苹果（Malus pumila Mill），因其丰富的营养成分和对健康的益处而成为健康食品潮流中的佼佼者。随着现代食品加工技术的飞速发展，传统的苹果制品已经迈向了创新转型，开发出一系列增强消费者健康益处的新型苹果制品[1]。黑苹果是以新鲜苹果为原料，在控制高温（50～90 ℃）和相对湿度（50%～90%）条件下发酵而成的新型精制产品，不仅具有独特的外观、颜色、质地和口感，更具有极强益生功能，对促进健康和预防多种慢性疾病具有重要价值[2]。
高温益生菌发酵技术正迅速崛起，成为在食品工业和农业废弃物处理领域研究的新热点。诸多研究者通过利用该技术在菌种筛选、特性研究、工艺优化、产品质量提升以及关键问题的解决等方面取得了突破性进展。在菌种研究方面，高温益生菌的筛选和特性研究为该技术的发展奠定了基础。如蒋金辰等[3]在鱼菜共生系统中发现乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）L1在50 ℃高温下仍保持超过96.60%的高存活率。杨亚洁等[4]筛选耐受50 ℃高温的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）S3能高效提升热带地区青贮饲料的发酵水平。在工艺优化方面，颜晓钰等[5]通过响应面法优化的发酵条件为pH 7.0、2%葡萄糖、15‰盐度、6%接种量、温度50 ℃，成功将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌（Aneurinibacillusthermoaerophilus）的甘油产量显著提升至6.003%。张军燕等[6]从云烟卷烟中分离的高温地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）YYC4，在料液比1.0∶1.8（g∶mL）、发酵温度55 ℃、接种量107 CFU/g含水基质、相对湿度80%、发酵时间50 h、MgSO4质量分数0.12%固态发酵条件下，不仅显著提高了豆粕的可溶性蛋白和总蛋白含量，还有效降低了胰蛋白酶抑制剂含量。在产品质量提升方面，王新杰等[7]研究发现，与常规工程菌相比，60 ℃驯化的嗜高温混合菌株在乳酸生产过程中不仅显著提高了产量和纯度，还成功将餐厨垃圾减少了92.6%。侯宜芝[8]研究发现，在55 ℃的发酵温度下，高温菌株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）YYC4能够有效激活豆粕的抗氧化、降血压和抗癌等多种生理活性。尽管高温高湿技术在黑化的商业产品已展现出显著的抗氧化活性，特别是针对黑化红枣[9]和黑蒜[10]等相关产品的研究发现，与未发酵的同类产品相比，黑化红枣和黑蒜的总酚含量分别提高了19.50%～86.61%和4.64倍，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力分别提升了18.77%～217.05%和53.29%，但是该技术在苹果等其他领域的应用仍处于起步阶段，有待进一步开发。此外，目前市面上高温高湿黑化产品大多依赖于自然发酵，而采用耐高温混合益生菌菌株进行发酵的产品较为罕见。同时，针对耐高温菌株存活率低及生产工艺成熟度不足问题[11]，寻找有效的解决措施，以提升黑化产品的质量和生产效率，已成为行业发展的当务之急。
本研究以苹果为原料，采用发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）与嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles）混合发酵制备黑苹果，系统探究接种量、混菌比例、发酵温度和相对湿度对黑苹果的颜色参数、褐变程度、类黑精含量、总酚含量、DPPH自由基清除能力和铁离子还原/抗氧化能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）的影响。通过单因素试验和响应面试验，优化黑苹果发酵工艺，旨在提升黑苹果的营养价值和功能性，为其在食品工业中的应用和市场推广提供科学依据，同时为苹果的高值化利用开辟新途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
苹果（长富二号）：甘肃省静宁县。
发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles）：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 化学试剂
蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、丙酮、没食子酸标准品（纯度＞98%）、草酸、无水乙醇：无锡一鸣环保科技有限公司；甘油、醋酸钠、柠檬酸、硫酸镁、硫酸锰、吐温80、过硫酸钾、碳酸钠、硝酸钠、乙酸、盐酸、甲醇、过氧化氢、乙酸钠、邻苯三酚、水杨酸：山东隆汇化工有限公司；福林酚、芦丁标准品（纯度＞98%）、2,6-二氯靛酚、水溶性维生素E（Trolox）：美国Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定试剂盒、铁离子还原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定试剂盒：苏州梦犀生物医药科技有限公司。试验所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
MRS肉汤液体培养基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉10 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，醋酸钠5 g/L，硫酸镁0.1 g/L，柠檬酸2 g/L，吐温80 1 g/L，硫酸锰0.05 g/L，pH 6.2±0.2，蒸馏水1 000 mL。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
XJ-S-800Z恒温恒湿培养箱：上海欣佳立智设备有限公司；DGB-421色度仪：北京欧信胜科技有限公司；PHS-3E型数字pH计：青岛路扬环保科技有限公司；QZ77-104 电加热恒温干燥箱：郑州艾迪科技有限公司；HH-2恒温水浴锅：上海捷呈实验仪器有限公司；BL-2200H电子天平：北京亚欧德鹏科技有限公司；UV5100紫外可见分光光度计：上海赫尔普国际贸易有限公司；TGL-20M高速冷冻离心机：江苏讯迪仪器科技有限公司；Nicolet57000型傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）仪：美国Nicolet公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种活化
在无菌条件下，取保存在甘油中的发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌菌液涂抹于MRS固体培养基表面进行复苏培养，置于37 ℃条件下静置培养24 h。选择生长状态较好的单细胞，将其转移到MRS液体培养基中，并进行2～3轮的活化培养，备用。
1.3.2 黑苹果的制备
在发酵桶中将新鲜苹果清洗后，按照料液比4∶1（g∶mL）加入无菌水，接种发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例1∶1，接种量6%，37 ℃恒温条件下初次发酵24～48 h，然后在发酵温度56 ℃和相对湿度54%条件下，再次发酵60 d[2]，即得黑苹果。
1.3.3 黑苹果发酵工艺优化
（1）单因素试验
设置制备黑苹果的基础条件为接种量6%、发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例1∶1、相对湿度60%、发酵温度60 ℃，发酵时间60 d。分别考察接种量（2%、4%、6%、8%、10%（V/V））、发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）、相对湿度（50%、55%、60%、65%、70%）和发酵温度（50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）改变对黑苹果的颜色参数、褐变程度、类黑精含量、总酚含量以及抗氧化活性的影响。
（2）响应面试验
在单因素试验的基础上，选用接种量（A）、发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例（B）、相对湿度（C）和发酵温度（D）作为自变量，以黑苹果的类黑精含量（Y1）、DPPH自由基清除能力（Y2）和FRAP值（Y3）为响应值，进行Box-Behnken试验，响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation process optimization
水平 A 接种量/%D 发酵温度/℃-1 B 发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例C 相对湿度/%01 681 0 1∶2 1∶1 2∶1 50 55 60 50 55 60
1.3.4 分析检测
（1）颜色参数
采用色度仪测定样品的颜色参数：明亮度（L*值）、红绿度（a*值）和黄蓝度（b*值），进行5次平行测量[12]。色差（ΔE）值计算公式如下：
式中：L*值、a*值、b*值为黑苹果样品的颜色参数；L0值、a0值、b0值为鲜苹果颜色参数。
（2）褐变程度
