柠檬（Citrus lemon（L.）Burm.F.）是芸香科柑橘属植物，约占世界柑橘产业的9%[1]，我国是柠檬生产和消费大国。当前柠檬加工的产品主要集中在柠檬干片、柠檬果汁、果茶等饮品以及柠檬果酱和果糖、柠檬酸、柠檬精油和柠檬果胶等方面[1-3]。
柠檬酒因其酒精度低，清爽健康，被越来越多消费者喜爱。市售柠檬酒多见于配制型（以柠檬汁/皮、基酒、糖为主要原料，经适当调配而制得），由于柠檬汁酸度高（pH 2.5左右）糖度低，富含柠檬苦素导致苦味等，使得直接以柠檬汁为进行发酵产酒具有较高的技术门槛。目前国内关于柠檬酒的报道主要集中在工艺和风味的研究中，其中工艺研究主要是在发酵工艺优化[4-5]、酿酒菌株的筛选[6]、脱苦工艺[7]、降酸工艺以及澄清工艺等[5，8-9]，而风味研究主要是利用气相-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪、高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）仪等设备研究柠檬酒香气成分的丰富度和酒体的品质等[10-11]。国外关于柠檬酒的研究主要集中在对酒液中某些化学成分的分析以及相关检测方法的探索[12-13]。
以柠檬汁为主料，辅以其他含糖量高的果汁共同发酵，开发风味各异的复合果酒，是弥补柠檬汁低糖高酸的策略之一，也是丰富柠檬深加工产品，提升附加值的有效手段。如张彦聪等[14]研制出了具有独特风味的柠檬椰汁复合果酒，尹爱国等[15]确定了白桑椹柠檬复合果酒的最佳工艺。蜂蜜中含有大量的果糖和葡萄糖，且富含氨基酸、蛋白质等多种对人体有益的营养成分。本研究以柠檬、槐花蜜为原料制备柠檬蜂蜜酒，通过单因素试验及正交试验优化柠檬蜂蜜酒的发酵工艺，并采用常规检测方法、高效液相色谱（HPLC）法分析成品的理化指标、有机酸、氨基酸含量，以期为柠檬蜂蜜酒的产业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
尤力克柠檬：广东中兴绿丰发展有限公司；冠生园洋槐蜂蜜：市售；白砂糖（食品级）：市售；葡萄酒果酒酵母SY：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（10 000 U/mL）：上海万康生物科技有限公司；壳聚糖：索莱宝生物科技有限公司；柚苷酶（酶活≥10 U/mg）：上海兴隆生物科技有限公司；碳酸氢钠、偏重亚硫酸钾、柠檬酸、氢氧化钠（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FA2004型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；THZ-103B型恒温培养摇床、HWS12恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；ST2200ZH-B型pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；TU-1901紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；Agilent1260高效液相色谱仪：美国安捷伦科技（中国）有限公司；LA8080日立氨基酸分析仪：日立分析仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 柠檬蜂蜜酒加工工艺流程及操作要点
柠檬→清洗→制汁→皮、汁混合→酶解→成分调整→接种、发酵→澄清→脱苦→灭菌、灌装→柠檬蜂蜜酒成品
操作要点：
柠檬汁的制备：将新鲜柠檬用盐水浸洗，取果肉榨汁，将果汁与果皮（0.5 cm见方小块）以9∶1的比例混合。
酶解：在上述柠檬汁与果皮混合物加入50 mg/L果胶酶，50 ℃酶解2 h，90 ℃水浴3 min灭酶，冷却，过滤取柠檬汁。
成分调整：添加槐花蜜调整柠檬汁初始糖度至23°Bx，用碳酸氢钠调整柠檬果汁pH值至3.8，添加偏重亚硫酸钾80 mg/L。
接种、发酵：取200 mL柠檬果汁，加入10 g葡萄酒果酒酵母SY，搅拌溶解，于28～30 ℃条件下活化15 min，即得活性酵母菌种液（酵母菌浓度为109 CFU/mL）。活性酵母菌种液按6%的接种量接种至柠檬汁，22 ℃恒温发酵7 d。酒精度、残糖二者不再变化，即终止发酵。
澄清[16]：添加1%壳聚糖室温下静置24 h，虹吸取澄清酒液。
脱苦：按2.0 g/L添加柚苷酶，50 ℃水浴90 min。
灭菌、灌装：酒液于80 ℃水浴25 min灭菌[17]后灌装，即得柠檬蜂蜜酒成品。
