酒糟是固态白酒生产酿造过程中的主要副产物[1]，2022年我国白酒糟产量已超过2 000万t[2]。白酒糟产量大、含水率高、储存易腐败，并会产生霉菌毒素[3]，酒糟处理成为限制白酒企业快速发展的瓶颈问题。酒糟含有大量的多糖、蛋白质[4]、脂类和其他具有高化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）和生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）的有机物质，如不能被有效利用而丢弃，则成为高浓度环境污染物[5]，同时造成极大的浪费。传统的处理方式以直接堆积和焚烧为主，会对空气、土壤和水源造成二次污染[6]。因此，对酒糟进行资源化利用有利于环境保护和白酒行业发展。目前，酒糟的资源化利用有生物有机肥[7]、清洁燃料[8-9]、动物饲料[10]及食用菌培养基[11]生产、生物活性肽[12]提取等途径。
酒糟中含有氮、磷、钾等，制作生物有机肥具有很大的潜力[13]。席晓黎等[14]研究表明，施用酒糟发酵有机肥可提高白菜的产量和品质，同时可以增加土壤有机质含量，改良土壤酸度。此外，也有研究表明酒用高粱种植过程中施用酒糟有机肥能使高粱产量、农艺性状、养分吸收量和品质优于化学肥料[15]。生物有机肥是一种将功能菌株与有机肥相结合，兼具菌株特定功效与有机肥优点的新型生物肥料[16]。利用白酒酒糟作为有机肥的制作原料[17]是近年来的研究热点。王璐[18]利用地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌和蛋白酶等制备成复合菌剂接入汾酒酒糟中制备生物有机肥，可促进高粱作物生长。周莲[19]以酱香型白酒酒糟为主要原料，接种高温菌株地衣芽孢杆菌、产色高温单孢菌、微小根毛霉、嗜热蓝状菌、黑曲霉和肿梗根毛霉制备的生物有机肥可达到国家生物有机肥标准。依照“双碳”理念[20-21]和循环经济的发展，将筛选的功能微生物应用于酒糟的腐熟和生物有机肥的制备，使酒糟转化为特定功能的生物有机肥，对于酒糟的利用具有重要意义。
本研究利用实验室前期筛的具有降解纤维素功能的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B2[22]、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）A5[23]发酵酒糟制备有机肥，再将固氮功能菌褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）N1、解磷功能菌路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）P1和分散泛菌（Pantoea dispersa）P2[24]接至腐熟结束的有机肥中制备生物有机肥，探究制备的生物有机肥对种子发芽和高粱出苗的作用效果，判断生物有机肥品质。旨在为酒糟资源化利用和酒糟发酵生产生物有机肥提供理论依据和新的研究思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
酱香型白酒酒糟（A、B）：贵州省茅台酒厂循环经济产业有限公司；工厂有机肥：茅台循环产投公司；路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）P1、分散泛菌（Pantoea dispersa）P2、褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）N1：筛选自贵州茅台酒厂高粱种植地土壤；地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）A5、菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B2：实验室保藏。
1.1.2 试剂
甘露醇、蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、琼脂（均为分析纯或生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；钙镁磷肥：湖北禹辉化工有限公司。
1.1.3 培养基
阿须贝固氮菌培养基（Ashby）：MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 0.2 g，甘露醇10.0 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO3 5.0 g，去离子水1 L，115 ℃灭菌20 min[25]。
