类胡萝卜素是一类具有抗炎、抗氧化、调节血脂、延缓衰老等多种生理作用的脂溶性四帖类天然色素的总称[1-4]。目前已被广泛应用于食品、保健品及医药等行业[5-6]。类胡萝卜素存在于黄色、橙红色或红色的水果或蔬菜之中，现已被分离鉴定出番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质和叶黄素等750多种单体化合物[7-9]。其中，番茄红素更利于机体利用吸收，α-胡萝卜素、β-胡萝卜素进入人体后也会进一步转化为番茄红素[10-12]。由于人体无法自主合成番茄红素，故需要从水果或蔬菜（如番茄、胡萝卜、西瓜、芒果、枇杷和南瓜等）中摄取[13-15]。因此，将上述果蔬加工成富含番茄红素的食品将会有较大的市场价值。
前期研究发现，利用番茄汁、芒果汁、南瓜汁和枇杷汁制成的复合果蔬酒不仅具有优良的感官品质，而且含有（19.57±0.52）μg/mL番茄红素，但番茄红素含量较酿造原料的四种果蔬汁下降了75.31%[16]。陈兴思[17]研究发现，番茄榨汁过滤后的果渣中还存在较高含量的番茄红素，因此需要将果渣合理利用以获得较高含量番茄红素的复合果蔬酒。刘英杰等[18-20]研发的水果果肉与果汁共同酿造果酒的技术，不仅可以改善果酒的风味特征，而且能较好保留酿造原料中的营养成分和活性物质。但果肉与果汁共同酿造技术对果酒中番茄红素的影响却鲜有研究。
故本试验在前期研究工作的基础上[16]，拟采用果肉与果汁共同酿造技术，并通过单因素试验及响应面试验对复合果蔬酒的酿造工艺进行优化，以期提高复合果蔬酒中番茄红素的含量，同时分析其抗氧化活性，拓宽复合果蔬酒的市场应用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
番茄（千禧果）、芒果（台农1号）、南瓜（密本）、枇杷（大五星）、白砂糖：市售；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC31482：宜宾职业技术学院菌种保藏中心；果胶酶（酶活105 U/mL）：上海杰兔工贸有限公司；偏重亚硫酸钾（食品级）、维生素C（纯度≥99.0%）：桂林宝钻食品有限公司；2,2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（diammonium 2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）radicals，ABTS+·）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals，DPPH·）、超氧阴离子自由基（superoxide anion radicals，O2-·）和羟自由基（hydroxyl radicals，·OH）清除能力试剂盒：上海通蔚实业有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
BS210S型电子分析天平：北京赛多利斯天平有限公司；WJE2802D型榨汁机：美的集团股份有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；LXJ-IIB型低速大容量多管离心机：郑州长城工贸有限公司；723型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SPHs-3c型精密pH计：上海理达仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 复合果蔬酒的酿造工艺流程及操作要点
番茄、芒果、南瓜、枇杷→清洗→去皮、去核（若需要）→破碎→酶解→混合→添加白砂糖、偏重亚硫酸钾与维生素C→巴氏灭菌→接种酿酒酵母→发酵→过滤→巴氏灭菌→成品
操作要点：挑选4种新鲜成熟的果蔬（番茄、芒果、南瓜、枇杷），去皮、去核（若需要）后分别加入同等质量的纯净水，破碎，得到果蔬浆汁；分别向4种果蔬浆汁中添加果胶酶（20 U/g）于常温条件下处理3 h；按39.8%番茄浆汁、36.2%芒果浆汁、16.0%南瓜浆汁和8.0%枇杷浆汁的质量比进行混合得到复合果蔬浆汁；按照试验设计加入白砂糖调节初始糖度，加入偏重亚硫酸钾调节总酸含量为0.90%，并添加0.08%维生素C，巴氏灭菌（65 ℃、30 min）；待冷却至常温后接入一定比例的经扩大培养后[21]的酿酒酵母悬液（1.3×107 CFU/mL），在试验设定的条件下静置发酵；待发酵结束经四层纱布过滤与巴氏灭菌（65℃、30min）后得到成品。
1.3.2 复合果蔬酒酿造工艺优化单因素试验
