桑树（Morus alba L.）是桑科（Moraceae）桑属（Morus.）落叶乔木或灌木，2023年我国桑园种植面积约113.6公顷，广泛分布于我国28个省（区、市）的1 000多个县[1]。桑葚富含花青素、类黄酮、多糖、多酚等，在抗炎、抗癌、抗糖尿病、保肝、心脏保护、改善肥胖等方面具有广泛的药理活性[2-4]。因其味道独特、颜色诱人、热量低、营养价值高等特点，常用于鲜食、晒干或加工成果汁和果酱，倍受消费群体喜爱。然而桑葚果实皮很薄，极易腐烂，且成熟期极短，在储存、运输和销售方面存在巨大困难。此外，被微生物感染的桑葚果实可能会引起食源性疾病，出现恶心呕吐、腹痛腹泻等症状[5-6]，造成了资源浪费。
桑葚的开发利用主要集中在桑葚天然色素提取和桑葚产品加工两个方面[7]。桑葚中酚酸类物质丰富，经发酵制成桑葚果酒后可最大程度保留原料营养价值，提升酒的品质[8]。黄迎迎等[9]以玫瑰与桑葚为主要原料制备低醇玫瑰-桑葚果酒，采用响应面试验优化其发酵工艺条件，获得的桑葚果酒口感醇香怡人，具有桑葚及玫瑰清香的独特风味。刘宜睿等[10]采用库德毕赤酵母K1酿酒酵母混合（体积比2∶1）发酵桑葚果酒，采用响应面试验优化其发酵条件制备的桑葚果酒酒精度为8.53%vol。相较于传统桑葚酿造的低度果酒，蒸馏后可有效降低甲醇、高级醇等物质的占比，提升桑葚酒的品质[11]。但目前鲜见桑葚蒸馏酒酿造工艺的研究报道。
为充分利用桑葚资源，本研究以桑葚为原料制备桑葚果酒，进而蒸馏获得桑葚蒸馏酒。采用单因素试验及响应面试验对桑葚蒸馏酒原酒发酵工艺进行优化，并采用气相色谱（gas chromatography，GC）测定桑葚蒸馏酒挥发性风味成分，以期为桑葚蒸馏酒的品质评价和香气提升提供理论基础，促进桑葚产品的综合开发利用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜桑葚（品种“之葚1号”）：采摘自浙江省农业科学研究院；红曲霉（Monacus anka）：购自梁山长久生物制曲有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY：湖北安琪酵母股份有限公司；叔戊醇标准品（色谱纯）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；甲醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯（均为色谱纯）：德国Merck公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
7890A-5975C型气相色谱质谱联用仪：美国安捷伦公司；ACS电子秤：东莞市龙脉衡器制造有限公司；PSBXGGSZZJ-0650231螺旋榨汁机：山东利沁机械制造有限公司；恒诚304蒸馏设备：曲阜市恒诚酿酒设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 桑葚蒸馏酒液态发酵工艺流程
操作要点：
挑选无虫害、新鲜成熟的桑葚为原料，清洗打浆后用小苏打调节桑葚果汁pH值为3.5左右。桑葚汁起始糖度为12%，添加白砂糖调整糖度至24%。将酿酒酵母于37 ℃无菌水中活化0.5 h，待发酵醪液降温至30 ℃后，接种于发酵醪液中。使用纱布封口发酵罐，然后放置恒温32 ℃，发酵50 d，酒精度恒定时作为发酵终点，获得桑葚发酵酒。将其加入蒸馏设备进行蒸馏并收集馏出液，每200 mL收集一次测定酒精度，直至馏出液酒精度降到10%vol左右停止蒸馏。将第一次收集的馏出液混匀测定其酒精度，用蒸馏水调节酒精度至25%vol左右进行二次蒸馏，每100 mL收集一次测定酒精度，直至桑葚蒸馏酒混合后最终酒精度为53%vol时，过0.22 μm滤膜精滤去除杂质，得桑葚蒸馏酒。
1.3.2 桑葚蒸馏酒原酒发酵工艺优化
单因素试验：根据上述发酵工艺流程，以桑葚蒸馏酒原酒中乙酸乙酯含量、乳酸乙酯、酒精度为指标，分别考察发酵温度（24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃）、初始糖度（16%、20%、24%、28%、30%）、酿酒酵母添加量（0.5‰、1‰、2‰、3‰、4‰）、发酵时间（10 d、30 d、50 d、70 d、90 d）对桑葚发酵液酒精度和桑葚蒸馏酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯的影响。
