黄花菜（Hemerocallis citrina）又名金针菜、萱草，因食用后常有舒畅安逸的感觉，也被称为“安神菜”，黄花菜富含蛋白质、脂肪、糖类等营养物质，是药食同源作物[1-3]。大同有600余年的黄花菜种植历史，是闻名遐迩的“黄花菜之乡”，大同黄花菜是山西名优特产[4]。随着2020年5月总书记视察大同有机黄花菜标准种植基地时“小黄花大产业”的讲话，大同黄花菜产业化发展步入快车道，种植面积达到26万亩，年产值达9亿元[5]。如何发展大同黄花菜深加工，延长产业链，提升综合效益成为研究的热点。
玉露香梨是山西省农业科学院果树研究所专家团队以雪花梨为父本、库尔勒香梨为母本经多年杂交选育而成的中熟梨品种，其果味清香可口、果肉白嫩似雪，是2008年北京奥运会官方指定用梨。近年来随着玉露香梨种植规模的不断扩大，出现了梨落果、滞销等许多制约玉露香梨产业发展的瓶颈问题[6-8]。植物乳植杆菌属于同型发酵乳酸菌，是一类安全的食品级微生物，近年来已广泛应用于发酵生产各型果蔬汁[9-11]。宋一恒[12]以水晶梨为原料，进行先酵母富硒发酵后乳酸发酵，优化工艺后得到富硒梨醋；仝文玲[8]以植物乳植杆菌发酵玉露香梨汁，通过发酵其抗氧化能力提高，其中对2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）的清除力提高了8.45%。目前梨汁的发酵研究以工艺优化为主，对于药食同源作物复配梨汁的发酵涉及甚少，缺乏对复配发酵梨汁呈味物质与营养成分变化规律及形成机理的进一步探索。
本研究以晋中学院生物科学与技术系分离得到的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）gz03为发酵菌株，以山西特产大同黄花菜和玉露香梨为原料进行发酵生产复合梨汁。探讨其发酵过程中梨汁的理化性质与风味物质的变化，并对不同发酵阶段的梨汁风味物质进行主成分分析（principle component analysis，PCA），旨在为黄花菜梨汁的工业化开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉露香梨：采自山西原平，并由山西农业大学食品科学与工程学院（农产品贮藏保鲜研究所）贮藏与提供；大同黄花菜干制粉（过20目筛）：由山西功能食品研究院提供；植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）gz03：由晋中学院生物科学与技术系分离保藏。
MRS培养基、NaCl、苯酚（均为分析纯）：青岛海博生物科技有限公司；硫酸（分析纯）：厦门安永博科技有限公司；葡萄糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SJ30榨汁机：浙江苏泊尔股份有限公司；JA1003电子天平：上海普瑞斯特股份有限公司；SNCJ-1G超净工作台：上海尚仪股份有限公司；722S分光光度计：上海精科股份有限公司；Fresco 17离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；303-0B恒温培养箱：浙江尚诚股份有限公司；FE28pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；RSD200数显糖度计：田园信科光学仪器有限公司；LDZX-75L立式灭菌锅：上海申安医疗机械厂；PDMS-30 μm固相微萃取头：美国Supelco公司；5977A气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黄花菜梨汁饮料制备工艺流程及操作要点
操作要点：
原料处理：挑选大小均匀，无病虫害的玉露香梨去皮去核后用榨汁机榨汁。
混合：以香梨汁为基准，以3 g/100 mL的添加量加入黄花菜干制粉。
灭菌：将梨汁与黄花菜干制粉混合后，90 ℃巴氏灭菌15 min，冷却至30 ℃。
接种：参照陈清爱等[13]的方法，利用MRS培养基制备OD600 nm值为0.5～0.6的植物乳植杆菌gz03菌悬液。植物乳植杆菌gz03在MRS培养基上活化、转接培养至对数期，取两支4 mL离心管，各加入1 mL菌液，10 000 r/min离心5 min后去上清液，再各滴加1 mL生理盐水，离心、润洗重复2～3次，最后加入无菌生理盐水将其OD600nm值调整至0.5～0.6，以1%的接种量接入植物乳植杆菌gz03进行发酵。
