜色指标
4款年轻瓶装红葡萄酒的颜色指标见表2。
表2 4款年轻瓶装红葡萄酒的色度、色调和CIELAB颜色参数
Table 2 Chromaticity, hue and CIELAB color parameters of 4 young bottled red wines
酒样 色度 色调 L*值 a*值 b*值 C*ab值 hab值/（°） ΔE（以模拟酒为参比）2017赤霞珠2018美乐2018佳美娜2018赤霞珠平均值0.50±0.01d 0.70±0.01b 0.63±0.01c 0.73±0.01a 0.64 1.48±0.01a 1.06±0.01d 1.18±0.01b 1.08±0.01c 1.20 88.50±0.02a 81.49±0.12d 84.47±0.15c 80.89±0.17b 83.84 8.08±0.04d 17.29±0.05a 13.39±0.10b 17.56±0.06c 14.08 18.19±0.06a 12.33±0.19c 17.24±0.07c 12.19±0.01b 14.99 19.90±0.07d 21.24±0.08c 21.83±0.11a 21.38±0.06b 21.09 49.06±0.03a 31.77±0.35c 42.32±0.06b 31.26±0.05d 38.61 22.99±0.05d 28.17±0.14b 26.79±0.18c 28.68±0.15a 26.66
由表2可知，2018年‘赤霞珠’葡萄酒的色度最高，颜色最深；2017年‘赤霞珠’葡萄酒的色度最低，颜色最浅。酒样整体亮度较高，这是由于测定前过滤酒样（沉淀被除去）。酒样的a*值较低，说明红色占比较低；酒样的b*值为12.19～18.19，黄色色调突出；酒样的颜色饱和度C*ab较低，而酒样的hab值较高。这表明酒样颜色已从新鲜红葡萄酒的紫红色、宝石红色，转变为带有陈酿特点（带黄色色调）的砖红色、瓦红色。
4款年轻瓶装红葡萄酒花色苷的组成与含量分析见图2。
图2 4款年轻瓶装红葡萄酒花色苷的组成与含量分析
Fig.2 Composition and contents analysis of anthocyanins in 4 young bottled red wines
不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图2可知，4款酒样花色苷总含量为1.95～3.38AU；所有酒样都以聚合花色苷为主（占总花色苷的76.61%～82.16%），其次是辅色花色苷（9.95%～15.49%），单体花色苷（6.45%～7.90%）所占比例最小。在葡萄酒陈酿过程中，单体花色苷与聚合花色苷的形成有关，这些反应使年轻葡萄酒的颜色从鲜红色变为砖红色[27-28]。考虑到酒样酿制年份（至酒液呈棕红色仅3～4 年），说明葡萄酒颜色老化严重。
2.4 相关性的分析
为了探讨瓶装年轻红葡萄酒浑浊的可能成因，分析了酒样理化指标之间的相关性，结果见表3。
表3 4款年轻瓶装红葡萄酒理化指标的相关性分析
Table 3 Correlation analysis of physiochemical indicators of 4 young bottled red wines
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
相关系数 游离SO2 总SO2 总酚 总类黄酮 总黄烷醇 DPPH自由基清除活性ABTS自由基清除活性 色度 色调 a*值 b*值游离SO2总SO2总酚总类黄酮总黄烷醇DPPH自由基清除活性ABTS自由基清除活性色度色调a*值b*值总花色苷辅色花色苷单体花色苷聚合花色苷1 0.87 0.95*0.96**0.91*0.28 0.91*0.62-0.63 0.69-0.83 0.71 0.91*-0.02-0.98**1 0.86 0.93*0.96**0.66 0.97**0.93*-0.92*0.95*-0.96*0.96**0.96*-0.35-0.95*1 0.99**0.96**0.47 0.96*0.67-0.61 0.72-0.91*0.75 0.96**-0.30-0.97**1 0.99**0.52 0.99**0.77-0.73 0.81-0.95*0.84 0.99**-0.29-0.99**1 0.65 1.00**0.85-0.81 0.88*-0.99**0.91*1.00**-0.42-0.97**1 0.65 0.87-0.78 0.83-0.77 0.83 0.65-0.91*-0.47 1 0.86-0.82 0.89*-0.98**0.91*1.00**-0.40-0.98**1-0.98**1.00**-0.91*0.99**0.85-0.59-0.76 1-0.99**0.85-0.97**-0.80 0.44 0.75 1-0.93*1.00**0.88-0.53-0.81 1-0.95*-0.99**0.55 0.93*