响应面试验：在单因素试验的基础上以乳酸乙酯含量（Y）为响应值，以发酵温度（A）、酿酒酵母添加量（B）和初始糖度（C）为考察指标，采用Design Expert 8.0.6软件设计响应面试验，试验因素与水平见表1。
表1 桑葚蒸馏酒原酒发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of original wine of mulberry spirit
因素A 发酵温度/℃B 酿酒酵母添加量/‰C 初始糖度/%-1水平0 1 28 1 20 32 2 24 36 3 28
1.3.3 分析检测
酒精度：采用酒度计[12]；甲醇含量测定：参照GB/T 5009.266—2016《食品中甲醇的测定》中气相色谱法[13]。
乙酸乙酯和乳酸乙酯：采用气相色谱（GC）法进行检测。
GC条件：J&WDM-WAX色谱柱（30m×250μm×0.25μm）；载气为N2（0.6 MPa），进样量1.0 μL；进样口温度260 ℃；色谱柱流量1 mL/min；分流比30∶1；压力14.564 psi；总流速49.5 mL/min；隔热吹扫流量3 mL/min；氢火焰离子化检测器（hydrogen flame ionization detector，FID）260 ℃；尾吹气流速30 mL/min；氢气流速40 mL/min；空气流速400 mL/min；柱箱梯度升温程序：初始温度为37 ℃，以1 ℃/min升至70 ℃，以6 ℃/min升至130 ℃，以10 ℃/min升至220 ℃保持10 min。
桑葚蒸馏酒中挥发性风味成分采用GC-MS测定。
预处理：取20 mL桑葚蒸馏酒，添加20 μL 2,4,6-三甲基吡啶（内标质量浓度10 mg/mL）混匀，使用0.22 μm滤膜进行过滤，将预处理后的桑葚蒸馏酒样品注入GC-MS进样口。
GC条件：初始温度为60 ℃，以5 ℃/min升至110 ℃，以3 ℃/min升至215 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。进样口温度230 ℃，载气为氦气（He），检测器温度240 ℃，流量1.2 mL/min。
MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，灯丝流量是0.20 mA。检测器电压是350 V。扫描范围在50～550 amu之间，传输线温度270 ℃，离子源温度230 ℃。
定性定量分析：参考郭小雨等[14]方法。采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）Library和Wiley Library对鉴定出的挥发性化合物进行定性分析，并使用内标法进行相对定量。计算公式如下：
式中：Ci为待测物的质量浓度，μg/L；Cs为内标物（2,4,6-三甲基吡啶）质量浓度，μg/L；Ai为待测物的峰面积；As表示内标物的峰面积。
气味活性值（odor activity value，OAV）的计算：气味活性值（OAV）是化合物含量与其阈值之比，OAV与风味成分贡献成正相关[15]。当OAV＞1时，表明挥发性化合物对样品挥发性风味特征的形成起主要作用，而OAV＜1化合物的贡献较小。
1.3.4 数据处理
采用Design Expert 8.0.6软件设计响应面试验，采用SPSS20.0软件进行方差分析（analysis of variance，ANOVA），P＜0.05表示具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 桑葚蒸馏酒原酒发酵工艺优化单因素试验结果与分析
2.1.1 发酵温度的确定