发酵：根据前期的工艺优化实验结果，设置发酵条件为发酵温度33 ℃和发酵时间45 h。
过滤：发酵完成后400目纱布进行过滤，得到黄花菜梨汁饮料成品。
1.3.2 黄花菜梨汁饮料发酵过程中理化指标检测
以1.3.1所述方法制备黄花菜梨汁饮料，并在发酵的0 h、15 h、30 h和45 h对发酵液中的pH、总酸和总糖进行检测。pH值测定由pH计直接测定，总酸的测定按照GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》中的方法进行测定，总糖的测定采用苯酚-硫酸法进行测定[14-15]。
1.3.3 感官评分标准
邀请10位具有感官评价经验的人员，以色泽、甜度、酸度、香气和滋味为评分项，对不同发酵阶段的黄花菜梨汁进行感官评价，参考吴江娜[16]的方法，每个单项赋10分，总分为50分，评分标准见表1。
表1 黄花菜梨汁饮料感官评分标准
Table 1 Sensory score standards of Hemerocallis citrina and pear juice
项目评分标准分值/分色泽（10分）甜度（10分）酸度（10分）色泽呈现灰色或棕色，非常不均匀，暗淡色泽呈现淡黄色，略有不均匀，稍显暗淡色泽呈现橘黄色，均匀，有光泽过甜或过淡，口感粗糙偏甜或偏淡，口感不刺激甜度适中，口感协调柔和过酸或过淡，有酸馊感偏酸或偏淡，略有馊味酸度适中，回味醇厚0～4 5～7 8～10 0～4 5～7 8～10 0～4 5～7 8～10
续表
项目评分标准分值/分香气（10分）滋味（10分）无香气，有刺激性气味香气偏淡，不协调香气浓郁，协调滋味寡淡或异常滋味略有失调，略有涩感滋味浑厚饱满，协调，怡人0～4 5～7 8～10 0～4 5～7 8～10
1.3.4 黄花菜梨汁饮料发酵过程中风味物质检测
以1.3.1的方法制备黄花菜梨汁饮料，并在发酵的0 h、15 h、30 h和45 h对发酵液中的风味物质进行检测。
前处理条件：取5 mL的发酵液到顶空萃取瓶中，加入磁力转子、NaCl 1 g并迅速密封，在40 ℃、600 r/min条件下孵化20 min后进行萃取（30 min），于气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）中检测分析[17-19]。
GC条件：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），载气使用高纯氦气（He），流速1.0 mL/min，进样口温度设为250 ℃；柱温箱初始温度设为40 ℃并保持3 min；以5 ℃/min的速度升温至120 ℃并保持3 min；以20 ℃/min的速度升温至230 ℃并保持5 min；最后在250 ℃的条件下运行5 min，见参考文献[13，20]。
MS条件[11]：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，接口温度为230 ℃，质量扫描范围为质荷比（m/z）35～500。
定性定量分析[11]：挥发性风味物质定性主要是由GC-MS中美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）14质谱数据库、匹配度和保留时间对各个物质进行检索。选择正向（SI）和反向（RSI）匹配度均＞800、相似度＞50的物质作为有效的香气成分，按峰面积归一化进行相对定量，计算挥发性风味物质的相对百分含量。
风味活性物质的测定：参照王若琳等[21-23]的方法，计算气味活性值（odor active value，OAV），并以OAV≥1判定该物质为主要风味贡献物质。
1.3.5 数据处理
采用Excel 2010整理数据；Origin 2018制作雷达图和热图；采用迈维云平台制作PCA图（https：//cloud.metware.cn）；SPSS 17.0软件进行方差和差异显著性分析，数据均为3次平行试验的平均值。
2 结果与分析
2.1 黄花菜梨汁饮料发酵过程中理化指标变化
