白酒是中国的传统酒精饮料，也是世界上历史最悠久的蒸馏酒之一[1]，据中国酒业协会数据，2022年白酒总产量达到了671.2万kL。白酒酒糟是白酒酿造过程中产生的固体废弃物，按每生产1 t白酒产生3 t以上的酒糟计算[2]，2022年白酒酒糟产量达2 000万t，是白酒行业最大的副产物[3]。由于本身发酵不完全，其中不仅残留着淀粉、蛋白质以及脂肪等基本营养成分，还有丰富的高级醇、酯、酸等高沸点物质[4]及多酚、活性肽等重要的功能活性物质[5]。然而，白酒酒糟含水量高、酸度大，若处理不当会造成严重的环境污染。目前对酒糟的利用主要有生产饲料[2]、生产丢糟酒[6]、能源利用转化[7]、培养食用菌[8]、提取高价值成分[9]等。随着现代植物提取技术的进步，酒糟中生物活性成分的提取成为了当前研究的热点之一。
黄酮类化合物是广泛分布于植物中的一类次生代谢产物，具有抗氧化、抗菌、降血压、降血糖等重要生理活性[10-11]。目前黄酮类化合物主要从天然植物中提取，给相关企业带来了一定的经济压力。常见的提取方法有酶辅助法、超声波法、微波法、超临界流体萃取等[12-14]。超声波法利用其空化效应、热效应和机械效应实现对生物活性成分的提取[15]，具有能耗少、效率高等优势。据报道，白酒酒糟主要是由高粱、大麦等粮谷类作物制成，含有高浓度的黄酮类化合物[16]，王兴东等[17]用热回流法提取茅台酒糟中总黄酮，测定其含量达20.40 mg/g。龙谋等[18]采用超声辅助乙醇法提取苦荞红曲保健酒的酒糟总黄酮，总黄酮得率1.83%。目前对酒糟中总黄酮提取的报道已有不少，但主要以酱香型酒糟和苦荞酒糟为材料，且对提取工艺的优化和相关生理活性的研究不够深入，因此有必要对其进行深入研究。
白酒酒糟作为酿酒副产物，从中提取黄酮类化合物，不仅能降低其获取成本，同时提高了白酒酒糟的附加值，一定程度上也解决了酒糟的资源浪费与环境污染问题。因此，该研究用超声波辅助乙醇提取清香型酒糟中总黄酮，通过单因素与响应面试验优化提取工艺，并评价其体外抗氧化活性，以期为白酒酒糟资源的开发与利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
白酒酒糟：由山西某清香型白酒厂提供。
1.1.2 化学试剂
芦丁标准品（纯度＞98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS+）（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、L-抗坏血酸、过硫酸钾（均为分析纯）：上海泰坦生物科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
MS304TS/02型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；UPW型优普系列超纯水机：四川优普超纯科技有限公司；SC-3610型低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；YM-040S型超声波清洗机：深圳市方奥维电子有限公司；UV-6100S紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酒糟预处理
取新鲜酒糟在65 ℃干燥箱中干燥12 h，取出冷却，粉碎后过50目筛，于4 ℃冰箱冷藏备用。
1.3.2 芦丁标准曲线的绘制
参照龙谋等[18]的方法并稍作修改，以芦丁质量浓度（X）为横坐标，波长510 nm处的吸光度值（Y）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线。标准曲线回归方程Y=0.081 9X+0.000 8，相关系数R2=0.999 0，表明在0～0.056 mg/mL范围内线性关系良好。
1.3.3 酒糟总黄酮提取及测定
称取1.0 g干燥酒糟粉于100 mL具塞三角瓶，加入40 mL体积分数70%的乙醇溶液，设置超声功率为240 W、温度40 ℃，提取时间40 min，随后将提取液转移至离心管中，在5 000 r/min条件下离心10 min，取上清液得酒糟总黄酮提取液。以空白样为对照，根据1.3.2绘制的标准曲线及方法测定提取液中总黄酮质量浓度，并利用公式（1）计算酒糟总黄酮的得率Y。
式中：Y为白酒酒糟总黄酮得率，mg/g；n为稀释倍数；c为回归方程计算所得值，mg/mL；V为提取液体积，mL；m为酒糟粉质量，g。
1.3.4 总黄酮提取条件优化单因素试验
按照1.3.3中酒糟总黄酮提取条件为基础，采用控制变量法，分别考察液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）（mL∶g）、乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、超声功率（80 W、160 W、240 W、320 W、400 W、480 W）、超声温度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）、超声时间（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min）对酒糟总黄酮得率的影响。
