白酒是中国的国酒，体现着中华民族独特的文化内涵，其酿造历史可以追溯到公元前2世纪夏代的“仪狄作酒”，位置在今河南省南阳市赊店镇，并在此将酿酒之法传播开来[1-2]。其后，汉光武帝刘秀在此赊“刘”字酒旗起义，成就汉朝“光武中兴”，于是御封酒家为“赊店”老酒；及至明、清时期，赊店老酒随着商路而盛行天下。白酒的发酵从曲药中的微生物作用开始，以粮谷为主要原料酿制而成，优质的白酒能表现出醇厚、绵甜的口感[3-5]，但是个别企业违反食品安全标准的明确规定，添加使用低热量合成甜味剂调整产品的感官效果；在白酒的市场抽检中甜味剂屡有检出[6-7]。氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是发酵类食品在生产和贮存过程中产生的有害物质，研究表明其对人体健康会构成危害[8-9]。
目前，多位研究者对甜味剂和氨基甲酸乙酯的测定监控做出了探索，采用了固相萃取-高效液相色谱法、离子色谱法、气相色谱-质谱联用法等对甜味剂进行检测，但存在前处理操作繁琐，方法检出限较高的问题，实际应用时有一定局限性[10-16]。
液相色谱-质谱联用技术具有高选择性、高准确度、高灵敏性，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用[17-22]。利用液相色谱-串联质谱法测定食品中甜味剂的研究中，回收率和精密度良好，但是仅测定了有限的几种甜味剂，不能满足日常监测需要[23-25]。因此，检测监控方面也需要构建一种能够同时满足氨基甲酸乙酯检测和多种甜味剂检测的方法[26-27]。本实验拟建立一种液相色谱串联质谱仪（ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测白酒中氨基甲酸乙酯和三氯蔗糖、糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜、阿力甜、甜菊糖苷8种甜味剂的方法，以期可用于白酒企业的日常监测控制和市场监督抽查。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇、乙酸（均为色谱纯）：美国ACS公司；氨基甲酸乙酯（纯度99.8%）、糖精钠（纯度99.0%）、甜蜜素（纯度99.0%）、阿斯巴甜（纯度98.5%）、阿力甜（纯度99.6%）、甜菊糖苷（纯度99.7%）：北京北方伟业计量技术研究院；纽甜（纯度99.80%）、安赛蜜（纯度100.00%）、三氯蔗糖（纯度99.75%）：美国Stanford Analytical Chemical公司；0.22 μm有机滤膜：上海安谱科学仪器有限公司；实验用水为超纯水。
测定样品：在当地市场上随机购买。
1.2 仪器与设备
Agilent 1290-6475 UPLC-MS/MS超高效液相色谱仪-串联质谱仪：美国Agilent公司；优普UPD-I-10T型超纯水机：四川优普超纯科技有限公司；奥豪斯PX224ZH/E万分之一电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液配制
分别准确称取10 mg（精确至0.1 mg）氨基甲酸乙酯、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、甜蜜素、甜菊糖苷和阿力甜标准品于10 mL棕色容量瓶中，用20%甲醇-0.1%乙酸水溶液溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度1 000 mg/L的混合标准储备液。将标准储备溶液置于4 ℃冰箱中保存，使用前以20%甲醇-0.1%乙酸水溶液逐级稀释成2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、250 μg/L、500 μg/L混合标准工作液，供液质联用仪进样测定。
1.3.2 样品前处理
白酒样品直接用0.22 μm有机滤膜过滤，滤液供检测。
1.3.3 色谱条件
AgilentZORBAXRRHD Eclipse PlusC18色谱柱（100mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温40 ℃，进样量2 μL；流动相：A为0.1%乙酸水溶液，B为甲醇，流速：0.35 mL/min；梯度洗脱程序：0～4.0 min，20%B；4.1～6.0 min，90%B；6.1～9.0 min，20%B。
质谱条件：分别在正、负离子模式下获得各标准物质的全扫描谱图，优化其碎裂电压并进行产物离子扫描和碰撞能量优化，得到目标化合物的离子对参数。检测过程使用电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源，根据目标化合物离子对在正、负离子模式下的灵敏度不同而分类检测，采用多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）定量。干燥气流量11.5 L/min，干燥气温度300 ℃；雾化气压力28.0 psi；鞘气流量12.0 L/min，鞘气温度360 ℃。毛细管电压：正模式3 400 V，负模式3 000 V；喷嘴电压：正模式1 000 V，负模式500 V。
1.3.4 洗脱程序条件优化
分别采用3种洗脱程序进行对比实验：（a）0～1.0 min，20%B；1.1～3.0 min，90%B；3.1～6.0 min，20%B；（b）0～2.5 min，20%B；2.6～4.5 min，90%B；4.5～7.5 min，20%B；（c）0～4.0 min，20%B；4.1～6.0 min，90%B；6.1～9.0 min，20%B。