黄花菜梨汁饮料发酵过程中理化指标检测结果见表2。由表2可知，随着发酵的进行，发酵液pH值与总糖含量先升高后降低，而总酸含量先降低后升高。发酵前期，乳酸菌一方面可利用苹果酸产生乳酸从而消耗苹果酸，这使得发酵液的pH值升高而总酸含量下降，另一方面乳酸菌的代谢可使发酵液中的总糖含量升高，这与前人报道一致[24-25]。随着发酵的继续，乳酸菌代谢旺盛，不断地利用糖类物质合成乳酸，使得总糖含量下降；而乳酸的不断累积使得pH值下降而总酸含量上升。
表2 黄花菜梨汁发酵过程中理化指标测定结果
Table 2 Determination results of physicochemical indexes of Hemerocallis citrina and pear juice during fermentation
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
发酵时间/hpH总糖/（g·L-1）总酸/（g·L-1）0 15 30 45 4.46±0.01b 4.55±0.03a 4.03±0.01c 3.84±0.02d 103.24±0.72 b 109.58±1.05a 100.35±0.98c 91.19±1.262d 5.59±0.03c 5.02±0.03d 5.81±0.04b 5.99±0.07a
2.2 黄花菜梨汁饮料发酵不同阶段感官评价
感官评价是评判食品质量好坏的重要方式之一，黄花菜梨汁饮料发酵不同阶段感官评价雷达图见图1。由图1可知，随着发酵时间的延长，黄花菜梨汁饮料的色泽、甜度、酸度、香气和滋味都发生明显的变化。甜度评分在发酵15 h后没有明显变化，但在30 h后呈下降趋势，而色泽、酸度、香气和滋味的评分则逐渐上升。发酵45 h黄花菜梨汁饮料呈橘黄色、质地均匀、酸甜适口、气味清香，总感官评分最高。因此黄花菜梨汁饮料经植物乳植杆菌gz03发酵能够有效提升其感官品质。
图1 黄花菜梨汁发酵不同阶段感官评价雷达图
Fig.1 Radar map of sensory evaluation of Hemerocallis citrina and pear juice at different fermentation stages
2.3 黄花菜梨汁饮料发酵不同阶段挥发性风味物质差异分析
果蔬汁经乳酸菌发酵可产生令人愉悦的呈香风味物质，发酵过程中风味物质的丰度和结构组成是评价黄花菜梨汁品质的重要参数[26]。发酵过程中不同种类风味物质数量分析结果见表3。由表3可知，植物乳植杆菌发酵黄花菜梨汁饮料过程中检测到挥发性风味物质有八大类共70种，随着发酵时间的推移其丰度和结构组成处于动态变化之中，发酵前黄花菜梨汁中的挥发性风味物质有34种，以醇类、醛类和酮类为主；经过45 h的发酵后，挥发性风味物质的种类发生变化，减少了16种物质又新产生了22种物质，发酵45 h后挥发性风味物质总数达到40种。
表3 发酵过程中不同种类风味物质数量分析
Table 3 Quantity analysis of different flavor substances during fermentation
发酵时间/h 数量/种 醇类 醛类 酚类 烃类 酸类 酸类 酮类 其他类化合物0 15 30 45 34 35 31 40 8991 3 8756 1122 3332 0112 2433 4468 8624
黄花菜和玉露香梨本身含有丰富的糖、氨基酸、矿物质和维生素等物质，是植物乳植杆菌发酵的优良底物，是挥发性风味物质多样性的物质基础，发酵过程中挥发性风味物质差异性分析热图见图2。由图2可知，发酵过程中醇类物质的种类和含量从总体上看呈增加趋势，发酵后新增了糠醇、1-庚醇、1-辛醇、1-癸醇、月桂醇、4-苯基噻唑-2-硫醇、1-辛烯-3-醇、3-甲基-2-庚醇这八种物质，相对峰面积增加最多的是3-甲基-2-庚醇，达到1.02%；1-壬醇存在于所有4个发酵时期，其相对峰面积由最初的0.46%上升到0.84%。月桂醇具有花香气、1-辛醇具有柠檬香气、1-癸醇具有鲜美的香气，这些醇类物质的增加为黄花菜梨汁饮料独特的风味做出贡献[27]。橙花醇、1-戊烯-3-醇、2-辛烯-1-醇和苯乙醇是黄花菜含有的物质，在其他发酵梨汁中未见报道，其中橙花醇具有花香和果香气、苯乙醇具有玫瑰花香气[28]。