传统大曲清香型白酒发酵过程中，发酵酒醅受微生物代谢及外界保温散热条件的影响，乙酸乙酯会随着温度改变而发生动态变化[16]。由图1可知，随着发酵温度在24～32 ℃的升高，桑葚发酵液中酒精度、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量均升高；当发酵温度为32 ℃时，桑葚发酵液中酒精度、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量最高，分别为8.02%vol、11.70mg/L、0.11 mg/L；继续升高发酵温度，酒精度、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量下降。研究表明，当温度过低时，酵母活性低，发酵效率低；当温度过高时又会抑制微生物代谢能力，导致酒精度降低，破坏风味物质[17]。因此，确定最佳发酵温度为32 ℃。
图1 发酵温度对桑葚蒸馏酒原酒酒精度、乙酸乙酯及乳酸乙酯的影响
Fig.1 Effect of fermentation temperature on the alcohol content,ethyl acetate and ethyl lactate contents in original wine of mulberry spirit
2.1.2 初始糖度的确定
由图2可知，随着初始糖度的增加，酒精度呈增加趋势，当初试糖度到达28%时，酒精度最高，为13.97%vol。当初始糖度在20%～24%范围内增加，乙酸乙酯和乳酸乙酯均呈上升趋势；当初始糖度为24%时，乙酸乙酯和乳酸乙酯达到最高值，分别为13.33 mg/L、0.14 mg/L，此时，酒精度为11.70%vol；继续增加初始糖度，乙酸乙酯和乳酸乙酯含量均下降。这主要是由于当初始糖度过低时，会减弱酵母代谢能力；当初始糖度过高时，会导致高渗透压，抑制酯类物质的生成[18-19]。因此，确定最佳初始糖度为24%。
图2 初始糖度对桑葚蒸馏酒原酒酒精度、乙酸乙酯及乳酸乙酯的影响
Fig.2 Effect of initial sugar content on the alcohol content, ethyl acetate and ethyl lactate contents in original wine of mulberry spirit
2.1.3 酿酒酵母添加量的确定
酿酒酵母作为白酒发酵过程中主要的微生物来源，是浓香型白酒发酵的关键发酵剂[21]。由图3可知，随着酿酒酵母添加量在0.5‰～2.0‰范围内的增加，桑葚发酵液中酒精度、乙酸乙酯和乳酸乙酯均增加；当酵母添加量为2.0‰时，酒精度、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量最高，分别为12.5%vol、14.94 mg/L、0.17 mg/L；继续增加酿酒酵母添加量，酒精度、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量有所下降。这可能是由于酿酒酵母增加提高了桑葚原料的利用率，促使桑葚中的糖类物质转化为乙醇、乙酸，进而合成乙酸乙酯和乳酸乙酯。但随着酿酒酵母的增加，营养物质消耗，微生物代谢逐渐缓慢，合成乙酸乙酯和乳酸乙酯减少。因此，确定最佳酿酒酵母添加量为2.0‰。
图3 酿酒酵母接种量对桑葚蒸馏酒原酒酒精度、乙酸乙酯及乳酸乙酯的影响
Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on the alcohol content, ethyl acetate and ethyl lactate contents in original wine of mulberry spirit
2.1.4 发酵时间的确定
由图4可知，随着发酵时间在10～50d内的延长，酒精度、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量逐渐升高；当发酵时间为50 d时，乙酸乙酯和乳酸乙酯含量均达最高值，分别为17.12 mg/L、0.18 mg/L，此时，酒精度为12.69%vol；继续增加发酵时间，酒精度趋于稳定，而乙酸乙酯和乳酸乙酯含量下降。其原因可能是发酵初期产酯酵母新陈代谢旺盛，促进酯类生成；然而在发酵后期，营养物质被消耗，合成乙酸乙酯逆反应加速[22-23]，引起酯类物质降低。因此，确定最佳发酵时间为50 d。