1.3.5 总黄酮提取条件优化响应面试验
在单因素试验结果的基础上，固定超声时间50 min，以超声温度（A）、超声功率（B）、液料比（C）、乙醇体积分数（D）为自变量，以总黄酮得率（Y）为响应值，在Design-Expert 8.0.6软件中采用Box-Behnken原理设计4因素3水平的响应面试验优化酒糟总黄酮提取条件，响应面试验因素水平设计见表1。
表1 总黄酮提取条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for total flavonoids extraction conditions optimization
水平 A 超声温度/℃D 乙醇体积分数/%-1 B 超声功率/W C 液料比（mL∶g）01 50 60 70 240 320 400 30 40 50 60 70 80
1.3.6 白酒酒糟总黄酮抗氧化能力测定
白酒酒糟总黄酮对DPPH自由基清除能力的测定：参考李婉仪等[19]的方法，以同质量浓度的VC作阳性对照；对ABTS+自由基清除能力的测定：参考章烨雯等[20]的方法，以同质量浓度的VC作阳性对照。
1.3.7 数据处理
利用Origin 2022进行数据分析并作图；采用IBM SPSS Statistics 25.0软件进行显著性分析和方差分析，P＜0.05表示差异性显著；利用Design-Expert 8.0.6进行响应面设计及分析。所有试验均重复3次。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 液料比对白酒酒糟总黄酮提取的影响
液料比对白酒酒糟总黄酮提取的影响结果见图1。由图1可知，液料比从10∶1（mL∶g）增加到40∶1（mL∶g）过程中，各阶段白酒酒糟总黄酮得率均显著上升（P＜0.05）；当液料比超过40∶1（mL∶g）后，继续增大溶剂用量，总黄酮得率变化缓慢且不显著（P＞0.05）。原因可能是液料比较低时，白酒酒糟粉末不能被充分浸润，黄酮类化合物没有得到充分提取而得率较低；随着样品与溶剂接触面积增加，黄酮类化合物得到充分提取；当溶剂过多时，会导致单位体积溶剂获得的超声能量变小[21]，同时其他醇溶性杂质溶出，不利于黄酮类化合物的提取[22]。综合考虑成本及提取效率等因素，确定最佳液料比为40∶1（mL∶g）。
图1 液料比对白酒酒糟总黄酮提取的影响
Fig.1 Effect of liquid and material ratio on the extraction of total flavonoids from Baijiu distillers' grains
2.2.2 乙醇体积分数对白酒酒糟总黄酮提取的影响
乙醇体积分数对白酒酒糟总黄酮提取的影响结果见图2。由图2可知，当乙醇体积分数＜70%时，随着乙醇体积分数的增加，白酒酒糟总黄酮得率显著增加（P＜0.05）；乙醇体积分数70%时得率最高，此后继续增加乙醇体积分数，总黄酮得率反而降低。根据相似相溶原理，乙醇体积分数过低时水溶性杂质溶出，而乙醇体积分数过高时溶剂极性降低，一些醇溶性、脂溶性的杂质溶出[23]，这些物质与黄酮类化合物竞争溶剂，使总黄酮的溶出受到限制。且随着乙醇体积分数增加，提取成本也大大增加。综合考虑，最佳乙醇体积分数为70%。
图2 乙醇体积分数对白酒酒糟总黄酮提取的影响
Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of total flavonoids from Baijiu distillers' grains
2.2.3 超声功率对白酒酒糟总黄酮提取的影响
超声功率对白酒酒糟总黄酮提取的影响见图3。由图3可知，随着超声功率的提高，白酒酒糟总黄酮得率显著上升（P＜0.05），超声功率320 W时得率最高，随后呈现显著下降的趋势（P＜0.05）。由于超声波具有空化效应，适当提高超声功率加快了分子间的运动，促进了组织基质的溶胀、水合作用、破碎和孔隙形成[24]，有利于白酒酒糟中黄酮类化合物的释放；但超声功率过高时，温度难以控制，部分黄酮类化合物结构遭到破坏，使得率降低。因此，确定最佳超声功率为320 W。
图3 超声功率对白酒酒糟总黄酮提取的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction of total flavonoids from Baijiu distillers' grains
2.2.4 超声温度对白酒酒糟总黄酮提取的影响
超声温度对白酒酒糟总黄酮提取的影响结果见图4。由图4可知，随着超声温度升高，白酒酒糟总黄酮得率呈先上升后下降的变化。在超声温度低于40 ℃时，总黄酮得率增速较缓，超声温度超过40 ℃之后，总黄酮得率随温度升高显著增加（P＜0.05），在超声温度60 ℃时得率最高。原因可能是随着温度升高，溶液粘度降低[25]，加快了酒糟中分子的热运动，促进了黄酮类化合物的溶解；但温度过高时，部分黄酮类化合物结构遭到破坏而降解，并且伴随着其他杂质溶出和乙醇挥发，不利于提取。同时，考虑到高温下能耗增加，确定最佳超声温度为60 ℃。
