酸马奶,也称为策格或koumiss,是由乳酸菌和酵母菌共同发酵鲜马奶得到的乳白色略带黄色的低乙醇含量发酵乳[1]。在发酵过程中,酸马奶的化学成分和风味发生了显著变化,维生素含量增加,香气更为浓郁,口感清爽[2-3]。此外,还生成了许多具有医疗保健价值的代谢产物,如细菌素、外泌体、脂肪酸、有机酸、胞外多糖和生物活性肽等。这些物质有助于促进调节肠胃环境、降血脂、降胆固醇、抗衰老、抗癌,并对结核病、慢性胃炎和腹泻具有辅助治疗作用[4-8]。
关于酸马奶的发酵工艺,传统方法是将新鲜马奶倒入木桶中,加入发酵“引子”并不断搅拌,发酵时间通常为1~3 d[9]。近年来,研究者们对酸马奶的发酵工艺进行了优化。张亚南等[10]以乳酸菌活菌数为考察指标,得出最优发酵温度为32 ℃,发酵时间为48 h。胜利[11]从传统乳制品中分离出乳酸菌和酵母菌,确定了最佳发酵条件为30 ℃和48 h。然而,相较于成熟的酸牛奶工业生产来说,酸马奶48 h的发酵时间较长,对于工业生产中的产品控制具有风险。较长的发酵时间已经成为制约酸马奶产业发展的瓶颈。由于乳酸菌与酵母菌的最适生长温度不同,选择适宜的变温发酵工艺在缩短发酵时间上仍有待研究。丁艺雪等[12]的研究表明,采用菌种最适温度发酵可以提高菌种含量,与吴霓[13]采用41 ℃发酵凝乳降温至37 ℃直到发酵终点,干酪乳杆菌活菌数明显增加相同,之后,赵续咏[14]的研究表明变温发酵相比恒温发酵能显著提高产品品质。
因而为了减少总的发酵时间,本研究采用新鲜马乳为原料,利用瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)和马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)对马奶进行变温发酵制备酸马奶。以感官评分为响应值,采用单因素试验和响应面试验优化酸马奶的发酵工艺参数。并测定相关理化指标、微生物指标、挥发性风味物质,为酸马奶的产业化生产提供一定的理论基础。
新鲜马奶:购于新疆南山公司;瑞士乳杆菌MX6、马克思克鲁维酵母菌ML25:本实验室从传统酸马奶中分离。
MRS液体培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extracts peptone glucose,YPD)液体培养基:环凯微生物科技有限公司。
DK-8D三孔电热恒温水槽:上海一恒科技有限公司;GC-2014C气相色谱(gas chromatography,GC)仪、安捷伦7890B-7000D三重四级杆串联质谱(triple quadrupole tandem mass spectrometer,MS/MS)[配电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI)及Xcalibur4.2数据处理系统]:安捷伦科技有限公司;SW-CJ-2F净化工作台:苏州安泰空气技术有限公司;PHS-2FpH计:上海仪电科学仪器股份有限公司;HPX-9162MBR电热恒温培养箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;TGL-20bR离心机:上海安亭科学仪器厂;LDZX-50L高压灭菌器:上海申安医疗器械厂。
1.3.1 酸马奶变温发酵工艺流程及操作要点
鲜马奶(150 mL)→巴氏杀菌(68 ℃杀菌30 min)→冷却→接种(瑞士乳杆菌MX6与马克思克鲁维酵母菌ML25按1∶1接种,总接种量4%)→37 ℃初发酵6 h→变温(28 ℃)发酵30 h→酸马奶成品
1.3.2 酸马奶变温发酵工艺优化单因素试验
通过单因素试验分别考察总接种量(2%、4%、6%、8%、10%)、瑞士乳杆菌MX6与马克思克鲁维酵母ML25接种比例(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、初发酵温度(33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃)、初发酵时间(2 h、4 h、6 h、8 h、10 h)和变温发酵时间(26 h、28 h、30 h、32 h、34 h)对酸马奶感官评分的影响,试验平行进行3次。每次试验重复3次,结果取平均值。
1.3.3 酸马奶变温发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上,选取接种量(A)、乳酸菌与酵母菌接种比例(B)、初发酵温度(C)和变温发酵时间(D)为影响因素,以酸马奶的感官评分(Y)为响应值,采用Box-Behnken响应面法对酸马奶发酵条件进行优化,试验因素与水平见表1。
表1 酸马奶变温发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for optimization of variable temperature fermentation process of koumiss