褐变程度测定采用分光光度计法[13]：称取1 g干样，研磨，加入1mL蒸馏水，4℃、15000 r/min的条件下离心10 min。吸取500 μL上清液与2.5 mL蒸馏水混合，25 ℃保温10 min后，利用分光光度计在波长420 nm处测量吸光度值（A420 nm值），每次测量3次重复。A420nm值越大，表明褐变程度越高。
（3）类黑精含量
类黑精含量测定采用分光光度计法[14]。
类黑精标准曲线的绘制：葡萄糖与20种氨基酸等物质的量（0.05 mol）混合溶解于100 mL水中，冷冻干燥至恒质量后，放入提前预热好的烘箱中，100 ℃烘烤1 h后得到20种模型类黑精。将这20种模型类黑精在干燥器中冷却至室温后，转移到研钵中小心研磨成细粉。模型类黑精与黑苹果样品类黑精同时进行FT-IR测定，选择与黑苹果样品类黑精红外光谱图最为接近的模型类黑精作为定量的标品。将类黑精标品配制成不同质量浓度的水溶液（0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、5.0 g/L），以类黑精质量浓度（x）为横坐标，波长420 nm处的吸光度值（y）为纵坐标，绘制类黑精标准曲线，得到标准曲线回归方程为y=6.32x-0.094 3，相关系数R2=0.994 1。
黑苹果样品70 ℃烘箱过夜烘干至恒质量，粉碎并过筛（0.25 mm），称取粉末2 g用蒸馏水350 r/min搅拌均匀，10 ℃、8 000 r/min离心20 min，得到2 g/L的样品溶液，按标准曲线步骤进行测定，每次测量3次重复，类黑精含量（以干质量计）计算公式如下：
式中：C为标准曲线查得的类黑精含量，g/L；Vt为提取体积，mL；m为样品质量，g。
（4）总酚含量
取适量黑苹果样品粉碎，称取粉末2 g置于锥形瓶中，分别加入10 mL甲醇，超声20 min，滤过，滤渣再分别加入10 mL甲醇，超声10 min，滤过，合并滤液至25 mL容量瓶中，用适量甲醇定容至刻度，过0.22 μm微孔滤膜滤过，制备获得黑苹果样品提取液。
总酚含量测定采用分光光度计法[15-16]：将1 mL黑苹果样品提取液与1 mL福林酚试剂充分混合，25 ℃孵育10 min，加入7.5%的3 mL Na2CO3溶液和5 mL蒸馏水。将混合物转移至40 ℃水浴中放置20 min，利用分光光度计在波长765 nm处测量吸光度值，测定重复3次。
（5）抗氧化能力
DPPH自由基清除能力、铁离子还原/抗氧化能力（FRAP）分别采用DPPH自由基清除能力试剂盒、铁离子还原能力试剂盒按照试剂盒说明进行检测，结果均以μmol Trolox/g表示。
1.3.5 数据分析
采用Origin 2022和SPSS 26.0软件进行数据处理分析，采用Design-Expert 8.0.6.1软件进行试验设计。所有试验均重复3次。
2 结果与分析
2.1 黑苹果发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 接种量对黑苹果品质的影响
由图1可知，随着接种量在2%～10%范围内的增加，黑苹果色差（ΔE）值、褐变程度、类黑精含量、总酚含量、DPPH自由基清除能力和FRAP值均呈现先增加后降低的变化趋势。在接种量达到8%时，色差（ΔE）值达到最大（36.33），A420 nm值最高（1.13），类黑精含量升至152.40 g/kg。这些变化可能是因为适宜的接种量增强了益生菌活性，促进了酚类化合物在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的作用下发生氧化形成褐色物质，从而使苹果褐色加深。同时，适宜的接种量增加了合成类黑精的前体物质（氨基酸和糖类）的转化和聚合，类黑精含量的增加，伴随着色差（ΔE）值和A420 nm值的增加，反映出苹果褐变程度的增强[17]。接种量＞8%之后，色泽深度减缓，类黑精含量增长停滞，这可能与色素合成途径的饱和、关键酶的饱和或代谢途径的负反馈抑制有关。这与傅青[18]研究结果一致。
图1 不同接种量对黑苹果品质及抗氧化活性的影响
Fig.1 Effect of different inoculum on quality and antioxidant activities of black apple
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
接种量达到8%时，黑苹果的总酚含量、DPPH自由基清除能力和FRAP值最高，分别为9.53 mg/g、31.11μmolTrolox/g和31.57 μmol Trolox/g。这归因于益生菌释放的有机酸增强了细胞壁渗透性，促进了酚类化合物的释放，同时增强了抗氧化活性。然而，接种量＞8%之后，总酚含量和抗氧化活性均出现下降，接种量对酚类物质合成和抗氧化活性的正相关性及其在超过一定阈值后的抑制效应。这与RAZOLADÍAZMC等[19-20]研究结果一致。因此，选择最适接种量为8%。
2.1.2 混菌比例对黑苹果品质的影响