图4 超声温度对白酒酒糟总黄酮提取的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of total flavonoids from Baijiu distillers' grains
2.2.5 超声时间对白酒酒糟总黄酮提取的影响
超声时间对白酒酒糟总黄酮提取的影响结果见图5。由图5可知，随着超声时间的延长，白酒酒糟总黄酮得率呈先上升后下降的趋势，在超声时间＜50 min时，总黄酮得率显著增加（P＜0.05），超声时间为50 min时得率最高，超声时间＞50 min时总黄酮得率缓慢下降。当提取时间较短时，黄酮类化合物提取不充分，随着提取时间的延长，白酒酒糟中总黄酮得率逐渐上升；由于黄酮类化合物具有抗氧化性，当提取时间过长时，部分黄酮类化合物发生氧化反应而导致变性，使总黄酮得率下降。与其他单因素试验结果对比可知，超声时间对白酒酒糟总黄酮得率的影响最小。另外，超声时间延长也增加了提取成本，不利于黄酮类化合物的工业化提取。因此，确定最佳超声时间为50 min。
图5 超声时间对白酒酒糟总黄酮提取的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction of total flavonoids from Baijiu distillers' grains
2.3 响应面法试验
2.3.1 响应面优化试验结果与方差分析
在单因素试验结果的基础上，固定超声时间50 min，以超声温度（A）、超声功率（B）、液料比（C）、乙醇体积分数（D）为自变量，以总黄酮得率（Y）为响应值，采用Box-Behnken响应面法优化白酒酒糟总黄酮得率提取条件，试验结果见表2，回归模型方差分析见表3。
表2 总黄酮提取条件优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiments for total flavonoids extraction conditions optimization
试验号ABCD总黄酮得率/（mg·g-1）1234567-1 1-1-1-1 1000 11000 0000-11-1 0000-1-1 1 10.65 11.85 11.55 10.95 13.88 13.69 13.77
续表
试验号ABCD总黄酮得率/（mg·g-1）891 0 0 1-1-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29-1 1-1 10000-00000-11-10000-1-1 11-11-1-1 11000000000 110000-11-1100000000-1-1 1100000 11000000000 1100000 13.89 11.14 11.92 11.36 11.18 13.41 13.35 13.26 13.94 11.06 11.29 11.13 11.43 13.85 14.22 13.63 13.74 14.65 14.62 14.31 14.49 14.52
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著，P＜0.01；“*”表示对结果影响显著，P＜0.05。
方差来源 平方和 自由度均方F 值P 值显著性模型14 ABCDA B********AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总和54.14 0.25 0.10 0.028 0.11 0.81 1.225×10-3 0.23 0.14 0.017 0.024 51.81 1.40 1.64 0.35 0.29 0.22 0.072 54.42 111111111111111 4 187.19 12.07 4.88 1.36 5.15 39.21 0.059 11.15 6.63 0.82 1.16 2 507.85 67.85 79.23 16.77＜0.000 1 0.003 7 0.044 3 0.263 5 0.039 6＜0.000 1 0.811 1 0.004 9 0.022 1 0.381 0 0.299 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.001 1***********10 4 28 3.87 0.25 0.10 0.028 0.11 0.81 1.225×10-3 0.23 0.14 0.017 0.024 51.81 1.40 1.64 0.35 0.021 0.022 0.018 1.21 0.462 6不显著
对表2数据进行多元线性回归分析，建立以白酒酒糟总黄酮得率（Y）与超声温度（A）、超声功率（B）、液料比（C）、乙醇体积分数（D）的二次多项式回归方Y=14.52+0.14A+0.092B+0.048C-0.094D-0.45AB+0.018AC-0.24AD+0.19BC-0.065BD+0.078CD-2.83A2-0.46B2-0.50C2-0.23D2。