分别考察初始糖度（19.0%、21.5%、24.0%、26.5%、29.0%）、酿酒酵母接种量（1%、3%、5%、7%、9%）、发酵温度（19 ℃、21 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃）及发酵时间（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）对复合果蔬酒感官评分及番茄红素含量的影响，每组试验重复3次进行单因素试验。
1.3.3 复合果蔬酒酿造工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，以复合果蔬酒的番茄红素含量（Y1）和感官评分（Y2）为考察指标，以初始糖度（A）、酿酒酵母接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为考察因素，设计4因素3水平响应面试验优化复合果蔬酒酿造工艺。
1.3.4 测定方法
番茄红素含量：参照本课题组前期建立的方法进行测定[16]；总糖含量与总酸含量：分别采用直接滴定法与电位滴定法[22-23]；酒精度及干浸出物含量：均采用密度瓶法[22，24]。复合果蔬酒的感官评价：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的感官评价方法[22]，邀请11名（6男5女）年龄在28～38岁，具有高级品酒师职业资格证书的专业人士组成评价小组，从外观形态、香气、滋味、典型性4个方面进行打分，满分100分，取11人的平均分。复合果蔬酒感官评分标准见表1。
表1 复合果蔬酒的感官评分标准
Table 1 Sensory score standards of the compound fruit and vegetable wine
指标评定标准优良中差外观形态（20分）香气（25分）滋味（35分）典型性（20分）有光泽，澄清透明，悦目协调（16～20分）果香与酒香浓郁协调，无异味（19～25分）酒体丰满，醇厚，爽口，无异杂味（28～35分）风格优雅独特（16～20分）较为澄清，无悬浮物，光泽度较好（11～15分）果香与酒香浓郁，较为协调，无异味（13～18分）酒质较为柔顺，爽口，无异杂味（19～27分）风格良好（10～15分）较浑浊，光泽度较差（6～10分）果香与酒香不足，稍有异味（7～12分）酒质较为柔顺，欠爽口，有异杂味（10～18分）风格普通（6～10分）浑浊，无光泽，有明显悬浮物（0～5分）果香与酒香不足且香气不协调（0～6分）酒质寡淡，不爽口，异杂味明显（0～9分）风格无典型性（0～5分）
1.3.5 复合果蔬酒抗氧化活性分析
按照ABTS+·、DPPH·、O2-·、·OH试剂盒说明书分别吸取一定量的复合果蔬酒进行操作，测定及分析复合果蔬酒对4种自由基的清除能力，以酿造工艺优化前的复合果蔬酒为对照，考察其抗氧化能力。
1.3.6 数据统计分析
采用SPSS Statistics 20.0进行数据统计分析，使用Origin Pro 12.1和GraphPad Prism 8.3.0分别绘制单因素试验及抗氧化活性试验的结果图，利用Design-Expert 12.0进行响应面试验设计结果分析。
2 结果与分析
2.1 复合果蔬酒酿造工艺优化单因素试验
2.1.1 初始糖度对复合果蔬酒感官评分及番茄红素含量的影响
由图1可知，当初始糖度从19.0%升高至24.0%时，复合果蔬酒的感官评分显著增加（P＜0.05），最高达到（94.6±1.0）分；但当初始糖度为24.0%、26.5%与29.0%时，复合果蔬酒的感官评分之间无显著性差异（P＞0.05）。复合果蔬酒的番茄红素含量随着初始糖度的增加呈现出先升后降的趋势，当初始糖度为21.5%时，复合果蔬酒的番茄红素含量最高为（34.35±0.43）μg/mL。糖分是酿酒酵母发酵复合果蔬酒主要动力来源，糖分不足会影响酿酒酵母的生长代谢；酿酒酵母在糖分充足的情况下，会快速生长繁殖而过快消耗营养物质[25，26]。因而，控制初始糖度能有效保护番茄红素。当初始糖度从21.5%增加到24.0%时，复合果酒的感官评分上升了3.16%，但番茄红素含量减少11.50%。由于风味与健康双导向是食品行业的发展趋势[27]，试验需要兼顾复合果蔬酒的番茄红素含量与感官评分，因此选用初始糖度为19.0%～24.0%用于后续响应面试验。
图1 初始糖度对复合果蔬酒感官评分及番茄红素含量的影响
Fig.1 Effects of initial sugar content on the sensory score and lycopene content of the compound fruit and vegetable wine