由图2可知，随着发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例在1∶3～3∶1范围内的变化，黑苹果色差（ΔE）值、褐变程度、类黑精含量、总酚含量、DPPH自由基清除能力和FRAP值均呈现先增加后降低的变化趋势。在发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例达到1∶1时，色差（ΔE）值达到最大（38.58），A420 nm值最高（1.12），类黑精含量升至168.58 g/kg，这些变化可能因为益生菌活性的增强，褐色物质大量合成，加深了苹果色泽。同时益生菌代谢活动和合成类黑精关键酶活性增强，促进类黑精含量的增加，伴随着色差（ΔE）值和A420nm值的增加，反映出苹果褐变程度的增强。当发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例在1∶1～3∶1时，色泽深度和类黑精含量液开始降低，可能是因为过高的接种比例影响了合成类黑精关键酶的活性或抑制了类黑精代谢途径。这与WRONKOWSKA M等[21]研究结果一致。
图2 不同发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例对黑苹果品质及抗氧化活性的影响
Fig.2 Effect of different Limosilactobacillus fermentum and Streptococcus thermophiles ratio on quality and antioxidant activities of black apple
当发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例达到1∶1时，黑苹果的总酚含量、DPPH自由基清除能力和FRAP值最高，分别为8.58 mg/g、35.46 μmol Trolox/g、30.05 μmol Trolox/g。适宜的接种比例可以促进益生菌的代谢作用，更有效地产生抗氧化物质，从而提升样品的抗氧化活性。当发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例超过1∶1时，黑苹果DPPH自由基清除能力和FRAP值开始降低，可能是因为益生菌的代谢活动开始受到抑制，或者代谢产物的积累抑制了抗氧化物质的活性。这与LIAO W等[22-23]研究结果相一致。因此，选择最适发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例为1∶1。
2.1.3 发酵温度对黑苹果品质的影响
由图3可知，随着发酵温度在50～70 ℃范围内的升高，黑苹果色差（ΔE）值、褐变程度、类黑精含量、总酚含量、DPPH自由基清除能力和FRAP值均呈现先增加后降低的变化趋势。在发酵温度为55 ℃时，色差（ΔE）值达到最大（32.03），A420 nm值最高（1.96），类黑精含量升至170.31 g/kg，这些变化可能因为适宜温度使得美拉德反应的速率增加，将酚类物质转化为聚合类黑素产物，从而加速了类黑精的生成，A420nm值与色差（ΔE）值均增加[24]。此外，适宜的温度可能还有助于稳定某些热敏感的前体物质，为类黑精的合成提供了更多的底物，导致食品的色泽加深和风味变化[25]。当发酵温度＞55 ℃之后，色泽深度和类黑精含量急剧降低，可能是由于温度过高导致色素合成途径受阻或类黑精的分解。
图3 不同发酵温度对黑苹果品质及抗氧化活性的影响
Fig.3 Effect of different fermentation temperature on quality and antioxidant activities of black apple
当发酵温度为55 ℃时，黑苹果的总酚含量、DPPH自由基清除能力和FRAP值最高，分别为8.97 mg/g、29.21 μmol Trolox/g、30.00 μmol Trolox/g。这可能是由于在此温度下益生菌代谢生成大量的抗氧化分子如多酚类化合物，这些化合物具备较强的自由基清除能力和还原力。当发酵温度＞55 ℃，总酚含量和抗氧化活性均出现下降，这可能是由于过高的温度对抗氧化物质的稳定性或合成路径产生了抑制效果。这与DORNOUSH J[26-27]研究结果类似。因此，选择最适发酵温度为55 ℃。
2.1.4 相对湿度对发酵苹果全果的品质影响
由图4可知，随着相对湿度在50%～70%范围内的增加，黑苹果色差（ΔE）值、褐变程度、类黑精含量、总酚含量、DPPH自由基清除能力和FRAP值均呈现先增加后降低的变化趋势。在相对湿度为55%时，色差（ΔE）值达到最大（27.37），A420 nm值最高（0.75），类黑精含量升至167.57 g/kg，这些变化可能因为湿度条件提升了益生菌的色素合成能力，增强了相关代谢途径，同时维持了类黑精关键酶的活性和稳定性。当相对湿度＞55%之后，色泽深度和类黑精含量急剧降低，过高的相对湿度导致类黑精的溶解度降低，或者促进了类黑精的降解反应。