1.3.3 糖源选择柠檬汁与果皮混合物经果胶酶酶解、过滤后，添加槐花蜜或白砂糖调整发酵液初始糖度至23°Bx，考察不同糖源对柠檬蜂蜜酒品质的影响。
1.3.4 柠檬蜂蜜酒发酵工艺优化
单因素试验：分别考察初始糖度（19°Bx、21°Bx、23°Bx、25°Bx、27°Bx）、初始pH值（3.2、3.4、3.6、3.8、4.0）、酵母菌接种量（4%、5%、6%、7%、8%）对柠檬蜂蜜酒感官评分及理化指标的影响。
正交优化试验：根据单因素试验结果，以酒精度和感官评分为考察指标，以初始糖度（A）、初始pH（B）和酵母菌接种量（C）为影响因素，设计3因素3水平L9（33）正交试验，优化柠檬蜂蜜酒发酵工艺。
1.3.5 分析检测
（1）理化指标测定
酒精度测定：采用酒精计法；挥发性酸、总酸、总糖、总SO2、维生素C含量测定：分别参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]中的酸碱中和法、指示剂法、直接滴定法、直接碘量法、2,6-二氯靛酚滴定法；透光率测定：紫外分光光度法[19]；pH值测定：pH计法。
氨基酸含量采用GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》[20]；有机酸的测定：采用高效液相色谱法[21]。
有机酸风味强度（Fu）=风味物质浓度/风味阈值。Fu值＞2.0表示缺乏该有机酸，将发生明显的风味改变；Fu值为1.0～2.0之间，表示该有机酸的风味明显；Fu值为0.5～1.0，表示具有该有机酸的风味；Fu值＜0.5，表示该有机酸的风味不明显[22]。
1.3.6 感官评价
选取经过训练的10名感官评定员，参考葡萄酒干酒的感官要求和评价标准[23]，制定柠檬蜂蜜酒的感官评价标准见表1。
表1 柠檬蜂蜜酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of lemon mead
项目评分标准分数/分外观（20分）香气（30分）澄清透明、具有本品应有的光泽、悦目协调澄清、透明、无夹杂物微浑、失光或氧化变色果香、酒香浓厚幽郁、协调悦人果香、酒香良好、尚悦人香气和酒香较好，但无异香香气不足、或不悦人、或有异香香气不良，有异味，使人厌恶18～20 12～17＜12 28～30 25～27 20～24 18～19＜18口感（40分）酒体丰满、醇厚、协调、爽口、酸甜适口、柔细轻快，回味绵延酒质柔顺，柔和爽口，甜酸适当酒体协调，纯正无杂略酸，较甜腻，绝干带甜，欠浓郁酸，涩，苦，平淡，有异味38～40 34～37 30～33 24～29＜24
续表
项目评分标准分数/分风格（10分）典型完美，风格独特，优雅无缺典型明确，风格良好有典型性，不够怡雅失去本品典型性10 9 6～8 0～5
1.3.7 数据处理
所有数据平行测定3次，结果均以“平均值±标准差”表示，使用Excel2010进行数据分析，采用Origin2022进行绘图。
2 结果与分析
2.1 白砂糖和槐花蜜对柠檬蜂蜜酒品质的影响
由表2可知，采用槐花蜜作为糖源所制得的柠檬蜂蜜酒中感官评分高于以白砂糖作为糖源所得的柠檬蜂蜜酒，且总糖、总酸含量更低。可能是因为槐花蜜中所含葡萄糖、果糖比例与白砂糖不同，或者其他碳类物质含量不同，导致总酸的差异。槐花蜜糖源柠檬蜂蜜酒的总SO2含量更低，可能是槐花蜜中含有醛类，造成原酒中醛类含量较高，在原酒中，SO2与乙醛的结合力可达81%～89%，致使添加槐花蜜糖源柠檬蜂蜜酒中总SO2的含量较少[24]。因此，槐花蜜作为糖源较蔗糖更优。
表2 白砂糖和槐花蜜添加对柠檬蜂蜜酒理化指标及感官评分的影响
Table 2 Effect of sugar and locust honey addition on physicochemical indexes and sensory scores of lemon mead
感官评分/分白砂糖槐花蜜糖源总糖/（g·L-1）总酸/（g·L-1）酒精度/%vol总SO2/（mg·L-1）2.10±0.07 1.10±0.11 18.40±0.12 15.20±0.09 12.00±0.02 12.20±0.06 14.00±0.19 12.00±0.11 82.30±1.33 88.50±0.98
2.2 柠檬蜂蜜酒发酵工艺优化单因素试验
2.2.1 初始糖度对柠檬蜂蜜酒品质的影响
由图1可知，初始糖度在19～27°Bx范围内升高，酒精度逐渐增加，感官评分呈先上升后下降的趋势。当初始糖度为19～23°Bx，感官评分随之增高；当初始糖度为23°Bx时，感官评分最高，为88.5分，酒精度较高，为12.2%vol；当初始糖度＞23°Bx之后，感官评分有所下降。这可能随着初始糖度增加，发酵后的酒液中残余糖分过高，复合果酒的口感偏甜，导致感官风味下降。因此，选择最适初始糖度为23°Bx。