水平 A 接种量/%D 变温发酵时间/h-1 B 乳酸菌与酵母菌接种比例C 初发酵温度/℃01 246 1∶1 1∶2 1∶3 35 37 39 28 30 32
1.3.4 测定方法
蛋白质含量的测定:参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法;脂肪含量的测定:参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法;酸度的测定:参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》中酚酞指示剂法进行测定;酒精度的测定:参照GB5009.225—2023《食品安全国家标准酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》中的气相色谱法;pH值的测定:参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》
大肠杆菌:按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定;沙门氏菌:按照GB4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》测定;金黄色葡萄球菌:按照GB 4789.10—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》中MPN计数法测定;霉菌、酵母菌:按照GB4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》中霉菌和酵母平板计数法测定;乳酸菌:按照GB4789.35—2023《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》测定。
挥发性风味物质的测定:参照郭建华等[15]的方法稍作修改,在20 mL顶空采样瓶中加入酸马奶样品10 mL,3.0 g NaCl和30 μL 125 mg/L 3-辛醇(内标),混合均匀,55 ℃平衡30 min。将萃取纤维伸入顶部空间,55 ℃萃取30 min。萃取结束后,将萃取纤维头插入GC-MS的进样口,在DB-WAX柱(60 mm×0.25 mm,0.25 μm)上测定挥发性化合物,在25 ℃条件下不分流解吸5 min。升温程序为40 ℃保持5 min,3 ℃/min升温至200 ℃,6 ℃/min升温至250 ℃,载气为高纯氦气(He)。电离方式为电子电离(electron ionization,EI源);电子能量70 eV;离子源温度220 ℃;质量扫描范围20~500 m/z;发射电流100 μA。定性定量方法:利用GC-MS工作站软件Xcalibur4.2与美国国家标准与技术研究院(national institute of standards and technology,NCBI)数据库,自动识别并检索各组分的质谱数据,结合质谱裂解规律,通过匹配度>80%进行筛选定性;采用内标法进行定量。
感官评价:参考DBS15/013—2019《食品安全地方标准蒙古族传统乳制品策格(酸马奶)》并加以修改。选择10名从事相关专业的老师和学生,从产品香气、组织状态、色泽、滋味与口感4个方面对发酵的酸马奶进行感官评分,取10人的平均分,满分100分,酸马奶的感官评价标准见表2。
表2 酸马奶感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of koumiss
项目评价标准得分/分香气(40分)组织状态(15分)色泽(15分)滋味与口感(30分)有特征风味,香味醇厚,酸味适中特征风味差,香味稍淡,酸味明显无特征风味,酸味明显组织均匀细腻,无乳清析出和沉淀物稍有乳清析出,有少量沉淀物乳清析出严重,有大量沉淀物色泽均匀,呈乳白色色泽较均匀,呈白色色泽不均匀,色泽灰暗口感顺滑,优良,无酸涩味口感较好,酸涩味淡口感粗糙,有明显酸涩味28~40 14~27≤13 10~15 5~94≤4 10~15 5~94≤4 20~30 10~19≤9
1.3.5 数据处理
本试验数据分析采用WPS2021、OriginPro2021、Adobe lllustrator2022和Design Expert.V8.0.6软件进行数据分析处理。
2.1.1 不同接种量对酸马奶感官评分的影响
不同接种量对酸马奶感官评分的影响见图1。由图1可知,随着接种量的增加,酸马奶感官评分呈先上升后下降的趋势。当接种量为2%时,由于菌种含量少,微生物适宜新的环境需要较长的时间,因此发酵缓慢,感官评分较低;接种量为4%时,酸马奶的感官评分最高为92分;当接种量>4%之后,菌种含量增加,发酵迅速,酵母菌发酵生成的乙醇抑制了乳酸菌的生长,同时二者之间还存在着营养竞争的关系,对感官影响很大。综合考虑,选择最佳接种量为4%。
图1 不同接种量对酸马奶感官评分的影响
Fig.1 Effect of different inoculum on the sensory score of koumiss