图4 发酵时间对桑葚蒸馏酒原酒酒精度、乙酸乙酯及乳酸乙酯的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on the alcohol content, ethyl acetate and ethyl lactate contents in original wine of mulberry spirit
2.2 桑葚蒸馏酒原酒发酵工艺优化响应面试验结果
2.2.1 响应面试验结果及方差分析
乳酸乙酯是白酒中重要的风味酯类，因其不具有挥发性对酒的回味能起到较好的缓冲平衡作用[24]。但当其含量过高时，会影响白酒香气，降低白酒的品质[25]。因此，本研究根据单因素试验结果，以发酵温度（A）、酿酒酵母添加量（B）及初始糖度（C）为自变量，乳酸乙酯含量（Y）为响应值，利用响应面试验优化桑葚蒸馏酒原酒发酵工艺条件，响应面试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 桑葚蒸馏酒原酒发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface tests for fermentation
process optimization of original wine of mulberry spirit
试验号ABCY 乳酸乙酯含量/（mgL-1）1234567891 0 1001-100--1 0010-00001-10-11 12 13 14 15 16 17 1100000-1 1000011-110--1 1 101-10 111000-1 0.133 0.200 0.200 0.152 0.157 0.153 0.200 0.156 0.126 0.200 0.156 0.147 0.135 0.210 0.159 0.158 0.152
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源平方和 自由度均方F 值P 值显著性模型ABCA B AC BC A2 B2 C2残差失拟项净误差总和0.011 5.611E-004 1.531E-004 3.380E-004 8.100E-005 1.823E-004 2.025E-005 2.792E-003 2.792E-003 3.420E-003 8.475E-005 4.750E-006 8.000E-005 0.011 91111111117341 6 1.266E-003 5.611E-004 1.531E-004 3.380E-004 8.100E-005 1.823E-004 2.025E-005 2.792E-003 2.792E-003 3.420E-003 1.211E-005 1.583E-006 2.000E-005 104.58 46.35 12.65 27.92 6.69 15.05 1.67 230.59 230.59 282.48＜0 0001 0.000 3 0.009 3 0.001 1 0.036 1 0.006 1 0.237 0＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1*****************0.079 0.967 9
采用Design Expert 8.0.6软件对表2试验结果进行多元二次回归拟合，得到乳酸乙酯含量对发酵温度（A）、酿酒酵母添加量（B）、初始糖度（C）的二次回归方程为：
由表3可知，回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P值=0.967 9＞0.05），表明模型与试验结果拟合度较好，回归方程决定系数R2为0.992 6，调整决定系数R2adj为0.983 1，表明模型拟合度较高，试验设计可靠。由P值可知，一次项A、B、C，交互项AC，二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），AB对结果影响显著（P＜0.05），其余项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，对乳酸乙酯含量影响的因素顺序为A＞C＞B。