不同大写字母表示感官评分之间差异显著（P＜0.05）；不同小写字母表示番茄红素含量之间差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 酿酒酵母接种量对复合果蔬酒感官评分及番茄红素含量的影响
由图2可知，随着酿酒酵母接种量的增加，复合果蔬酒的感官评分和番茄红素含量均呈现先升后降的趋势，当酿酒酵母接种量为5%时，复合果蔬酒的感官评分达到了最高的（91.7±1.6）分，番茄红素含量达到了最高（34.35±0.43）μg/mL。当酿酒酵母接种量从1%增加到5%时，由于微生物及相关酶类的增加，能较快地进行发酵，代谢产生乙醇及其他香味物质[28]。故在相同的发酵时间内，5%的酿酒酵母接种量能使复合果蔬酒获得较高的感官评分及番茄红素含量。当酿酒酵母接种量从5%继续增加时，酿酒酵母在发酵前期大量生长繁殖，快速消耗酒液中的物质，反而使发酵不完全，进而使感官评分呈现出下降的趋势[29]。因此，选择酿酒酵母接种量为3%～7%用于后续响应面试验。
图2 酿酒酵母接种量对复合果蔬酒感官评分及番茄红素含量的影响
Fig.2 Effects of Saccharomyces cerevisiae inoculum on the sensory score and lycopene content of the compound fruit and vegetable wine
2.1.3 发酵温度对复合果蔬酒感官评分及番茄红素含量的影响
由图3可知，当发酵温度在19～27 ℃之间变化时，复合果蔬酒的感官评分随发酵温度的升高呈现出先升后降的趋势，发酵温度为23 ℃时，感官评分达到最高为（91.7±1.6）分。当发酵温度低于23 ℃时，复合果蔬酒酒体不够丰满，特别地，当发酵温度为19 ℃时酒质及香气变得寡淡；当发酵温度高于23 ℃时，复合果蔬酒开始出现苦涩味，进而使其感官评分均显著低于91.7分（P＜0.05）。复合果蔬酒的番茄红素含量也随发酵温度的升高呈现出先升后降的趋势，当发酵温度为21 ℃时，其番茄红素含量最高，为（38.42±0.43）μg/mL。发酵温度从21 ℃变化到23 ℃，感官评分增加了4.09%，而番茄红素降低了10.59%。基于风味与健康双导向研发食品的原则[30]，因此选择发酵温度为19～23 ℃进行后续响应面试验。
图3 发酵温度对复合果蔬酒感官评分及番茄红素含量的影响
Fig.3 Effects of fermentation temperature on the sensory score and lycopene content of the compound fruit and vegetable wine
2.1.4 发酵时间对复合果蔬酒感官评分及番茄红素含量的影响
由图4可知，发酵时间从5 d增加到9 d，复合果蔬酒的感官评分从（81.3±1.4）分上升至（88.1±0.9）分后再降至（77.9±1.5）分。随着发酵时间从5 d增加到7 d时，复合果蔬酒在酿酒酵母的作用下，产生和溶解出较为丰富的香气物质使酒体更加丰满[31]，故其感官评分也随之升高，最高达到了（88.1±0.9）分。然而，随着发酵时间的持续增加，酒体逐渐呈现出酸味，影响口感，故感官评分显著下降（P＜0.05）。
图4 发酵时间对复合果蔬酒感官评分及番茄红素含量的影响
Fig.4 Effects of fermentation time on the sensory score and lycopene content of the compound fruit and vegetable wine
由图4可知，当发酵时间从5 d增加到9 d时，复合果蔬酒的番茄红素含量持续下降，由（43.86±0.32）μg/mL下降至（25.84±0.53）μg/mL。因此，选择发酵时间为5～7 d用于后续试验。
2.2 复合果蔬酒酿造工艺优化响应面法试验
根据单因素试验结果和产品特性，采用Box-Behnken中心组合设计[32]进行响应面优化试验，结果见表2。
表2 复合果蔬酒酿造工艺优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of the compound fruit and vegetable wine