1.3.5 前处理优化方法
以52%vol浓香型赊店老酒作为基底，加入氨基甲酸乙酯和8种甜味剂标准物质（加标质量浓度100 μg/L），0.22 μm有机滤膜过滤后直接进质谱分析。分别考察不同进样量条件下（8 μL、4 μL、2 μL、1 μL）的色谱分离效果。
1.3.6 方法学考察
检出限（limit of detection，LOD）：用信噪比（signal-tonoise ratio，S/N）为3时的标准物质溶液浓度确定检出限。
定量限（limit of quantitative，LOQ）：用信噪比（signalto-noise ratio，S/N）为10时的标准物质溶液浓度确定定量限。
线性范围（linear range）：考察系列标准物质溶液的测定响应值与浓度之间的线性回归相关系数＞0.99时的浓度范围确定为线性范围。
加标回收率试验：取52%vol浓香型赊店老酒样品作为基质，加入9种待测物配制成100 μg/L浓度水平进行回收实验，用0.22 μm有机滤膜过滤后进样测定，进行6次平行实验，计算回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
由图1可知，c洗脱程序的分离效果优于a和b洗脱程序，对三氯蔗糖和阿斯巴甜进行了较好的分离，三氯蔗糖的质谱响应弱、碎片离子丰度低，将二者分离后有利于提高三氯蔗糖测定的准确度和重复性；氨基甲酸乙酯与安赛蜜共流出，但二者质谱响应较强，通过提取MRM色谱图可以准确定量；c洗脱程序下目标化合物的响应值及保留时间的稳定性较好，综合衡量选定c梯度洗脱程序。
图1 混合标准溶液在不同洗脱程序下的总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of mixed standard solution under different elution procedure
2.2 质谱条件的优化
本实验选用电喷雾离子源（ESI），分别在正、负离子模式下以进样方式对氨基甲酸乙酯和8种甜味剂进行全扫描，得到目标化合物一级质谱图和准分子离子峰；使用产物离子扫描模式获得二级质谱图和相应子离子。
结果表明，氨基甲酸乙酯在正离子模式下响应值优于负离子模式；甜蜜素在负离子模式下得到丰度较高的碎片离子（178.1～79.9），作为定量离子对；正离子模式下得到丰度较好的定性离子碎片（202.0～122.0）。故本实验采用正负离子模式切换检测的方式（表1），利用多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）对选定的定量和定性离子对进行质谱碎裂电压、碰撞能量、毛细管电压、鞘气流量等采集参数和离子源参数的优化，优化后的质谱采集参数见表1。图2为9种目标化合物的总离子流色谱图（total ion chromatogram，TIC）。
表1 氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的质谱采集参数
Table 1 Mass spectrum parameters of ethyl carbamate and 8 sweeteners
注：“*”表示定量离子。
化合物前级离子（m/z）产物离子（m/z）碎裂电压/V碰撞能量/eV极性三氯蔗糖糖精钠甜蜜素安赛蜜阿斯巴甜阿力甜纽甜甜菊糖苷氨基甲酸乙酯395.0，397.1 182.0 178.1，202.0 162.0 293.1 330.2 377.4 803.4 90.0 359.0*，360.6 41.9*，106.0 79.9*，122.0 77.9，82.0*200.1，261.1*295.1，312.2*200.1*，345.2 641.1*62.0*133 130 150，85 87 130 100 180 135 60 8，10 41，19 33，5 35，15 12，8 20，10 20，10 25 6负负负，正负负负负负正
表2 氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限
Table 2 Linear equations, correlation coefficients, linear range,detection limit and quantification limit of ethyl carbamate and 8 sweeteners
化合物线性方程相关系数（R2）线性范围/（μg·L-1）检出限/（μg·L-1）定量限/（μg·L-1）阿力甜糖精钠甜蜜素安赛蜜阿斯巴甜三氯蔗糖纽甜甜菊糖苷氨基甲酸乙酯y=79.98x-221.83 y=18.48x+19.68 y=74.70x+7.50 y=67.53x+133.90 y=14.97x-5.52 y=10.82x+87.71 y=26.64x-48.51 y=40.65x+523.77 y=68.16x-2.57 0.999 6 0.999 9 0.999 9 0.999 8 0.999 9 0.997 6 0.999 6 0.999 8 0.999 9 2～500 2～500 2～500 2～500 2～500 2～500 2～500 2～500 2～500 0.2 0.1 0.3 0.1 0.4 0.2 0.1 0.1 0.2 0.7 0.3 1.0 0.3 1.3 0.7 0.3 0.3 0.7
图2 氨基甲酸乙酯（A）和8种甜味剂混合标准溶液（B）的总离子流色谱图
