白酒作为我国的传统饮品，不同的酿造工艺使其具有不同的风格，目前我国白酒主要划分为12个香型，白酒中独特的风味成分是鉴别不同白酒风格和品质的关键[1-2]。采用“端午踩曲，重阳投料，九次蒸煮，八次循环发酵，七次取酒”传统工艺酿造的丹泉酒是酱香型洞藏酒的典型代表[3-4]。因地域条件、气候条件和贮存工艺的不同，使其具有“幽雅细腻、绵柔甘润、回味悠长、空杯留香”的独特韵味。近年来，随着对白酒香气构成研究的不断深入，研究人员愈发关注于微量香气化合物如何影响白酒整体风味的形成[5-7]。然而，白酒中挥发性成分组成极为复杂，部分微量香气化合物具有极低的香气阈值，如何成功地从酒体中一次性分离检测上千种物质对现有主流的一维色谱检测技术带来极大的挑战[8]。
全二维气相色谱-飞行时间-质谱（two-dimensional gas chromatography-time-of-flight-mass spectrometry，GC×GCTOF-MS）是以一维气相色谱分析技术为基础衍生出来的新型化学鉴定技术，相比于传统的单色谱柱分离，GC×GCTOF-MS 引入2根分离性质不同的色谱柱，将第一根色谱柱分离得到的馏出物在调制器内进行浓缩聚集后导入第二根色谱柱进行再次分离[8]。从而可以更有效地分配化学性质相近化合物的出峰时间，改善化合物共流出对定性定量的影响[9]。当前GC×GC-TOF-MS技术被广泛应用于多种香型白酒[10-13]、葡萄酒[14]、白兰地[15]等具有复杂挥发性化合物组成的研究分析，并取得良好效果[8]。然而，对于酱香型白酒中挥发性风味化合物组成的GC×GC-TOF-MS分析报道较少，尤其是对不同酒龄洞藏酱香型白酒中的风味成分差异研究还鲜见报道[13]。
丹泉酒产区位于云贵高原南部、广西与贵州交界处，这里四季宜人，是中国高端酱酒南部产区。丹泉酒业拥有专属藏酒洞“洞天酒海”，13.3万m2的藏酒洞荣获吉尼斯世界纪录“最大的藏酒洞”称号，该洞内现储有酱香酒8万t。洞天酒海四季温度稳定在16～17 ℃，湿度90%左右。适宜而稳定的湿度和温度，对酒体中特有风味物质的形成起到至关重要的作用，可以促进酒体自然产酯生香[16]。
本实验采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合GC×GC-TOF-MS技术对丹泉酱香型洞藏白酒中挥发性风味化合物进行鉴定，并通过对酒体中微量特征组分的解析，分析市售不同酒龄的洞藏丹泉白酒在化合物成分上的差异构成，旨在进一步加深对洞藏酱香型白酒的了解，为洞藏酱香型白酒风味特征的研究提供理论依据[5，17-18]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
丹泉酱香型洞藏酒（分别为丹泉5年（DQ5），丹泉15年（DQ15），丹泉20年（DQ20）和丹泉30年（DQ30），酒精度均为53%vol）：广西丹泉酒业有限公司；NaCl（分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
DVB/c-WR/PDMS（2cm，50/30μm）固相微萃取纤维头：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；LECO Pegasus 4D全二维气相色谱-飞行时间-质谱：美国Leco公司；DB-WAX一维色谱柱（60 m×250 μm×0.25 μm）、DB-17二维色谱柱（1.79 m×180 μm×0.18 μm）：美国安捷伦公司；Milli-Q系统：美国Millipore公司。
1.3 实验方法
1.3.1 不同酒龄丹泉酱香型洞藏酒挥发性风味物质测定
HS-SPME前处理：精确移取待测酒样和饱和氯化钠各1 mL至顶空瓶中，加盖密封，在45 ℃条件下平衡5 min后开始萃取，萃取时间为40 min，萃取完毕，将萃取头立即插入250 ℃的GC进样口解吸附5 min后进行GC×GC-TOF-MS分析。相同条件下进样3次[5，13，18]。
色谱条件：载气为高纯氦气（He），流速1.0 mL/min，分流比20∶1，进样口温度为250 ℃。一维色谱柱设定升温程序为45 ℃保温3 min后，以3 ℃/min升温至150 ℃，保温2 min后以6 ℃/min升温至200 ℃，随后以10 ℃/min升温至230 ℃并保持10 min。二维柱温保持比一维柱高5 ℃。调制补偿温度为15 ℃，调制周期为4 s[17]。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，检测器电压为1 450 V，质谱扫描范围为35～600 m/z。采集速率为100 spectra/s，设置溶剂延迟时间为100 s，二维数据由LECO公司Chroma TOF
工作站采集[17-21]。