试验号A 初始糖度/%B 酿酒酵母接种量/%C 发酵温度/℃D 发酵时间/d Y1番茄红素含量/（μg·mL-1）Y2感官评分/分1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 24.0 19.0 24.0 21.5 21.5 21.5 19.0 19.0 24.0 21.5 24.0 21.5 21.5 24.0 21.5 19.0 21.5 21.5 24.0 21.5 21.5 19.0 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 19.0 77555755533555755355537375535 21 21 19 21 21 19 23 21 21 19 21 19 21 21 21 21 23 21 23 21 19 21 21 21 23 21 23 23 19 66666667766765757566565766566 36.69 36.41 38.36 40.21 40.45 36.78 37.06 37.71 37.85 37.15 40.12 36.78 39.82 39.61 37.76 37.89 38.27 39.10 37.57 40.91 39.84 36.55 39.80 36.18 36.64 41.19 36.92 36.46 36.64 73.8 73.2 80.1 88.2 81.4 76.8 74.5 75.8 87.8 77.6 83.8 82.5 86.3 82.7 78.9 76.2 77.0 88.7 78.5 89.2 80.1 84.8 83.1 81.2 76.5 86.0 85.7 73.3 73.7
分别以番茄红素含量（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，经回归拟合后，得到相应的回归方程如下。
对试验数据进行方差分析，结果如表3所示。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
方差来源模型平方和Y1自由度Y1均方Y1 F 值Y1 P 值Y1显著性Y1Y2 14 Y2Y2Y2Y2Y2 516.33 67.71 61.20 2.34 60.83 5.25 0.18 0.58 14 ABC 111 111 4.34 5.25 0.18 0.58 36.88 67.71 61.20 2.34 7.41 8.96 0.31 0.98 2.50 4.61 4.16 0.16 0.000 3 0.009 7 0.585 8 0.338 4 0.048 5 0.049 9 0.060 8 0.696 1******
续表
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源D AB AC AD BC BD CD平方和Y1 Y2Y2Y2Y2Y2自由度Y1均方Y1 F 值Y1 P 值Y1显著性Y1Y2***6.18 2.71 0.37 0.62 0.08 0.19 4.86 12.23 19.31 22.73 3.33 8.21 7.02 1.19 69.04 14.74 0.64 71.44 7.56 4.00 2.72 30.80 127.11 82.98 196.34 0.04 206.17 170.08 36.09 722.50 111111111111 4 111111111111 4 6.18 2.71 0.37 0.62 0.08 0.19 4.86 12.23 19.31 22.73 3.33 0.59 0.70 0.30 14.74 0.64 71.44 7.56 4.00 2.72 30.80 127.11 82.98 196.34 0.04 14.73 17.01 9.02 10.53 4.61 0.62 1.06 0.13 0.33 8.29 20.85 32.93 38.74 5.68 1.00 0.04 4.89 0.51 0.27 0.18 2.09 8.63 5.63 13.33 0.00 0.005 9 0.049 7 0.442 7 0.319 8 0.724 9 0.574 7 0.012 1 0.000 4 0.000 1 0.000 1 0.031 9 0.334 0 0.837 9 0.047 1 0.485 4 0.610 4 0.673 8 0.170 1 0.010 8 0.032 5 0.002 6 0.960 1*A2 B2 C2*****D2*******残差失拟项纯误差总离差10 4 28 10 4 28 2.36 1.89 0.212 2 0.283 5
根据方差分析，四个因素对复合果蔬酒番茄红素含量的影响次序为D＞A＞C＞B，即发酵时间对复合果蔬酒番茄红素含量的影响最为显著，其次是初始糖度，再次是发酵温度。由P值可知，一次项A、D，二次项A2、B2、C2对复合果蔬酒番茄红素含量的影响极为显著（P＜0.01）；交互项AB、CD，二次项D2对复合果蔬酒番茄红素含量的影响达到了显著水平（P＜0.05）。四个因素的两两相互作用的响应面图如图5所示。