无机磷液体培养基：葡萄糖10.0 g、（NH4）2SO4 0.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、Fe2O4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、Ca3（PO4）2 5.0 g，去离子水1 L，115 ℃灭菌20 min[26]。
营养肉汤（nutrient broth，NB）培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、NaCl 5.0 g，去离子水1 L，121 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
ZQP-75G台式全温振荡培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；K1160全自动凯氏定氮仪：济南千司生物技术有限公司；BMJ-250B-Z恒温培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DRZ-3DAS箱式电阻炉：龙口市电炉制造厂；LDZF-50L-I高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SWCJ-LFD超净工作台：苏州市金净净化设备科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 理化及微生物指标检测
水分：参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》测定；灰分：参照GB5009.4—2016《食品中灰分的测定》测定；脂肪：参照GB5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中索氏抽提法测定；淀粉：参照DB34 T 2264—2014《固态发酵酒醅分析方法》中葡萄糖标准溶液反滴定法测定；有机质：参照NY/T 525—2021《有机肥料》中重铬酸钾容量法进行有机质含量测定；总氮、蛋白质：参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法测定；pH：采用pH计测定；温度：采用不锈钢温度计测定；电导率：采用电导率测定仪测定；有效活菌数：参照NY 884—2012《生物有机肥》测定。
1.3.2 功能菌剂的制备
分别挑取活化后的纤维素降解菌枯草芽孢杆菌B2、地衣芽孢杆菌A5单菌落接种于营养肉汤培养基，解磷菌路氏肠杆菌P1、分散泛菌P2单菌落接种于无机磷液体培养基，固氮菌褐球固氮菌N1单菌落接种于阿须贝固氮菌培养基中进行一级扩培，在37 ℃、160 r/min条件下培养48 h，获得一级扩培种子液。将一级扩培的菌液按照1%的接种量接至卡氏罐液体培养基中，通入无菌空气，37 ℃培养48 h得到功能菌剂，其活菌数为1×1012 CFU/mL。
1.3.3 酒糟有机肥的制备
分别取酒糟质量分数5%的纤维素降解菌剂A5、B2（1∶1）混匀后接种至A酒糟，作为处理组1，接种至B酒糟中，作为处理组2。以不加菌剂的A酒糟、B酒糟作为对照组1（CK1）和对照组2（CK2）。将酒糟质量分数的1%钙镁磷肥添加于所有实验组中，用于调节pH，将其进行堆积发酵，堆肥升温期间，定期适量补水，使堆肥水分含量保持在45%～55%，每隔3 d翻一次堆，增加发酵堆与空气的接触面积和空气流通，使发酵堆升温。堆肥高温期间（温度＞50 ℃），加快翻堆频率，每隔1 d翻一次堆。当发酵堆颜色完全变深，温度下降至常温，发芽指数＞70%时，表示堆体已完成腐熟，停止堆积发酵。将堆肥完成的酒糟有机肥进行摊平，降低水分至15%～20%含量后进行装袋，即为酒糟有机肥成品。堆积发酵期间，从第3天开始，每隔3 d测定水分、温度、pH、发芽指数等相关指标变化。将堆肥完成的有机肥与工厂有机肥进行指标对比，评价有机肥作用效果。
1.3.4 生物有机肥的制备
将酒糟有机肥质量分数5%固氮菌N1和解磷菌P1、P2功能菌剂混合后分别加入1.3.3制备的处理组1酒糟有机肥和处理组2酒糟有机肥中，得到1号生物有机肥和2号生物有机肥。装袋封存，置于阴凉通风处进行保存。
1.3.5 种子发芽试验
参照NY/T 525—2021《有机肥料》，采用种子发芽试验评价生物有机肥发芽效果，以发芽率、发芽指数为评价指标，其计算公式如下：