2.2.2 各因素间交互作用的响应面分析
各因素间交互作用对桑葚发酵液中乳酸乙酯含量影响的响应曲面及等高线见图5。由图5可知，各因素间交互作用对桑葚发酵液乳酸乙酯含量影响的响应面呈凸状，存在最高值，其中AC间交互作用对乳酸乙酯含量影响的响应曲面陡峭，对乳酸乙酯含量影响极显著（P＜0.01），AB间交互作用对乳酸乙酯含量影响的响应曲面较陡峭，对乳酸乙酯含量影响显著（P＜0.05），这与方差分析结果一致。
图5 各因素间交互作用对乳酸乙酯含量影响的响应曲面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on ethyl lactate contents
2.2.3 验证试验
采用Design Expert 8.0.6软件对响应面回归模型进行最优求解，得到最优发酵工艺参数为初始糖度23.81%，糖化酶添加量0.3%，发酵温度31.4 ℃，酿酒酵母接种量2.07‰，发酵时间50 d。在此优化条件下，乳酸乙酯含量预测值为0.203 1 mg/L。为便于实际操作，将最优条件修正为发酵温度32 ℃，酿酒酵母添加量2%，初始糖度24%，在此发酵工艺条件下进行3次平行试验，得到乳酸乙酯含量实际值为0.200 0 mg/L，与预测值接近，表明此发酵工艺实验模型可靠，可用于桑葚发酵液最佳条件乳酸乙酯含量的预测，具有一定参考价值。
2.3 桑葚蒸馏酒原酒品质分析
桑葚蒸馏酒原酒理化指标检测结果见表4。由表4可知，桑葚果酒酒精度为12%vol，总酸、总酯含量分别为5.3 g/L、5.9 g/L，可溶性固形物含量为4.8 g/L。各项理化指标均符合行业标准NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》的要求。
表4 桑葚蒸馏酒原酒理化指标检测结果
Table 4 Determination results of physicochemical indexes of original wine of mulberry spirit
检测项目NY/T 1508—2017桑葚发酵酒酒精度/%vol总酸（以酒石酸计）/（g·L-1）总酯（以乙酸乙酯计）/（g·L-1）可溶性固形物/（g·L-1）7.0～18 4.0～9.0--12 5.3 5.9 4.8
2.4 桑葚蒸馏酒挥发性风味成分分析
桑葚蒸馏酒中挥发性成分分析结果见表5。由表5可知，桑葚蒸馏酒中共检测出33种挥发性风味物质，其中醇类9种，酸类7种，酯类15种，醛类1种，酮类1种。其中主要挥发性化合物为醇类和酯类，酯类化合物中含量最高的物质为乙酸乙酯、乳酸乙酯和十六酸乙酯，分别为19.64 mg/L、4.145 mg/L、1.39 mg/L。醇类化合物中含量较高的物质为异戊醇、正丙醇和异丁醇，分别为7.443 mg/L、6.936 mg/L、2.771 mg/L，对酒体贡献果香和甜香风味。酸类物质中含量较高的物质为乙酸和异丙酸，分别为7.883mg/L、0.929 mg/L。其中，乙酸是酒精发酵过程中酵母的谢产物，也是维持酯类水解平衡的重要物质[26]。醛、酮类化合物含量分别0.116 mg/L、0.035 2 mg/L。高级醇和杂醇油是蒸馏酒香气成分的重要组成部分，主要在酒精发酵过程中产生，对蒸馏酒的感官特征具有显著影响[27]。经过蒸馏的白酒能促进发酵液中前体物质的相互作用，生成新风味物质[14]。田淑林等[11]采用壶氏蒸馏器对桑葚白兰地发酵酒进行二次蒸馏得到白兰地原酒C3，其共检测出21种主要挥发性风味物质，其中酯类9种、醇类6种、酸类4种、其他类2种。酯类以亚油酸乙酯、十六酸乙酯为主，醇类物质以异丁醇、异戊醇为主。与本研究结果有所差异，这可能是由于桑葚品种、蒸馏工艺、酿酒酵母种类、发酵温度、发酵时间等差异导致。
表5 桑葚蒸馏酒挥发性风味成分测定结果
Table 5 Determination results of volatile flavor components in mulberry spirit