定性定量分析：采集到的质谱数据由美国LECO公司Chroma TOF工作站进行处理，自动识别信噪比＞50的色谱峰，并与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14和Wiley 9质谱库进行比对，经人工解谱与同系物二维色谱出峰规律比对，作为初步鉴定结果。选择相似度与反相似度＞700，可能性＞4 000的化合物作为鉴定得到的挥发性风味物质；采用峰面积归一法计算各成分的相对含量。所有样品做3次平行[17-22]。
1.3.2 挥发性组分聚类分析
选用各酒样中除乙醇外相对丰度最高的前20种挥发性风味物质进行热图分析和层次聚类分析（hierarchical clustering analysis，HCA），对比分析挥发性组分在不同酒龄的酒体中的分布规律。热图绘制采用R语言的pheatmap包实现。
2 结果与分析
2.1 基于GC×GC-TOF-MS分析丹泉酱香型洞藏酒挥发性风味化合物的分离特性[5]
选用一维柱DB-WAX与二维柱DB-17串联进行分离，以DQ30酒样为例的挥发性风味化合物的一维和二维总离子流色谱图见图1。DQ5、DQ15、DQ20、DQ30酒样的三维总离子流色谱图见图2。
图1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法测定DQ30酒样的一维（a）和二维（b）总离子流色谱图
Fig.1 One-dimentional (a) and two-dimentional (b) total ion chromatogram of Baijiu sample DQ30 based on HS-SPME-GC×GC-TOF-MS
图2 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法测定DQ5（a）、DQ15（b）、DQ20（c）及DQ30（d）酒样的三维总离子流色谱图
Fig.2 Three-dimentional total ion chromatogram of Baijiu samples DQ5 (a), DQ15 (b), DQ20 (c) and DQ30 (d) based on HS-SPME-GC×GC-TOF-MS
由图1可知，在DQ30酒样共检测到565个色谱峰，说明丹泉酱香型洞藏酒中挥发性组分构成复杂，一维色谱图共流出现象严重，在同一个一维时间坐标上，存在多种风味成分，通过进一步的二维色谱分离，大多数共流的化合物在二维色谱图中得到了较好的分离[5，17，22]。在全二维色谱分离过程中，由于化合物先后通过两种不同极性的色谱柱进行分离，可实现具有相同结构的化合物在谱图上呈现线性分布[23]，为白酒中挥发性化合物的定性提供依据，保证了鉴定结果的可靠性。由图2可知，不同酒龄丹泉酒的挥发性组分差异显著，且色谱峰随着年份的增加成分越加复杂。
2.2 基于GC×GC-TOF-MS对丹泉酱香型洞藏酒中挥发性风味化合物的鉴定
由图3可知，在不同酒龄的丹泉酱香型洞藏酒样品中共鉴定出可信度较高的挥发性风味化合物共342种[5，13]。丹泉酱香型洞藏酒样品中主要包括酯类、醇类、芳香类、酸类、醛酮类、呋喃类、含氮类、含硫类、烃类、萜烯类、吡嗪类等11类化合物[5，13]。其中酯类化合物种类最多，共有85种。相对含量较高的有己酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸正丙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、庚酸乙酯、2-羟基-丙酸乙酯。乙酯类化合物在丹泉酱香型洞藏酒酯类物质分布中占据主要地位，其作为一种良好的风味物质，主要给酒体带来果香、甜香的风味[24-25]。除酯类化合物外，化合物分布种类较多的为醇类物质，共54种。相对含量较高的有3-甲基丁醇、2-甲基丁醇、丁醇、丙醇、2-甲基丙醇、己醇、2-戊醇。丁醇、丙醇类化合物是丹泉酒醇类风味构成的骨架成分，主要提供酒体溶剂香[26]。此外，还鉴定得到丹泉酱香型洞藏酒中酸类42种、芳香类31种、醛酮类30种、含氮类化合物30种、萜烯类21种、烃类19种、呋喃类18种、吡嗪类8种，含硫类化合物4种。各类挥发性风味成分相互协同耦合，形成了丹泉酱香型洞藏酒的独特感官及风格特征[5，13]。
图3 丹泉酱香型洞藏酒挥发性风味化合物种类及数量鉴定结果
Fig.3 Identification results of types and number of volatile flavor compounds in cave aged sauce-flavor Danquan Baijiu
不同酒龄丹泉酱香型洞藏酒中主要挥发性风味化合物的种类变化情况见表1。由表1可知，4种不同贮存年份的丹泉酱香型洞藏酒中分别检出96、78、167、211种挥发性风味化合物，白酒中的挥发性风味化合物种类随着贮存时间的延长而不断增加[5]。其中以酯类物质种类的增加最为明显，这可能是由于白酒在贮存老熟过程中酯类物质在酒体内部不断进行着酸-醇酯化、水解、酯-酸交换等可逆化学反应，是一个动态平衡的过程，随着储存年份的增加，老熟过程中酒体内的中间产物种类不断增多，从而导致酯类物质的多样性显著增加[27-28]。除酯类风味物质外，醇类、醛酮类、烯烃类、吡嗪类、萜烯类、呋喃类化合物的数量随着贮存时间的增长变化较大，其余几种化合物种类数量随贮存时间的增长变化相对较小，这些挥发性化合物种类及含量的差异是导致不同酒体间存在复杂的风味特征差异的直接原因[5]。