2.1.2 不同乳酸菌与酵母菌接种比例对酸马奶感官评分的影响
酸马奶中的风味物质的产生是由乳酸菌与酵母菌进行生长代谢产生的,不同的菌种比例会使代谢途径有所变化,使得产生的风味物质具有差异。不同接种比例对酸马奶感官评分的影响如图2所示。由图2可知,随着酵母菌占比的增加,酸马奶的感官评分呈先上升后下降的趋势;当瑞士乳杆菌MX6与马克思克鲁维酵母ML接种比例为1∶2时,酸马奶的感官评分最高为92分;当乳酸菌占比继续增加时,感官评分一直在下降,尤其是接种比例为3∶1时,可能是由于风味物质由脂类代谢以及蛋白质水解等不同代谢途径生成,然而乳酸菌对蛋白质以及脂肪的水解能力弱,且一部分需要利用酵母菌的代谢产物进行转化如乙醛[16],因而不利于风味的产生;其次乳酸菌产生的一些化合物如苯乳酸等也会抑制酵母菌的生长[17]。综合考虑,选择瑞士乳杆菌与马克思克鲁维酵母最佳接种比例为1∶2。
图2 不同乳酸菌与酵母菌接种比例对酸马奶感官评分的影响
Fig.2 Effect of different inoculation ratio of lactic acid bacteria and yeast on the sensory score of koumiss
2.1.3 不同初发酵温度对酸马奶感官评分的影响
由图3可知,随着初发酵温度的升高,酸马奶的感官评分呈先上升后下降的趋势;在初发酵温度为37 ℃时,酸马奶的感官评分最高为93分;原因可能是当发酵温度过低时,乳酸菌生长缓慢,产酸能力下降,产品风味不足;而发酵温度过高,乳酸菌菌种含量降低,同样使得发酵缓慢。综合考虑,选择最佳初发酵温度为37 ℃。
图3 不同初发酵温度对酸马奶感官评分的影响
Fig.3 Effect of different initial fermentation temperature on the sensory score of koumiss
2.1.4 不同初发酵时间对酸马奶感官评分的影响
由图4可知,随着初发酵时间的延长,酸马奶的感官评分呈先上升后下降的趋势;当在37 ℃发酵2~4 h时,由于乳酸菌发酵时间短,不能为酵母菌提供适宜的pH条件,酵母菌也不能充分利用产品中的蛋白质、脂肪等物质[18]。同时,初发酵时间短许多代谢产物尚未形成。初发酵6 h时,酸马奶的感官评分最高为92分;继续延长初发酵时间,又使得酸马奶酸度过高,抑制酵母菌的生长。综合考虑,选择最佳初发酵时间为6 h。
图4 不同初发酵时间对酸马奶感官评分的影响
Fig.4 Effect of different initial fermentation time on the sensory score of koumiss
2.1.5 不同变温发酵时间对酸马奶感官评分的影响
由图5可知,随着变温发酵时间的延长,酸马奶的感官评分呈先上升后下降的趋势;当变温发酵时间为26 h、28 h时,因发酵时间短,产品pH值高,酵母菌尚未完全发酵,产品风味差;随着变温发酵时间延长,产品pH降低,乙醇含量增加,在变温发酵30 h时酸马奶的感官评分最高为93分;当变温发酵时间达到32 h、34 h时,发酵过度乳酸菌与酵母菌生长受到抑制,同时酸度过高,产品适口性差,感官评分不高。综合考虑,选择最佳变温发酵时间为30 h。
图5 不同变温发酵时间对酸马奶感官评分的影响
Fig.5 Effect of different variable temperature fermentation time on the sensory score of koumiss
2.2.1 响应面试验设计结果与方差分析
酸马奶变温发酵工艺优化响应面试验设计及结果见表3,方差分析见表4。
表3 酸马奶变温发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for optimization of variable temperature fermentation process of koumiss
试验号ABCDY 感官评分/分1234597891 0-1 1-1-1-1 10000-0000-11-0000-1-1 11-1-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 11-110000-1100000000-11-110000-1-1 11-11-1-1 11000000000 110000-11-1100000000-1-1 1100000 11000000000 1100000 69.1 82.6 74.1 68.2 70.3 79.3 68.6 72.4 71.5 79.9 69.1 74.5 65.1 68.7 83.5 69.1 72.4 69.6 76.3 80.4 76.8 69.1 67.8 71.1 90.1 92.3 92.5 92.5 92.6
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