图1 初始糖度对柠檬蜂蜜酒酒精度及感官评分的影响
Fig.1 Effect of initial sugar content on alcohol content and sensory scores of lemon mead
2.2.2 初始pH值对柠檬蜂蜜酒品质的影响
由图2可知，初始pH 值在3.2～4.0范围内增高，酒精度和感官评分均呈先上升后下降的趋势。当初始pH值为3.2～3.8时，酒精度和感官评分随之升高，当初始pH值为3.8时，酒精度和感官评分达到最高，分别为12.0%vol、87.8分，原酒酸甜适度、协调爽口，当初始pH值＞3.8之后，酒精度和感官评分有所下降。则初始pH值太低，原酒酸味突出，口感不和谐，且初始pH值过低可能会导致发酵不彻底[25]；初始pH值太高，酒会失去其风味的典型性。因此，选择最佳初始pH值为3.8。
图2 初始pH值对柠檬蜂蜜酒酒精度及感官评分的影响
Fig.2 Effect of initial pH on alcohol content and sensory scores of lemon mead
2.2.3 酵母菌接种量对柠檬蜂蜜酒品质的影响
由图3可知，酵母接种量在4%～7%范围内增高，酒精度和感官评分均随之增加；当酵母接种量为7%时，酒精度、感官评分最高，分别为12.0%vol、85.4分；当接种量＞7%之后，酒精度和感官评分均下降。原因可能是酵母迅速繁殖，产生过多的代谢副产物。适宜的酵母菌接种量能促进酒精发酵的启动和代谢产物的生成[26]。因此，选择最适酵母菌接种量为7%。
图3 酵母菌接种量对柠檬蜂蜜酒酒精度及感官评分的影响
Fig.3 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory scores of lemon mead
2.2.4 柠檬蜂蜜酒酿造工艺的正交试验结果与分析
由表3可知，根据R值，影响柠檬蜂蜜酒感官评分的3因素的主次关系为B＞A＞C，即初始pH＞初始糖度＞酵母菌接种量。通过对k值，得到柠檬蜂蜜酒最佳发酵工艺组合为A3B3C2，即初始糖度为23°Bx，初始pH值为4.0和酵母菌接种量为7%。在此优化工艺条件下，柠檬蜂蜜酒感官评分为87.3分。
表3 柠檬蜂蜜酒发酵工艺正交优化试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation process optimization of lemon mead
试验号 A 初始糖度/°BxB 初始pH C 酵母菌接种量/%感官评分/分123456789k1 678786867 82.1±0.17 82.5±0.26 84.2±0.35 84.6±0.46 83.2±0.26 86.3±0.26 83.5±0.30 85.3±0.44 87.3±0.10 k2 k3R 19 19 19 21 21 21 23 23 23 82.93 84.70 85.37 2.43 3.6 3.8 4.0 3.6 3.8 4.0 3.6 3.8 4.0 83.40 83.67 85.93 2.53 84.57 84.80 83.63 1.17
2.2.5 理化指标检测结果
由表4可知，柠檬蜂蜜酒理化指标均符合农业行业标准NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》的要求[27]。其透光率为88.5%，酒体呈浅柠檬黄，鲜亮澄清；维生素C含量326.0 mg/L，高于苹果酒、荔枝酒中的维生素C含量[28-29]。据报道，柠檬中维生素C含量约50～65 mg/100 g[30]。较好保留了原料中维生素C。
表4 柠檬蜂蜜酒理化指标检测结果
Table 4 Physicochemical indexes determination results of lemon mead
项目检测结果标准要求酒精度/%vol总糖（以葡萄糖计）/（g·L-1）总酸（以酒石酸计）/（g·L-1）挥发酸（以乙酸计）/（g·L-1）总SO2/（mg·L-1）透光率/%维生素C/（mg·L-1）13.60±0.12 2.80±0.10 7.90±0.10 0.20±0.00 12.00±1.03 88.50±0.20 326.00±9.17 7～18≤4.0 4.0～9.0≤1.0≤250
2.3 柠檬蜂蜜酒中风味物质分析
2.3.1 有机酸