图4 不同相对湿度对黑苹果品质及抗氧化活性的影响
Fig.4 Effect of different relative humidity on quality and antioxidant activities of black apple
当相对湿度为55%时，黑苹果总酚含量、DPPH自由基清除能力和FRAP值最高，分别为9.53mg/g、27.12μmolTrolox/g、30.55 μmol Trolox/g，这与陈炳等[28-29]的研究结果一致。在相对湿度增加的初期，样品质地变得软烂，从而释放出更多的酚羟基，导致总酚含量的快速上升，抗氧化活性也快速增加。当相对湿度＞55%之后，总酚含量和抗氧化活性均开始下降，可能因为过高的相对湿度影响细胞膜的透性，使得酚类物质的自身缩合反应速度超过了其降解速度，加速了总酚含量的降解，降低了抗氧化活性。因此，选择最适相对湿度为55%。
2.2 黑苹果发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面试验结果
在单因素试验的基础上，选择接种量（A）、发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例（B）、相对湿度（C）和发酵温度（D）为自变量，以黑苹果的类黑精含量（Y1）、DPPH自由基清除能力（Y2）和FRAP值（Y3）为响应值，Box-Behnken试验设计及结果见表2。
表2 发酵工艺优化Box-Benhnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiments for fermentation process optimization
试验号 A B C D Y1类黑精/（g·kg-1）Y2DPPH自由基清除能力/（μmol Trolox·g-1）Y2FRAP值/（μmol Trolox·g-1）1234567891 0-1 1-1-1-1 10000-0000-11-0000-1-1 11-1-1 11 12 13 11-110 1100000000-1 110000-1 110 168.35 164.82 174.03 153.00 172.01 179.86 180.05 175.51 166.78 157.41 170.09 161.77 180.18 31.26 31.37 31.96 29.82 31.46 30.57 31.86 31.46 31.99 31.08 32.06 32.57 28.13 28.55 28.32 28.60 28.50 28.41 27.00 27.75 28.47 28.48 28.00 29.19 29.27 27.68
续表
试验号 A B C D Y1类黑精/（g·kg-1）Y2DPPH自由基清除能力/（μmol Trolox·g-1）Y2FRAP值/（μmol Trolox·g-1）14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 000-1-1-1 11-11-1-1 11000000000 10000-11-0000000-1-1 1100000 11000000000 1100000 178.55 181.78 177.50 176.52 163.01 174.05 165.75 182.18 160.57 178.04 180.84 180.68 180.68 182.06 183.47 181.75 31.26 32.82 26.74 32.46 31.78 31.24 31.12 30.72 29.06 31.13 31.49 33.16 33.16 33.62 33.51 33.69 28.35 27.28 27.50 28.99 27.91 27.85 28.45 27.48 28.07 28.37 28.54 30.18 30.18 30.36 30.27 30.45
对表2试验数据通过Design-Expert 8.0.6软件进行多元回归分析，建立了类黑精含量（Y1）、DPPH自由基清除能力（Y2）和FRAP值（Y3）的回归模型，其二次多元回归方程式如下：
2.2.2 响应面试验方差分析
对表2数据进行方差分析，结果见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“NS”表示对结果影响不显著（P＞0.05），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源均方和（Y1/Y2/Y3）自由度均方（Y1/Y2/Y3）F 值（Y1/Y2/Y3）P 值（Y1/Y2/Y3）显著性（Y1/Y2/Y3）模型14 ABCDA B AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项误差总和1 997.51/67.61/25.08 341.97/0.87/0.12 79.36/2.17/0.29 