式中：A1为有机肥料的浸提液培养的种子中发芽粒数占总种子粒数的百分比，%；A2为有机肥料的浸提液培养的全部种子的平均根长数，mm；B1为水培养的种子中发芽粒数占放入总种子粒数的百分比，%；B2为水培养的全部种子的平均根长数值，mm。
1.3.6 高粱出苗试验
参照赵佳等[7]的方法，采用盆栽试验方法进行高粱出苗试验，白天温度为16～28 ℃，湿度为60%～70%；在露天放置，定期浇水管理，自然日光培养条件下进行。以贵阳市花溪区养牛村附近黄土壤为基质，选取均一度好的“红缨子”高粱种子作为试验种子，不额外添加任何肥料，不添加生物有机肥作为对照组，以1号生物有机肥添加量（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）对高粱苗株高、茎粗的影响，观察高粱苗的生长变化。
1.3.7 数据分析
数据采用Excel 2019进行统计分析，用Origin 2018软件作图。
2 结果与分析
2.1 酒糟理化指标分析
酒糟理化指标检测结果见表1。由表1可知，两种酒糟样品水分含量均较高，在50%左右。A酒糟的淀粉、脂肪和蛋白质含量（分别为15.26%、2.60%、9.91%）均高于B酒糟（10.51%、1.91%、7.95%），但二者均可以为微生物提供良好的碳源和氮源[27]。两种酒糟的pH（3.64～3.70）和发芽指数（1.08～3.58）均较低，不适宜直接当作肥料进行使用，其原因可能是过量的氢离子具有毒害根系作用，且在过酸环境下，大部分微生物难以生存[28]，因此需要将酒糟进行适当的酸度调节，发酵至腐熟才对作物无害。
表1 酒糟A和酒糟B理化指标检测结果
Table 1 Detection results of physical and chemical indicators of distiller's grains A and B
酒糟编号水分/%灰分/%pH值淀粉/%脂肪/%蛋白质/%AB 48.40 53.11 3.03 3.78 3.64 3.70 15.26 10.51 2.60 1.91 9.91 7.95
2.2 堆肥过程中酒糟有机肥水分、温度及pH变化
2.2.1 堆肥过程中水分含量的变化
酒糟有机肥堆肥过程中酒糟有机肥水分含量的变化见图1。由图1可知，同种酒糟有机肥处理组和对照组水分含量变化趋势基本相同，当发酵时间为3～30 d时，CK1及处理组1的水分含量总体呈波动下降趋势；当发酵至第30天时水分含量较低，分别为39.42%、42.76%；发酵时间为30～36 d时，水分增长较快，当发酵至第36天时水分含量最高，分别为66.56%和58.59%；发酵时间＞36 d时，水分含量有所下降。当发酵时间为0～12 d时，CK2及处理组2的水分含量呈快速下降趋势；当发酵至第12天时水分含量最低，分别为39.01%、38.01%，当发酵时间为12～21 d时，水分含量迅速增长；当发酵至第18天时水分含量最高，分别达到56.58%和60.98%；发酵时间＞21 d时，水分含量呈先下降后上升再下降的趋势。由此可知，不同的酒糟在堆肥过程中水分含量变化存在差异，可能是因为酒糟B透气性更高，水分蒸发更快。堆肥水分含量的多少，直接影响好氧堆肥反应速度的快慢，影响堆肥的质量，甚至关系到好氧堆肥工艺的成败[19]。因此，添加纤维素降解菌剂对堆体水分变化趋势没有影响，堆积过程中需要适量补水，并定期翻堆，保持堆体的透气性。
图1 酒糟有机肥堆肥过程中水分含量的变化
Fig.1 Changes of moisture contents in distillers' grains organic fertilizer during composting process
2.2.2 堆肥过程中温度的变化
酒糟有机肥堆肥过程中酒糟有机肥温度的变化见图2。由图2可知，同种酒糟有机肥处理组和对照组温度变化趋势基本相同。当发酵时间为3～33 d时，CK1及处理组1的温度整体呈先上升后下降的趋势；当发酵时间为3～40 d时，温度最高，分别为65.2 ℃、63.9 ℃；当发酵时间＞40 d时，温度呈先上升后下降趋势；当发酵时间为60 d时，达到常温，堆积结束。当发酵时间为0～18 d时，CK2及处理组2的温度整体呈上升趋势；发酵时间为18～21 d时，温度均＞70 ℃；当发酵时间＞21 d时，温度呈先上升后下降的趋势。结合水分含量结果，第21天后水分含量总体呈下降趋势，说明堆体温度与水分含量有关，水分蒸发能带走一部分堆体热量，起到调节堆体温度的作用[19]。温度也与翻堆频率相关，适当的翻堆次数影响着堆肥的透气性和温度，通气程度直接影响着好氧微生物的生长[29]。由此推知，B酒糟的堆肥比A酒糟的堆肥温度更高，是因为B酒糟的堆肥透气性更好，微生物活动更为旺盛。