表1 不同酒龄丹泉酱香型洞藏酒中主要挥发性风味化合物的种类
Table 1 Main volatile flavor compounds types in caveaged sauceflavor Danquan Baijiu with different ages
化合物种类酯类醇类芳香类醛酮类酸类烃类含硫类含氮类吡嗪类萜烯类呋喃类合计样品编号DQ5DQ15DQ20DQ30 8 19 12 12 19 17 23 451 7190279 6 0311 00237 8 49 29 10 20 14 14 1 10 2 10 8 167 52 35 17 22 18 10 3 23 8 11 12 211
2.3 丹泉酱香型洞藏酒中吡嗪类化合物的分析鉴定
吡嗪类化合物是一类在1、4位含两个氮杂原子的六元杂环化合物的统称，其广泛存在于自然界中，一般具有焙烤香、坚果香、咖啡等独特香味特征[29]。吡嗪类化合物在酒精-水溶液中的感官阈值为730～121 927 μg/L，香味阈值较低，是构成相关白酒风味的重要化合物[30]。研究表明，吡嗪类化合物具备抗氧化性、抗癌性等生理功能，作为白酒中的微量健康成分在饮酒过程中起到缓解酒精伤害、提升人体防御机能等效果[31-33]。由表2可知，本研究从丹泉酱香型洞藏酒中共鉴定得到8种吡嗪类化合物，其中三甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪的相对丰度最高，它们在构建丹泉酱香型洞藏酒香气特征的同时作为重要的保健功能成分赋予了酒体相应的生理功能。
表2 丹泉酱香型洞藏酒中的吡嗪类化合物
Table 2 Pyrazine compounds in cave aged sauce-flavor Danquan Baijiu
序号化合物CAS1维保留时间/s2维保留时间/s相似度反相似度相对含量/%12345678 2-甲基吡嗪2,5-二甲基吡嗪2,6-二甲基吡嗪2,3-二甲基吡嗪2-乙基-6-甲基吡嗪2,3-二甲基-5-乙基吡嗪四甲基吡嗪三甲基吡嗪109-08-0 123-32-0 108-50-9 5910-89-4 13925-03-6 15707-34-3 1124-11-4 14667-55-1 1 104 1 268 1 288 1 340 1 448 1 652 1 688 1 496 1.230 1.410 1.410 1.460 1.570 1.710 1.680 1.550 765 823 907 840 834 799 837 868 882 906 946 904 899 880 904 915 0.002 0.001 0.010 0.002 0.003 0.001 0.006 0.016
2.4 市售不同酒龄丹泉酱香型洞藏酒挥发性风味化合物层次聚类分析
选用微量成分中相对含量分布最高的前20种挥发性物质进行层次聚类热图分析，比较分析不同酒龄的酒体风味特征成分组成差异变化情况，结果见图4。
图4 丹泉酱香型洞藏酒挥发性组分层次聚类分析热图
Fig.4 Hierarchical clustering analysis heat map of volatile compounds in cave aged sauce-flavor Danquan Baijiu
由图4可知，丹泉酒依据挥发性风味化合物种类及含量的差别显示其较为明显的年代特征，低酒龄丹泉酒（15年以下）和高酒龄丹泉酒（20年以上）分别聚类到不同位置。此外，图4将市售不同酒龄丹泉酱香型洞藏酒中挥发性风味化合物的含量通过颜色的变化直观展现出来，高酒龄丹泉酒中特征性挥发性成分更加复杂，主要有1-丙醇_2-甲基（异丁醇）、癸酸乙酯、1-丙醇、己酸乙酯、1-丁醇、糠醛。如癸酸乙酯、己酸乙酯这类含有4～12个碳原子的中链脂肪酸酯的果香气味馥郁，并且在酒体中较为稳定，因此中链脂肪酸酯富有芳香气味且持续时间长，中链脂肪酸酯含量的提升，可看作白酒品质提高的标志[34-36]。结果表明，丹泉酒体风味根据贮存年份的增加呈现上升趋势。
3 结论
本研究以不同酒龄的市售丹泉洞藏酒为研究对象，采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS技术解析丹泉酒中的挥发性风味物质，共鉴定出11类共342种化合物，其中酯类化合物种类最为丰富。进一步研究发现，白酒中的挥发性化合物种类随着贮存时间的延长而不断增加，酯类、吡嗪类和萜烯类化合物表现尤为明显。层次聚类分析结果表明，癸酸乙酯、己酸乙酯等中链脂肪酸是高酒龄丹泉洞藏酒的特征挥发性风味物质。
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