1.42/0.75/0.54 62.98/2.70/1.44 76.56/1.27/4.225E-003 6.79/0.078/0.71 0.28/0.50/0.078 1.76/21.21/0.051 148.96/1.02/0.044 38.38/0.060/1.13 1 137.85/1.50/2.23 47.71/28.60/9.26 1.06/13.77/12.62 134.48/5.12/6.12 70.41/2.71/0.36 65.93/2.53/0.30 4.48/0.18/0.062 2 067.92/70.32/25.44 111111111111111 4 28.38/24.95/69.47 68.00/4.49/4.73 15.78/11.20/11.42 0.28/3.88/20.85 12.52/13.94/55.66 15.22/6.54/0.16 1.35/0.41/27.37 0.055/2.60/3.04 0.35/109.57/1.96 29.62/5.27/1.71 7.63/0.31/43.99 226.24/7.75/86.39 9.49/147.76/359.10 0.21/71.17/489.39 26.74/26.46/237.19＜0.000 1/＜0.000 1/＜0.000 1＜0.000 1/0.052 4/0.047 2 0.001 4/0.004 8/0.004 5 0.603 3/0.069 1/0.000 4 0.003 3/0.002 2/＜0.000 1 0.001 6/0.022 8/0.691 7 0.264 8/0.534 7/0.000 1 0.818 3/0.128 9/0.103 1 0.564 1/＜0.000 1/0.182 9＜0.000 1/0.037 6/0.212 0 0.015 3/0.586 4/＜0.000 1＜0.000 1/0.014 6/＜0.000 1 0.008 1/＜0.000 1/＜0.000 1 0.653 3/＜0.000 1/＜0.000 1 0.000 1/0.000 1/＜0.000 1**/**/****/NS/***/**/**NS/NS/****/**/****/*/NS NS/NS/**NS/NS/NS NS/**/NS**/*/NS*/NS/****/*/****/**/**NS/**/****/**/**10 4 28 142.68/4.83/1.79 341.97/0.87/0.12 79.36/2.17/0.29 1.42/0.75/0.54 62.98/2.70/1.44 76.56/1.27/4.225E-003 6.79/0.078/0.71 0.28/0.50/0.078 1.76/21.21/0.051 148.96/1.02/0.044 38.38/0.060/1.13 1137.85/1.50/2.23 47.71/28.60/9.26 1.06/13.77/12.62 134.48/5.12/6.12 5.03/0.19/0.026 6.59/0.25/0.030 1.12/0.045/0.016 5.89/5.60/1.92 0.051 2/0.055 7/0.277 4 NS/NS/NS
由表3可知，以类黑精含量为响应值的回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），而模型的决定系数R2为0.966 0，校正决定系数R2adj为0.931 9，这表明模型与试验数据的吻合程度较高，适用于生产实际中的预测。由F值可知，影响黑苹果类黑精含量的主要因素依次是接种量（A）＞发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例（B）＞发酵温度（D）＞相对湿度（C）。由P值可知，一次项A、B、D，交互项AB、BD，二次项A2、B2、D2对黑苹果类黑精含量影响极显著（P＜0.01）；交互项CD对黑苹果类黑精含量影响显著（P＜0.05）。
由表3可知，以DPPH自由基清除能力为响应值的回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），而模型的决定系数R2为0.961 5，校正决定系数R2adj为0.922 9，这表明模型与试验数据的吻合程度较高，适用于生产实际中的预测。由F值可知，影响黑苹果DPPH抗氧化活性的主要因素依次是发酵温度（D）＞发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例（B）＞接种量（A）＞相对湿度（C）。由P值可知，一次项B、D，交互项BC，二次项B2、C2、D2对黑苹果DPPH自由基清除能力影响极显著（P＜0.01）；交互项AB、BD，二次项A2对黑苹果DPPH自由基清除能力影响显著（P＜0.05）。