橙花醇与苯乙醇在发酵过程中相对含量逐渐下降，由发酵初始的23.18%与9.26%下降到发酵结束时的11.25%与4.19%，橙花醇与苯乙醇的加入赋予黄花梨汁饮料独特的风味。1-戊烯-3-醇具有烧焦气味、2-辛烯-1-醇具有酸败脂肪气味，两种物质在发酵后均被代谢掉，改善了黄花梨汁的风味。发酵前醛类物质有8种，其中2-甲基-2-丁烯醛、2-庚烯醛在其他发酵梨汁中未见报道，5-羟甲基糠醛为发酵30 h后产生的新物质，其相对峰面积达到0.28%，发酵后醛类物质减少到6种。醛类物质的总体含量随着发酵时间的累积而逐渐减少，说明乳酸菌发酵可有效消除醛类物质刺激性气味。酚类物质和烃类物质的含量在整个发酵过程中变化不明显，二者对发酵型黄花梨汁饮料的风味影响不显著。就酸类物质而言，含量的增加虽然能使发酵液的酸度增强，但乙酸（0.86%）和丙氨酸（0.66%）的累积会产生酸馊味，对黄花梨汁的风味有一定影响[29]。酯类具有香甜的气味，对各种果蔬形成其独特风味贡献巨大，发酵过程中新产生了乙酸甲酯（0.96%）和甲酸己酯（1.15%）两种新物质，改善了发酵液原有的风味。酮类物质中，β-紫罗兰酮（6.88%）和3,5-辛二烯-2-酮（0.27%）在大同黄花菜中含量较高，在纯梨汁中从未出现；羟基丙酮（1.46%）、3,3-二甲基-2,4-戊二酮（0.11%）、香叶基丙酮（0.92%）、大马士酮（1.19%）和3-乙基环丁烷酮（0.25%）均为发酵后期新产生的物质，其中羟基丙酮具有明显的奶油香气，香叶基丙酮可呈现清新的水果味道，而大马士酮则富含浓郁的花香，这些物质的产生极大的丰富了黄花菜梨汁饮料的风味[30]。最后，茴香脑具有甘草香味，其含量在发酵前后保持稳定；而2-乙酰基呋喃、2-正戊基呋喃和3-乙酰基-2,5-二甲基呋喃具有令人不愉悦的气味，植物乳植杆菌可在发酵过程中将3种物质完全消除；4-溴-2-氯苯胺的产生会对发酵液的风味产生一定影响。总体上，黄花菜梨汁饮料经发酵后呈味物质的种类和含量产生显著变化，形成黄花菜梨汁饮料独特的风味。
图2 发酵过程中挥发性风味物质差异性分析热图
Fig.2 Heat map of difference analysis of volatile flavor substances during fermentation process
2.4 黄花菜梨汁饮料发酵不同阶段挥发性风味物质OAV分析
OAV可以更准确地体现各个风味性物质对产品整体风味的影响。通常情况下，OAV≥1的风味物质对产品整体香气的贡献较大，且OAV与贡献度成正比，通过查阅文献计算上述70种挥发性风味物质的OAV[21-23]，结果见表4。
表4 发酵过程中气味活性值≥1的化合物
Table 4 Compounds of OAV≥1 during fermentation
注：同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
OAV 0 h15 h30 h45 h序号化合物名称阈值/（μg·kg-1）气味描述1234567891 0芳樟醇月桂醇橙花醇1-戊烯-3-醇2-辛烯-1-醇1-壬醇正己醛苯甲醛癸醛正辛醛壬醛2-庚烯醛正己酸乙酯2-甲基丙酸酯6-甲基-5-庚烯-2-酮香叶基丙酮大马酮大马士酮β-紫罗兰酮2,6-二甲基吡嗪5-甲基-2-苯基吲哚3-特戊酰胺苯甲醚茴香脑6 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 0.7 120 350 75 45.5 5 350 0.1 0.9 1 13.1 0.1 1.3 50 60 1 0.05 0.09 1.43 1.3 0.6 15 9.11±0.11a＜1 79.65±0.51a 2.02±0.08a 1.86±0.10a 1.06±0.12b 2.89±0.12a 3.56±0.23a 15.38±0.31a 5.48±0.24a 5.11±0.14a 2.82±0.14a＜1＜1 2.94±0.17a＜1 5.57±0.25a＜1 47.84±0.20a＜1＜1 1.96±0.14a 1.85±0.16a 5.85±0.13c＜1 65.29±0.24b 1.37±0.14b＜1 1.22±0.18b＜1 3.01±0.15b 