图2 酒糟有机肥堆肥过程中温度的变化
Fig.2 Changes of temperature of distillers' grains organic fertilizer during composting process
堆肥前期（0～21 d），微生物在利用酒糟中的营养物质进行生长代谢，在生长代谢过程中产生热量，使得堆肥温度上升[19]。处理组1和CK1使用的A酒糟因其材质紧密、黏性大原因，导致透气性差，CK1和处理组1最高温度在65 ℃左右。而处理组2和CK2使用的B酒糟因其材质疏松，透气性好，CK2和处理组2最高温度能达到75 ℃左右，因此，整个堆肥过程中堆体温度与水分含量、微生物活动、翻堆频率、物料材质息息相关，这与前人研究结果一致[30]。纤维素降解菌的加入在堆肥前期能加快堆肥温度的升高，但对堆肥的整体温度变化趋势没有明显影响。
2.2.3 堆肥过程中pH的变化
酒糟有机肥堆肥过程中酒糟有机肥pH的变化见图3。由图3可知，酒糟有机肥处理组和对照组pH变化趋势基本相同。当发酵时间为3～15 d时，CK1及处理组1的pH值呈快速上升趋势；当发酵时间为15～42 d时，pH呈缓慢增加趋势，pH维持在7.5～8.5；当发酵时间为42～48 d时，pH较高（8.51～8.72）；发酵时间＞42 d后pH有所下降。当发酵时间为0～12 d时，CK2及处理组2的pH值呈快速上升趋势；当发酵时间为12～30 d内，pH呈缓慢增加趋势，pH维持在7.75～8.25；发酵时间为33～36 d后，pH较高（8.54～8.58），随后pH有所下降。结果表明，酒糟通过堆积处理，可以提高pH。堆积过程中pH过高的原因可能是由于在堆肥过程中，水分含量较高时会导致堆肥空气流通性差，微生物进行无氧呼吸将堆体内的营养物质转化为有机酸，同时随着堆肥有氧发酵翻堆过后，有机酸被微生物利用而大量减少，通过脱氨基作用产生大量的氨气释放到堆体中，导致堆肥整体pH值升高[31]。堆积后期随着水分含量的降低，pH也下降至正常范围。由试验可知，水分含量和通气性是影响pH变化的重要因素，水分含量过高，会导致堆肥空气流通性差，从而使得pH上升，因此，通过合理控制水分和翻堆频率方式可以使得堆肥pH值处于正常范围。
图3 酒糟有机肥堆肥过程中pH值的变化
Fig.3 Changes of pH values of distillers' grains organic fertilizer during composting process
2.2.4 堆肥过程中发芽指数变化
发芽指数（GI）被认为是评价堆肥腐熟度最有说服力的指标[19]，目前已被大量应用于堆肥腐熟特性研究当中。酒糟有机肥堆肥过程中发芽指数的变化见图4。
图4 酒糟有机肥堆肥过程中发芽指数的变化
Fig.4 Changes of germination indexes of distillers' grains organic fertilizer during composting process
由图4可知，在发酵时间为0～36 d时，CK1和处理组1发芽指数变化不明显；发酵时间在36～45 d时，发芽指数快速上升；第45天时发芽指数分别为70.83%和78.05%（在NY/T 525—2021《有机肥料》中规定发芽指数需＞70%）；发酵时间＞45 d，发芽指数缓慢增加，且处理组1发芽指数明显高于CK1。在发酵时间为0～21 d时，CK2和处理组2发芽指数变化不明显；发酵时间在21～39 d时，发芽指数快速上升，处理组2发芽指数明显高于CK2；第39天时分别为78.16%和83.92%；发酵时间＞39 d。发芽指数有所下降，当发酵结束时，处理组1、处理组2的发芽指数分别为97.72%、79.86%，均高于CK组，说明纤维素降解菌的加入能提高酒糟有机肥的发芽指数，提高酒糟腐熟程度。在堆积过程中发芽指数增加是由于堆肥过程中微生物的生化活动可以将酒糟中一些不稳定的、不适合利用的有机物质转变为可利用的、稳定的物质[32]。因此，在酒糟堆肥腐熟过程中微生物起到重要作用。
2.3 生物有机肥理化指标检测结果
参考NY 884—2012《生物有机肥》要求，生物有机肥水分≤30.0%，pH为5.5～8.5，有机质含量≥40.0%。由表2可知，1号和2号生物有机肥水分分别为25.92%、28.83%（均＜30%）。2种生物有机肥的pH分别为7.88和8.06（均在5.5～8.5之间），酒糟A和酒糟B的pH分别由最开始的3.64、3.70（酸性状态）升高至7.88、8.06（弱碱性状态）。2种生物有机肥的有机质分别为62.75%～67.92%（均＞40%），可能是堆积过程中有机物在微生物的作用下转化为有机质[33]，供作物吸收利用，且有机质含量丰富，可为作物提供丰富的有机质源，由以上数据可知生物有机肥具有良好的品质。