变异来源 平方和 自由度 均方F 值P 值显著性模型14 ABCDA B AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 2 088.95 42.94 50.43 178.64 45.63 94.06 11.60 2.25 81.00 30.25 6.76 408.25 749.01 577.22 661.14 11111111111111 149.21 42.94 50.43 178.64 45.63 94.06 11.60 2.25 81.00 30.25 6.76 408.25 749.01 577.22 661.14 58.95 16.97 19.92 70.58 0.35 37.17 4.70 0.89 32.00 11.95 2.67 161.30 295.93 228.06 261.22<0.000 1 0.001 0 0.000 5<0.000 1 0.000 8<0.000 1 0.047 8 0.361 7<0.000 1 0.003 8 0.124 5<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1*************************
续表
注:“**”表示对结果影响极显著(P<0.01);“*”表示对结果影响显著(P<0.05)。
变异来源 平方和 自由度 均方F 值P 值显著性残差失拟项纯误差总和35.43 30.87 4.56 2 124.39 14 10 4 28 2.53 3.09 1.14 2.710.174 7
利用Design-Expert8.06软件对表3中的数据进行多元二次回归拟合,获得响应值感官评分(Y)的回归模型方程式为:
由表4可知,该模型极显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P>0.05),说明模型准确、可靠。决定系数R2为0.983 3,校正决定系数R2Adj为0.966 6,表明该方程误差小,试验的准确性高,可以很好的预测各因素对酸马奶感官评分的影响。由F检验可以得到各影响因素对酸马奶的感官评分影响强弱大小为:初发酵温度>乳酸菌与酵母菌接种比例>接种量>变温发酵时间。其中A、B、C、D、AB、BC、BD以及A2、B2、C2对感官评分的影响极显著(P<0.01),交互项AC对感官评分影响显著(P<0.05)。
2.2.2 Box-Behnken响应面分析交互作用
响应曲面图的陡峭程度与等高线的形状均能反映变量的影响程度。具体来说,陡峭的响应曲面图意味着该变量对感官评分的影响较大,而形状接近椭圆的等高线也表明相应变量间的交互作用较强。由图6可知,初发酵温度与接种比例的交互作用(BC)、接种量与乳酸菌与酵母菌接种比例的交互作用(AB)以及初发酵温度与变温发酵时间交互作用(BD)的响应曲面坡度最为陡峭,且等高线呈现椭圆形,表明AB、BC、BD对酸马奶的感官评分影响显著(P<0.05)。相对而言,接种量与接种比例的交互作用(AC)对应的响应曲面较为平缓,且等高线相对疏松并呈圆形,表明AC对酸马奶的感官评分影响较小,这与表4方差分析结果一致。
图6 各因素间交互作用对酸马奶感官评分影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory score of koumiss
2.2.3 优化工艺验证试验
采用Design expert 8.0.6软件预测得到理想的变温发酵条件为接种量4.45%、接种比例1∶1.9、初发酵温度37.45 ℃、变温发酵时间29.95 h,此时得到的酸马奶感官评分预测值为92.9分。考虑到实验室条件以及实际过程操作的可实施性,将最佳变温发酵条件修正为接种量4%、乳酸菌与酵母菌接种比例1∶2、初发酵温度37 ℃、变温发酵时间30 h,在此条件下进行3次平行试验,得到酸马奶感官评分平均值为92.8分,与预测值相差不大。值得注意的是,该工艺总发酵时间为36 h,相比于主流发酵工艺的48 h,完成了对发酵时间缩短的优化。
由表5可知,优化后的酸马奶符合DBS15/013—2019《食品安全地方标准蒙古族传统乳制品策格(酸马奶)》标准规定,瑞士乳杆菌MX6的活菌数为(4.56±0.55)×109 CFU/mL、马克思克鲁维酵母菌ML25活菌数为(3.27±0.13)×107 CFU/mL,与孙春玲等[19-20]关于酸马奶活菌数研究相比偏高,也从侧面印证了丁艺雪等[12]研究发现变温发酵使活菌数增加的观点。
表5 酸马奶的理化及微生物指标
Table 5 Physicochemical and microbiological indexes of koumiss
项目标准测定值蛋白质/(g·100 g-1)脂肪/(g·100 g-1)酸度/°T酒精度/%pH值大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌/(CFU·mL-1)霉菌/(CFU·mL-1)乳酸菌活菌数/(CFU·mL-1)酵母菌活菌数/(CFU·mL-1)≥1.6≥0.6≥85 0.5~2.5≤4.5 0/25 mL≤30≥1×106≥1×104 1.75±0.04 1.42±0.11 121.5±4.7 1.4±0.26 4.12±0.02未检出0(4.56±0.55)×109(3.27±0.13)×107