图5 各因素间交互作用对复合果蔬酒番茄红素含量影响的响应曲面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on lycopene content of the compound fruit and vegetable wine
由图5可知，因素A与因素B，因素C与因素D所形成的响应面曲面坡度最为陡峭（颜色变化最快），验证了交互项AB、CD对复合果蔬酒番茄红素含量的影响达到了显著水平（P＜0.05）。
四个因素对复合果蔬酒感官评分的影响次序为A＞B＞D＞C，即初始糖度对复合果蔬酒感官评分的影响最为显著，其次是酿酒酵母接种量，再次是发酵时间。二次项C2对复合果蔬酒感官评分的影响极为显著（P＜0.01）；一次项A，交互项AC，二次项A2和B2对复合果蔬酒感官评分的影响达到了显著水平（P＜0.05）。由图6可知，因素A与因素C所形成的响应面曲面坡度最为陡峭，验证了交互项AC对复合果蔬酒感官评分的影响达到了显著水平（P＜0.05）。
图6 各因素间交互作用对复合果蔬酒感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory score of the compound fruit and vegetable wine
2.3 复合果蔬酒酿造工艺优化验证试验
以感官评分为主要评价指标，通过回归模型获得最佳酿造条件为：初始糖度21.71%、酿酒酵母接种量5.53%、发酵温度19.62 ℃和发酵时间5.00 d。在此优化条件下，感官评分理论值为（90.1±0.0）分。为了便于实际操作，将发酵条件修正为：初始糖度21.7%、酿酒酵母接种量5.5%、发酵温度20 ℃和发酵时间5.0 d。进行三组验证试验，感官评分实际值为（89.6±1.2）分，与理论值相差不大。番茄红素含量为（40.63±0.49）μg/mL。
2.4 复合果蔬酒的理化指标
在最优条件下得到的复合果蔬酒的总糖为（7.65±0.25）g/L，总酸为（0.46±0.06）g/L，酒精度为（6.43±0.18）%vol，干浸出物为（34.57±1.23）g/L。上述四项指标均符合QB/T 5476—2020《果酒通用技术》要求[33]。
2.5 复合果蔬酒抗氧化活性
酿造工艺优化前后的复合果蔬酒对ABTS+·、DPPH·、O2-·、·OH的清除率如图7所示。
图7 复合果蔬酒的抗氧化性
Fig.7 Antioxidant activity of compound fruit and vegetable wine
由图7可知，工艺优化前后的复合果蔬酒对ABTS+·、DPPH·、O2-·、·OH的清除能力均随着酒液体积分数增加而逐渐增强，经过拟合计算得到优化后的复合果蔬酒对上述4种自由基清除率的半最大效应浓度（median effect concentration，EC50）值分别从优化前的73.17 mg/100 mL、59.15 mg/100 mL、39.94 mg/100 mL、56.47 mg/100 mL降低到了54.76 mg/100 mL、39.71 mg/100 mL、20.08 mg/100 mL、30.18 mg/100 mL。综上，通过酿造工艺优化后的复合果蔬酒因番茄红素含量从（19.57±0.52）μg/mL显著升高（P＜0.05）到了（40.63±0.49）μg/mL，进而增强了复合果蔬酒的抗氧化活性。
3 结论
以番茄、芒果、南瓜和枇杷的果蔬浆汁为原料，添加白砂糖调整果蔬浆汁初始糖度为21.7%，巴氏灭菌冷却后接入5.5%酿酒酵母菌悬液，20 ℃静置发酵5.0 d后可以获得感官品质优良（感官评分为89.6分）的复合果蔬酒，且理化指标均符合QB/T 5476—2020《果酒通用技术》要求。其番茄红素含量从优化前的（19.57±0.52）μg/mL显著升高（P＜0.05）到了（40.63±0.49）μg/mL，对ABTS+·、DPPH·、O2-·、·OH清除率的EC50值分别优化前的73.17 mg/100 mL、59.15 mg/100 mL、39.94 mg/100 mL、56.47mg/100 mL降低到了54.76 mg/100 mL、39.71 mg/100 mL、20.08 mg/100 mL、30.18 mg/100 mL。因此，采用果肉与果汁共同酿造技术，可显著提高复合果蔬酒的番茄红素含量，增强了抗氧化活性，进而提升其保健价值。
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