由表3可知，模型的F值为187.19、P＜0.01，模型极显著，失拟项P=0.462 6＞0.05，不显著，表明模型具有统计学意义，其他因素对试验的影响较小。模型决定系数R2=0.994 7，表明模型拟合度较高；校正决定系数R2adj=0.989 4，说明模型的准确度较高，可用于预测白酒酒糟总黄酮得率最优工艺条件。由P值可知，一次项A，交互项AB、AD，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项B、D，交互项BC对结果影响显著（P＜0.05）。根据F值大小可知，各因素对白酒酒糟总黄酮得率的影响大小序为：超声温度（A）＞乙醇体积分数（D）＞超声功率（B）＞液料比（C）。
2.3.2 各因素间的交互作用分析
响应面图与等高线图可以直观地反映各因素间的交互作用对白酒酒糟总黄酮得率的影响。响应面图越陡峭、等高线图越趋近于椭圆形表明两因素的交互作用越明显，反之不明显[26]，各因素间交互作用对白酒酒糟总黄酮得率影响的响应曲面和等高线见图6。由图6可知，超声温度和超声功率的响应曲面坡度最大，且等高线图最为紧密，说明超声温度和超声功率对响应值的影响最为显著，对于超声温度和乙醇体积分数、超声功率和料液比的交互作用，虽不及超声温度和超声功率，但其响应面坡度也较陡峭且等高线呈椭圆形，说明交互作用影响次之，均对响应值有较大的影响，而其它交互项的影响则较小。这与表3中的方差分析结果一致。
图6 各因素间交互作用对白酒酒糟总黄酮得率影响的响应曲面和等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on total flavonoids extraction rate of Baijiu distillers' grains
2.3.3 验证试验
用Design Expert.8.0.6软件分析得到最佳提取工艺参数为超声温度64.61 ℃，超声功率312.56 W，液料比40.07∶1（mL∶g），乙醇体积分数65.72%，此时总黄酮得率的理论值为14.73 mg/g。综合实际操作的可行性，调整参数为超声温度65 ℃，超声功率320 W，液料比40∶1（mL∶g），乙醇体积分数66%。在此条件下进行3次平行试验，得总黄酮得率实际值为14.58 mg/g，与预测值接近，说明模型拟合良好，可用于指导白酒酒糟中总黄酮的优化提取。
2.4 白酒酒糟总黄酮的体外抗氧化能力
2.4.1 白酒酒糟总黄酮对DPPH自由基的清除能力
白酒酒糟总黄酮对DPPH自由基的清除能力测定结果见图7。由图7可知，白酒酒糟总黄酮对DPPH自由基的清除能力与其质量浓度呈一定的量效关系，在白酒酒糟总黄酮质量浓度0.005～0.10 mg/mL范围内，随着VC和白酒酒糟总黄酮质量浓度的增加，DPPH自由基清除率逐步提高，但同质量浓度下的白酒酒糟总黄酮清除能力稍弱。VC质量浓度超过0.02 mg/mL后，DPPH自由基清除率趋近于100%，而白酒酒糟总黄酮质量浓度为0.1 mg/mL时，DPPH自由基的清除率达到94.03%，略低于VC。在同质量浓度黄酮的条件下，该结果高于蒋新龙等[27]在高粱酒糟黄酮研究试验中测定的DPPH自由基清除率。结果表明，在一定质量浓度下，白酒酒糟总黄酮对DPPH自由基有良好的清除能力。
图7 白酒酒糟总黄酮对DPPH自由基的清除能力
Fig.7 DPPH radical scavenging capacity of total flavonoids from Baijiu distillers' grains
2.4.2 白酒酒糟总黄酮对ABTS+自由基清除能力
白酒酒糟总黄酮对ABTS+自由基的清除能力测定结果见图8。由图8可知，在白酒酒糟总黄酮质量浓度0.005～0.06 mg/mL范围内，随着VC和白酒酒糟总黄酮质量浓度的增加，ABTS+自由基清除率均逐步提高，呈现一定的量效关系。在质量浓度为0.005 mg/mL时，白酒酒糟总黄酮的ABTS+自由基清除率略高于VC，质量浓度超过0.01 mg/mL后，VC的ABTS+自由基清除率始终高于白酒酒糟总黄酮的ABTS+自由基清除率，但差别极低。VC质量浓度达到0.04 mg/mL后，其ABTS+自由基清除率趋近于100%，而白酒酒糟总黄酮质量浓度在0.06 mg/mL时ABTS+自由基清除率达到99.3%，说明白酒酒糟总黄酮ABTS+自由基清除能力虽略低于VC，但也表现出极强的ABTS+自由基清除能力。
图8 白酒酒糟总黄酮对ABTS自由基的清除能力
Fig.8 ABTS radical scavenging capacity of total flavonoids from Baijiu distillers' grains
3 结论
利用超声波辅助乙醇提取白酒酒糟中的总黄酮，用单因素试验与响应面相结合的方法探索其最佳提取工艺，得出最优提取工艺为：乙醇体积分数66%，液料比40∶1（mL∶g），超声温度65 ℃，超声功率320 W，超声时间50 min。此条件下，白酒酒糟总黄酮得率为14.58 mg/g。其对DPPH自由基、ABTS+自由基均有很强的清除能力。因此，此研究可为白酒酒糟总黄酮作为天然抗氧化剂在食品与保健品等领域的开发利用提供一定的理论依据。
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