由表6可知,变温发酵酸马奶共检测出29种挥发性风味物质,包括酯类物质17种占总含量的86.31%,醇类物质4种占总含量的4.76%、酸类物质6种占总含量的8.9%,醛酮类物质2种占总含量的0.04%。酯类物质是由马乳中的乳脂肪分解产生的短链脂肪酸及中长链脂肪酸与乳糖的酒精发酵或氨基酸代谢产生的伯醇及仲醇发生酯化反应产生[21],其中辛酸乙酯的含量最高,这与杜晓敏等[22]在酸马奶发酵过程中对挥发性风味物质的研究一致。其次为乙酸苯乙酯与癸酸乙酯,均为酸马奶关键性风味物质,且对酸马奶的风味有修饰作用。此外,酯类由于其低感觉阈值特性,因而不可或缺,并且其所携带的香气有效降低了酸马奶中由脂肪酸和胺类物质产生的刺激与苦涩味道[23],对整体风味有显著影响。醇类物质也是酸马奶中主要的风味物质,适宜的醇类物质可以赋予酸马奶良好风味。在醇类物质中,苯乙醇含量最高,苯乙醇是由酵母菌Ehrlich反应的转氨与脱羧代谢转化而来[24],具有清甜的玫瑰花香[25]。酸类物质含量最高的为正癸酸和辛酸,其中正癸酸、辛酸等都是中长链脂肪酸,是由脂肪与游离的脂肪酸降解形成。刘梅森等[26]认为辛酸与癸酸可以很好的反应乳制品的风味,辛酸与癸酸含量越高奶香味越浓厚。特别是辛酸[27],在酸马奶独特风味的形成中起到了关键作用,同时也体现了独特的保健功能,如调节肠胃消化不良。正是这些复杂的化合物赋予了酸马奶独特且良好的风味特征。
表6 酸马奶挥发性风味物质组分及含量
Table 6 Components and contents of volatile flavor substances in koumiss
序号CAS号化合物含量/(μg·kg-1)1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 106-32-1 103-45-7 110-38-3 67233-91-4 106-33-2 123-66-0 123-29-5 624-13-5 124-06-1 2035-99-6 6290-37-5 110-42-9 2438-20-2 106-30-9 2306-91-4 705-86-2 5461-06-3 60-12-8 111-70-6 68526-83-0 543-49-7 334-48-5 124-07-2 14436-32-9 143-07-7 503-74-2 116-53-0 66-25-1 821-55-6辛酸乙酯乙酸苯乙酯癸酸乙酯9-癸酸乙酯月桂酸乙酯己酸乙酯壬酸乙酯辛酸丙酯十四酸乙酯正辛酸异戊酯己酸苯乙酯癸酸甲酯辛酸2-甲基丁酯庚酸乙酯癸酸异戊酯δ-癸内酯正辛酸异丁酯苯乙醇正庚醇2-乙基己醇2-庚醇正癸酸辛酸9-癸烯酸月桂酸异戊酸2-甲基丁酸正己醛2-壬酮7 950.79±330.50 5 542.69±213.40 3 875.36±86.20 2 744.85±67.27 331.34±56.17 234.77±24.31 91.17±14.25 51.22±3.29 36.71±6.69 31.30±7.24 20.12±4.40 10.77±2.21 8.23±4.10 7.15±0.80 3.18±0.14 1.15±0.22 56.25±2.79 1 145.69±74.61 8.57±0.43 1.72±0.33 0.15±0.01 1 147.44±43.32 779.15±23.94 143.25±10.67 72.00±14.48 9.56±1.28 13.34±3.86 7.80±1.90 2.24±0.25
本研究针对酸马奶的变温发酵工艺进行了深入探究。通过单因素试验与响应面分析法优化得到酸马奶的最佳变温发酵工艺:接种量为4%、接种比例为1∶2、初发酵温度为37 ℃、初发酵时间6 h、变温发酵时间为30 h。总发酵时间相对于主流的发酵时间该工艺缩短12 h。在此条件下,酸马奶的感官评分为92.8分、蛋白质为(1.75±0.04)g/100 g、脂肪为(1.42±0.11)g/100 g、酸度为(121.5±4.7)°T、酒精度为(1.4±0.26)%vol、瑞士乳杆菌MX6的活菌数为(4.56±0.55)×109 CFU/mL、马克思克鲁维酵母菌ML25活菌数为(3.27±0.13)×107 CFU/mL。通过气相色谱-质谱联用技术,共检测出29种挥发性风味物质。这些结果不仅证明显著缩短了传统酸马奶的发酵时间,而且为其产业化生产提供了坚实的理论基础。
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Optimization of variable temperature fermentation process of koumiss and its quality analysis