表2 生物有机肥理化指标检测结果
Table 2 Detection results of physicochemical indicators of bio-organic fertilizers
样品水分/%pH值 电导率/（ms·cm-1）溶解性固体总量/（mg·L-1）含氮量/%有机质/%1号生物有机肥2号生物有机肥25.92 28.83 7.88 8.06 3.21 2.93 1 579.00 1 429.00 5.28 4.93 62.75 67.92
由表3可知，1号和2号生物有机肥中菌株N1有效活菌数分别为1.80×1011 CFU/g、8.33×1010 CFU/g，菌株P1的有效活菌数分别为1.37×1013 CFU/g、2.38×1013 CFU/g，菌株P2的有效活菌数分别为2.00×1010 CFU/g、4.33×1010 CFU/g。因此，1号和2号生物有机肥的所有种类有效活菌数均＞0.20×109 CFU/g。试验结果表明，2种生物有机肥均满足NY 884—2012《生物有机肥》有效活菌数技术指标要求。
表3 生物有机肥的有效活菌数
Table 3 Effective viable bacteria number of bio-organic fertilizer CFU/g
菌株N1菌株P1菌株P2 1号生物有机肥2号生物有机肥1.80×1011 8.33×1010 1.37×1013 2.38×1013 2.00×1010 4.33×1010
2.4 酒糟有机肥及生物有机肥对种子发芽的影响
酒糟有机肥及生物有机肥的发芽效果见图5。由图5可知，处理组1、2有机肥发芽率分别为98.63%、90.64%，发芽指数分别为97.72%、79.86%；1号生物有机肥、2号生物有机肥提取液的发芽率分别为100%、95%，其发芽指数分别为82.99%和90.40%。分析原因可能是生物有机肥的微生物对土壤的改良，进而才能体现出生物有机肥的功效。发芽指数是代表腐熟程度的重要指标，生物有机肥功能特性可能无法在发芽指数上体现出优势。因此，酒糟在堆积过程中充分腐熟，制备的生物有机肥提高了种子发芽率，且对作物的生长可达到无害化。
图5 酒糟有机肥及生物有机肥的发芽效果
Fig.5 Germination effects of distillers' grains organic fertilizer and bio-organic fertilizer
2.5 生物有机肥对高粱生长的影响
由图6可知，所有处理组红缨子高粱苗株高、茎粗整体变化趋势相同，播种后的第2～5周，高粱苗株高、茎粗迅速增加，第5周后逐渐减慢。生物有机肥添加量10%～80%的实验组高粱苗的株高、茎粗生长情况均优于对照组，说明生物有机肥对红缨子高粱苗的生长具有积极的促进作用。其中，生物有机肥添加量40%的实验组高粱苗株高最高，为63.00 cm，生物有机肥添加量为60%的实验组茎粗最大，为5.50 mm。从高粱苗生长状态和节约生物有机肥的角度综合考虑，生物有机肥的最佳添加量为40%。
图6 1号生物有机肥添加量对高粱苗株高（a）、茎粗（b）的影响
Fig.6 Effect of No.1 bio-organic fertilizers addition on the height(a) and stem diameter (b) of sorghum seedlings
3 结论
本实验以A酒糟和B酒糟为原料，加入纤维素降解菌堆积制备酒糟有机肥（处理组1、处理组2），结果表明，纤维素降解菌的加入能提高酒糟有机肥的发芽指数，提高酒糟腐熟程度，但对堆积过程中水分、温度和pH变化趋势没有影响。处处理组1、处理组2酒糟有机肥的发芽率、发芽指数均较高，分别为98.63%、90.64%，97.72%、79.86%。1号、2号生物有机肥的发芽率分别为100%、95%，发芽指数分别为82.99%、90.40%，生物有机肥发芽率比酒糟有机肥均有所提高，其理化指标均符合相关行业标准。其理化指标均符合相关行业标准。与未添加生物有机肥相比，1号生物有机肥添加量为10%～80%时，其可促进高粱苗株的生长，其中，生物有机肥添加量为40%时，高粱苗株长势较好。
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