编号种类化合物气味阈值/（μg·L-1）[28-29]含量/（mg·L-1）OAV风味[23，30-31]1234567891 0醇类200 720 5 000 7 500 6 500 1.455 9.633 0.035 4 0.369 1.145 1-己醇正丙醇正丁醇异丁醇异戊醇正戊醇2,3-丁二醇苯甲醇苯乙醇乙酸己酸丙酸异丙酸辛酸棕榈酸癸酸乙酸乙酯己酸乙酯乳酸乙酯辛酸乙酯十四酸乙酯乙酸异戊酯十六酸乙酯癸酸乙酯苯甲酸乙酯己二酸二乙酯月桂酸乙酯9-十六碳烯酸乙酯油酸乙酯亚油酸乙酯亚麻酸乙酯苯甲醛2（3H）-呋喃酮——11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33酸类1.2 0.015 2 600 93 20 000-1.4-10 000 5 0.3 0.89 5 5.5 230 14酯类8--45.750 14 200 3.032 1.258 0.004-66.50-0.004 3 928 1 386.67 4 657.3 132.60 59.46 0.375 99.29 64.25--1 500 0.141醛类酮类——--0.291 6.936 0.177 2.771 7.443 0.109 0.399 0.054 9 0.213 7.883 0.117 0.082 5 0.929 0.093 1 0.167 0.040 9 19.64 0.416 4.145 0.663 0.327 0.086 2 1.39 0.514 0.089 0.412 0.211 0.075 6 0.540 0.799 0.085 2 0.116 0.035 2——-花香、果香和清凉感水果香、花香、青草香刺激性气味轻微的果香和甜美的气息甜润的、微带果香的味道杂醇油似的，带有轻微的辣味清淡的特征性气味具有芳香气味玫瑰的香气辛辣、酸酸的气味窖底香味酸而带甜,甜酸味奶油、椰子或霉味的气味特征微弱的脂肪气味奶油和油脂味，带有一些酸味微带果香淡淡的水果香味清新、水果味和乳酸的轻微酸味淡淡的水果和香草香气淡淡的脂肪或油脂味道水果香甜味淡淡的油脂气味椰子、水果和奶油的香味苹果或草莓的香味类似水果的香味油脂的气味柔和的水果香气和淡淡的花香气息脂肪气味,油味清新、芳香的香气温和且带有轻微植物性气息的香气苦杏仁味，同时还带有一些甜味和香气香甜、水果味或奶油味的风味
OAV是评估风味贡献大小的重要指标，在桑果蒸馏酒中OAV＞1的关键挥发性风味物质有15种，其中，醇类物质中OAV＞1的关键风味物质包括1-己醇、异戊醇、正丙醇、苯甲醇、苯乙醇，酵母菌可通过Ehrlich途径对桑葚部分氨基酸经转氨和脱羧反应形成异戊醇和苯乙醇等醇类物质[14]，赋予桑葚蒸馏酒果味、青草香，使得桑葚蒸馏酒更加细腻净爽[24]。酸类物质中OAV＞1的关键风味物质为乙酸、己酸和辛酸，使得桑葚蒸馏酒更加柔和，增加回味感和愉快感。桑葚蒸馏酒中富含多种酯类物质，其中酯类物质中OAV＞1的包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯和癸酸乙酯。多种酯类物质增加了桑葚蒸馏酒中的草莓香、苹果香气、椰子香气等，使得桑葚酒更加厚重[28]。此外，还检测出苯甲醛和2（3H）-呋喃酮，赋予了桑葚蒸馏酒的独特杏仁香气和甜味[29]。
3 结论
本研究以桑葚作为发酵底物，以发酵液酒精度、乙酸乙酯含量和乳酸乙酯含量为考察指标，采用单因素及响应面试验优化得到桑葚蒸馏酒原酒发酵的最佳工艺条件为发酵温度32 ℃，初始糖度24%，糖化酶添加量0.3%，酿酒酵母添加量2%，发酵时间50 d。在此优化条件下，桑葚蒸馏酒原酒乳酸乙酯含量为0.2 mg/L，酒精度为12%vol。其总酸、总酯及可溶性固形物含量分别为5.3 g/L、5.9 g/L、4.8 g/L。桑葚蒸馏酒共检测出33种挥发性风味物质，其中醇类9种，酸类7种，酯类15种，醛类1种，酮类1种。其中，苯甲醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、苯甲酸乙酯等对酒样风味贡献较大，整体香气协调，口感醇厚。该研究减少了桑葚资源的浪费，提升了桑葚的利用率和经济价值，为水果蒸馏酒生产提供了理论依据与技术支持。
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