由表3可知，浑浊酒样的颜色参数与SO2含量、酚类物质和抗氧化活性表现出显著相关性（P＜0.05），这说明葡萄酒颜色的变化与葡萄酒的过快氧化有关。适量氧化有利于稳定红葡萄酒颜色，但是过度氧化则会导致褐变[29]。在本试验中，葡萄酒中总SO2含量越高，酒体红色色调比重越大，更倾向于呈现紫红色或宝石红色（年轻红葡萄酒颜色）；葡萄酒中总SO2含量越低，酒体颜色更倾向于呈现瓦红或砖红（陈年红葡萄酒的颜色），酒体的抗氧化活性越弱；游离SO2含量越低，聚合花色苷越高。由前面镜检结果可知，葡萄酒中存在酒石、色素沉淀，这与酒样中花色苷的形态分布有关（所有酒样中的聚合花色苷＞76%）。马文超等[30]也认为，红葡萄酒中铁沉淀和色素沉淀的产生可能与酒样的过早氧化有关。
2.5 4款年轻瓶装红葡萄酒香气的定量描述性分析
以4 款酒样特征香气描述符的强度为原始变量，进行主成分分析（PCA），结果见图3。由图3可知，前两个主成分PC1（60.5%）和PC2（26.2%）可以解释感官香气属性原始变量的86.7%。
图3 4款年轻瓶装红葡萄酒特征香气的主成分分析
Fig.3 Principal component analysis of characteristic aromas of 4 turbid young bottled red wines
由图3可知，描述符黑醋栗、醋酸、巧克力等焙烤类香气位于PC1正半轴，描述符樱桃、草莓、覆盆子位于PC1负半轴；此外，位于PC2负半轴表示红色水果香浓郁，反之则表示橡木、胡椒等香气浓郁。酒样特征分析结果显示，酒样2017‘赤霞珠’和2018‘美乐’分布在PC1正半轴和PC2正半轴，相较其他试样来说，焙烤类香气和橡木桶带来的陈酿香气突出。试样2018‘佳美娜’、2018‘赤霞珠’与其他样品区分明显，前者红色水果香明显，并有蘑菇香气；后者红色水果香、花香浓郁。除2018‘赤霞珠’外，其他3款酒样葡萄品种香（果香）较弱，以橡木味、胡椒味、巧克力味为主，并有明显氧化味，即香气呈老化特征。研究显示，由于氧化作用会产生过熟的水果或煮熟的蔬菜气味，果香会向焦糖、松露、皮革、雪松等香气转变[31-32]。
众所周知，在瓶储过程中，红葡萄酒除受自身化学成分影响外，储存条件（光照、温度、相对湿度、酒瓶放置方式、瓶塞类型等）是影响其保存质量和货架期的重要因素，其中储存温度的影响最大[3，7，17，28，33]；较高的储存温度会加速氧化反应，促进葡萄酒的成熟和老化[34]。在前期的研究中也发现，酒瓶横放和较低的储存温度（如酒柜）更适于红葡萄酒的长期保存，瓶装赤霞珠红葡萄酒的储存期间颜色和感官品质的变化与葡萄酒中发生的氧化反应密切相关，其是多个因素（氧气、储存温度和时间）综合作用的结果[33]。然而，目前国内外有关红葡萄酒老化的研究还很少，亟需深入研究。另一方面，由于红葡萄酒成分繁多，导致其出现浑浊的原因比较复杂，要完全澄清瓶装年轻葡萄酒浑浊背后的根本原因，除考虑储存环境因素外，还需要结合酿酒原料（葡萄品种、原料成熟度、卫生状况等）、酿酒工艺（发酵条件、工艺流程等）、陈酿条件等进行深入探讨。
3 结论
在实验条件下，通过对浑浊沉淀的镜检和酒样理化指标的检测与分析，结合感官评价，结果发现：4 款浑浊年轻瓶装红葡萄酒主要表现为非生物性浑浊，沉淀主要包括纤维沉淀、色素沉淀和酒石沉淀；考虑到葡萄酒酿造年份（距离出现浑浊仅3～4 年），所有酒样均表现出老化特征（颜色呈棕红色，以聚合花色苷为主，酒液浑浊失光；香气以焙烤类和佐料类香气为主，缺乏年轻红葡萄酒酒应有的果香或品种香气；相关分析进一步证实，葡萄酒的老化现象主要与其过早氧化有关，适宜的储存条件（尤其是温度）是保证年轻瓶装葡萄酒品质的关键。
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