7.62±0.22d＜1 2.02±0.15b 1.57±0.25b 3.64±0.23a＜1 1.88±0.19b＜1 2.69±0.22b＜1 41.28±0.29b＜1 1.65±0.14a＜1＜1 7.64±0.16b 3.72±0.15a 30.03±0.49d＜1＜1 2.15±0.19a＜1 2.08±0.12c 8.25±0.27c＜1 1.19±0.13c＜1＜1 2.75±0.07a 1.81±0.15b＜1＜1 8.35±0.23b 33.56±0.31c＜1＜1＜1 1.39±0.18b 8.97±0.13a 5.54±0.23b 42.26±0.32c＜1＜1 2.41±0.11a＜1 1.67±0.14d 12.06±0.16b＜1＜1＜1＜1＜1＜1 1.08±0.17a＜1 22.93±0.28a 29.83±0.29d 1.42±0.10a＜1＜1 1.76±0.08a花香、木香味花草香味花香、果香味焦糊味酸败脂肪味甜橙味青草味苦杏仁味柑橘味肥皂味青草味果味、脂肪味果香味果香味甜瓜香味花果香味玫瑰香味强玫瑰花香味果香、木香坚果香味粪便腐臭味辛辣味山楂花香味
由表4可知，随着发酵时间的增加，各物质的OAV出现不同程度的消长变化，发酵初始阶段（0 h）一共有16种挥发性风味物质的OAV≥1，发酵15 h后有13种挥发性风味物质的OAV≥1，30 h后有12种挥发性风味物质的OAV≥1，45 h后有11种挥发性风味物质的OAV≥1，四个发酵时期OAV≥1的挥发性风味物质的种类和数量各不相同差异显著，其中OAV随发酵时间增加而增加的物质为月桂醇、1-壬醇、大马士酮；OAV随发酵时间增加而先降低后增加的物质为芳樟醇、橙花醇、癸醇减少的物质为1-戊烯-3-醇、茴香脑；OAV随发酵时间增加而降低的物质为苯甲醇、壬醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-紫罗兰酮。橙花醇、癸醛、大马士酮和β-紫罗兰酮对发酵45 h的黄花菜梨汁饮料整体香气的贡献度最大。
2.5 黄花菜梨汁饮料发酵不同阶段挥发性物质主成分分析
主成分分析是一种用于多维数据统计分析的无监督模式识别方法。它的目的是通过降低维度的方式，利用少数几个主成分来展示多个变量之间的结构差异，PCA可以为复杂数据集提供直观的解释，揭示观测数据的分组和趋势，还可以用于筛选出离群样本[31]。本试验以黄花菜梨汁饮料发酵过程中检测到的风味物质相对含量为变量，通过变量间的合并和降维，实现对不同发酵阶段黄花菜梨汁的风味物质进行主成分分析，结果见图3。
图3 黄花菜梨汁饮料发酵不同阶段挥发性风味物质主成分分析
Fig.3 Principal components analysis of volatile flavor substances of Hemerocallis citrina and pear juice at different fermentation stages
A：0 h，B：15 h，C：30 h，D：45 h。
由图3可知，变量降维后PC1和PC2的方差贡献率分别为79.36%和11.21%，累计方差贡献率为90.57%。每个发酵时间点的样本都聚类在一起，说明各个发酵时间点的组内重复样本相似度非常高；而不同的发酵时间点的样本在二维坐标图中有明显的区隔，说明发酵的不同阶段黄花菜梨汁中的风味物质的组成存在显著差异。以上结果结合感官评价分析表明，黄花菜梨汁风味物质丰度在整个发酵历程都处于动态变化中，发酵完成后各组分趋于稳定、协调，风味和口感达到最佳，PCA能将不同发酵阶段的样品进行区分。
3 结论
大同黄花菜和玉露香梨都是山西的名优特产，但二者的深加工产业发展还不健全。本研究以具有自主知识产权的植物乳植杆菌gz03为发酵剂，将大同黄花菜与玉露香梨有机结合制备发酵型黄花菜梨汁饮料，系统分析了发酵过程种黄花菜梨汁饮料的理化性质与风味物质变化情况，结果显示发酵不同阶段黄花菜梨汁饮料的理化指标与风味物质都有明显差异，发酵45 h后的黄花菜梨汁饮料中风味物质最为丰富，有浓郁的花果香气，呈现了特有的风味特征。该研究为黄花菜梨汁饮料的工业化开发提供了理论依据。
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