由表3可知，以FRAP值为响应值的回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），而模型的决定系数R2为0.985 7，校正决定系数R2adj为0.971 6，这表明模型与试验数据的吻合程度较高，适用于生产实际中的预测。由F值可知，影响黑苹果FRAP抗氧化活性的主要因素依次是发酵温度（D）＞相对湿度（C）＞发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例（B）＞接种量（A）。由P值可知，一次项B、C、D，交互项AC、CD，二次项A2、B2、C2、D2对黑苹果FRAP值影响极显著（P＜0.01）；一次项A对黑苹果FRAP值影响显著（P＜0.05）。
2.2.3 响应面分析
各因素交互作用对类黑精含量、DPPH自由基清除能力和FRAP值影响的响应面及等高线见图5。响应面的坡度越陡峭，等高线趋于椭圆形，表明两因素之间交互作用显著；响应面的坡度越平缓，等高线趋于圆形，表明两因素之间交互作用不显著。由图5可知，接种量与发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例（AB）、发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例与发酵温度（BD）交互作用对类黑精含量影响极显著（P＜0.01），相对湿度与发酵温度（CD）交互作用对类黑精含量影响显著（P＜0.05）；发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例与相对湿度（BC）交互作用对DPPH自由基清除能力影响极显著（P＜0.01），接种量与发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例（AB）、发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例与发酵温度（BD）交互作用对DPPH自由基清除能力影响显著（P＜0.05）；接种量与相对湿度（AC）、相对湿度与发酵温度（CD）交互作用对FRAP值影响极显著（P＜0.01）。这与方差分析结果一致。
图5 各因素交互作用对黑苹果类黑精含量、DPPH自由基清除能力和FRAP值影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on melanoidin contents, DPPH free radical scavenging ability and FRAP values of black apple
2.2.4 验证试验
由于类黑精含量对黑苹果品质及抗氧化活性影响很大，因此利用Design-Expert 8.0.6软件对以类黑精含量为响应值的模型回归方程求解，得到黑苹果发酵的最佳工艺条件为：发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例1.51∶1.00，混菌接种量7.52%，相对湿度54.33%，发酵温度55.54 ℃。在该条件下，预测黑苹果的类黑精含量为184.116 g/kg、DPPH自由基清除能力为33.65 μmol Trolox/g、FRAP值为30.4734 μmol Trolox/g。为了便于实际操作，调整黑苹果发酵工艺条件为：发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例1.5∶1.0，混菌接种量7.5%，相对湿度为54%，发酵温度为56 ℃。在此优化条件下，黑苹果类黑精含量实际值为189.64 g/kg、DPPH自由基清除能力实际值为34.24 μmol Trolox/g、FRAP实际值为31.09 μmol Trolox/g，与模型预测值之间误差值分别为3.00%、1.75%和2.02%，说明模型可靠，利用该模型优化黑苹果发酵工艺可行。相较于未发酵的新鲜苹果，黑苹果类黑精含量和DPPH自由基清除能力、FRAP值分别提高了8.87倍，4.15倍和6.41倍。
3 结论
本研究以苹果为原料，通过接种发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌的混合益生菌菌种制备黑苹果，通过单因素试验及响应面试验，确定黑苹果的最佳工艺为接种量7.5%，发酵粘液乳杆菌和嗜热链球菌比例1.5∶1.0、相对湿度54%、发酵温度56 ℃。在此优化条件下，黑苹果类黑精含量为189.64 g/kg、DPPH自由基清除能力为34.24 μmol Trolox/mL、FRAP值为31.09 μmol Trolox/mL，分别比未发酵的新鲜苹果提高了8.87倍、4.15倍和6.41倍，显著增强了黑苹果的类黑精含量及抗氧化活性，为生产具有高生物活性成分的苹果发酵产品提供了提供了科学依据，也为产业的创新发展提供了推动力。
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