由表5可知，在柠檬蜂蜜酒中共检出柠檬酸、琥珀酸、草酸、乙酸、丙酮酸、乳酸、莽草酸等8种有机酸，总含量为34.98 g/L。其中，柠檬酸含量最高，达22.06 g/L，琥珀酸、乙酸、草酸的含量较高，这与原料柠檬中的有机酸含量有较大联系，而且发酵原料中加入了一定量的柠檬皮，可能会增加酒中的琥珀酸、草酸等物质[32-33]。柠檬蜂蜜酒中的柠檬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸的风味强度Fu值均＞2，这些有机酸对柠檬蜂蜜酒的风味呈现起到了重要作用，其中柠檬酸和琥珀酸的Fu值远大于其他种类有机酸，说明这两种有机酸对柠檬蜂蜜酒的风味口感起到了主导作用。
表5 柠檬蜂蜜酒中有机酸含量、风味阈值及其风味特征描述
Table 5 Organic acids contents, flavor threshold and flavor characteristics description of lemon mead
注：“-”表示草酸和莽草酸未查到相关数据。
有机酸含量/（mg·L-1）风味阈值[31]/（mg·L-1）风味强度（Fu值）风味特征描述柠檬酸酒石酸琥珀酸草酸乙酸丙酮酸乳酸莽草酸22 063.09±101.56 278.21±13.91 8 559.94±97.05 1 680.19±72.87 1 811.51±53.67 423.44±17.54 145.28±6.34 20.00±1.45 350 300 200-200 250 47-63.037 0.927 42.800-9.058 1.694 3.091-温和爽快，有新鲜感，后苦时间短稍有涩感、酸味强烈酸、咸、苦复合味-激性酸味、醋味酸、咸、饲料味酸味较弱，稍有湿味、尖利辛辣
2.3.2 氨基酸
柠檬蜂蜜酒中氨基酸的组成和含量测定结果见表6。由表6可知，柠檬蜂蜜酒中共检出16种氨基酸，总含量（816.02±0.44）mg/L，其中赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸七种人体必需氨基酸，含量为（290.57±1.43）mg/L，必需氨基酸占比为35.61%。何莎莎等[34]测得尤力克柠檬中氨基酸总量为（333.11±17.69）mg/100 g，必需氨基酸占比为28%。柠檬蜂蜜酒中脯氨酸，天冬氨酸和谷氨酸含量较高，组氨酸、异亮氨酸含量较低，李文云等[32]测得尤力克柠檬果肉中脯氨酸含量最高，为氨基酸总量的32%，而缬氨酸含量较低，占氨基酸总量1%，可见柠檬蜂蜜酒中氨基酸种类及含量与原料带入有很大关系，而谷氨酸的含量较高可能与微生物的代谢产生有关。何瑞[31]研制洋槐蜜蜂蜜酒中脯氨酸含量也比较高，氨基酸总量为71.64 mg/L，这说明柠檬蜂蜜酒和蜂蜜酒的氨基酸种类含量差异较显著。
表6 柠檬蜂蜜酒中氨基酸种类及其含量测定结果
Table 6 Determination results of types and contents of amino acids in lemon mead
注：“*”表示必需氨基酸。
氨基酸种类含量/（mg·L-1）苯丙氨酸*赖氨酸*蛋氨酸*苏氨酸*异亮氨酸*亮氨酸*缬氨酸*丙氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酸精氨酸酪氨酸丝氨酸天冬氨酸组氨酸66.10±0.99 59.04±0.32 30.26±0.18 37.04±0.13 18.98±0.16 48.05±0.43 32.74±0.45 44.17±0.23 100.12±1.19 35.01±0.21 119.85±0.95 25.78±0.61 38.17±0.14 50.70±1.01 94.01±0.46 16.00±0.12
3 结论
本研究以柠檬、槐花蜜为原料制备柠檬蜂蜜酒，通过单因素及正交试验确定了柠檬蜂蜜酒的最佳发酵工艺条件：初始pH4.0，初始糖度23°Bx和酵母菌接种量7%，发酵温度22 ℃，发酵时间7 d。在此优化条件下，柠檬蜂蜜酒的感官评分为87.3分，酒精度13.6%vol、总酸7.9 g/L、挥发酸0.2 g/L、总SO212 mg/L，透光率为88.5%、维生素C 326.0 mg/L，均符合NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》要求。柠檬蜂蜜酒中共检出8种有机酸和16种游离氨基酸，总量分别34.98 g/L和（816.02±0.44）mg/L，包含7种人体必需氨基酸，总含量为（290.57±1.43）mg/L。本研究拓宽了柠檬深加工领域，为柠檬蜂蜜酒及其相关产品产业化开发提供依据。
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