Fig.2 Total ion chromatogram of ethyl carbamate (A) and 8 sweeteners mixed standard solution (B)
1.安赛蜜（1.174 min）；2.氨基甲酸乙酯（1.191 min）；3.糖精钠（1.700 min）；4.甜蜜素（3.179 min）；5.三氯蔗糖（5.005 min）；6.阿斯巴甜（5.676 min）；7.阿力甜（6.084 min）；8.纽甜（6.577 min）；9.甜菊糖苷（6.781 min）。
2.3 前处理方法的选择
白酒基质含有较大浓度的乙醇，可能会影响待测化合物在色谱柱上的吸附解吸过程[28]。减少基质中乙醇影响的方法有两个方向：降低样品进样量和稀释样品浓度；通过采用不同进样量下的色谱分离效果研究（见图3）发现：进样量为8 μL、4 μL时，峰形展宽、有肩峰；进样量为2 μL、1 μL时，色谱峰对称、尖锐，洗脱效果较好，但考虑到三氯蔗糖碎片离子的丰度较低，需要相对较大的进样浓度，因此选取进样量为2 μL。结合氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的加标回收率数据，在进样量为2 μL时，可以实现对目标化合物的准确定量。同时，氨基甲酸乙酯和甜味剂在白酒样品中的含量一般较低，直接进样分析能够在一定程度上避免稀释酒精度等处理步骤引入的误差。综上所述：本实验选择白酒样品经0.22 μm有机滤膜过滤后直接进样分析，进样量2 μL。
图3 混合标准溶液在不同进样量下的总离子流色谱图
Fig.3 Total ion chromatogram of mixed standard solution at different injection volumes
a：进样量8 μL；b：进样量4 μL；c：进样量2 μL；d：进样量1 μL。
2.4 方法的线性范围和检出限
将含有9种待测物的混合标准储备液用初始流动相（20%B-80%A）稀释成10 mg/L的混合标准中间液，再分别稀释至混合标准工作液系列：2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、250 μg/L、500 μg/L。按照优化后的洗脱程序和质谱参数进样检测，并以目标化合物的峰面积y对相应的质量浓度x绘制标准工作曲线。
2.5 精密度和加标回收率
取白酒样品加入9种待测物配制成100 μg/L浓度水平进行回收实验，用0.22 μm有机滤膜过滤后进样测定，进行6次平行实验，计算回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。
表3 氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的加标回收实验结果（n=6）
Table 3 Results of recovery tests of ethyl carbamate and 8 sweeteners (n=6)
化合物本底值/（μg·L-1）加标量/（μg·L-1）测定值/（μg·L-1）回收率/%RSD/%三氯蔗糖糖精钠甜蜜素安赛蜜阿斯巴甜阿力甜纽甜甜菊糖苷氨基甲酸乙酯00000000 13.6 100 100 100 100 100 100 100 100 100 108.7 106.7 104.2 107.2 101.5 92.6 106.6 102.8 115.0 108.7 106.7 104.2 107.2 101.5 92.6 106.6 102.8 101.4 1.11 0.98 0.60 1.04 1.06 0.52 1.23 1.29 1.04
由表3可知，白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的回收率为92.6%～108.7%，相对标准偏差（RSD）均＜2%。方法的准确度和精密度符合残留分析的要求。
2.6 样品检测
对当地市售白酒随机选取10组样品，使用本检测方法进行目标化合物的测定，每个样品做3次平行实验，结果表明，在3号白酒样品中检测到甜蜜素（20.2 μg/L）和甜菊糖苷（81.4 μg/L），10号样品中检测出甜菊糖苷（35.3 μg/L），全部样品均检测出一定量（17.3～92.2 μg/L）的氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）。
3 结论
建立了采用液相色谱串联质谱仪（UPLC-MS/MS）对白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂含量的检测方法。白酒样品经0.22 μm有机滤膜过滤后直接进样测定，在进样量为2 μL时，待测物出峰峰形对称，可以对目标化合物进行准确定量。9种待测物在质量浓度2～500 μg/L范围内有良好的线性关系，相关系数R2＞0.997，方法检出限（S/N=3）为0.1～0.4 μg/L，在100 μg/L加标水平下，回收率在92.6%～108.7%，RSD均＜2%。该检测方法前处理简单、重现性好、灵敏度高、分析速度快，可用于白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的快速检测和日常监测。对于保障白酒产品的质量安全和维护市场秩序有重要意义，为白酒安全指标的准确、快速测定提供了有力的技术支持。
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