贵州苗家米酒是采用当地的新鲜毛大丁草、地菍、猕猴桃叶、红豆杉果、山茶花叶及果等几十余种草本、藤本、木本植物，再辅以谷粉制曲后，与大米发酵蒸馏成的米酒[1]，草本花果不仅赋予酒体独特风味口感，还增添了酒中的草本活性成分，是一款无任何勾兑、添加的原生态米酒。
高脂血症（hyperlipidemia，HLP）是指血浆中总胆固醇（total cholesterol，TC）含量升高、三酰甘油含量（triacylglycerol，TG）升高或者两者同时升高引起的血脂代谢异常疾病[2]。高脂血症分为原发性和继发性两类，其中原发性与遗传缺陷有关，继发性与代谢性紊乱疾病、饮食习惯、生活方式等多种因素有关。高脂血症多见于中老年人，是诱发心脑血管疾病的重要因素之一，具有症状多样、涉及脏器多等特点[3]。近年来，随着国民经济的提高，人们的生活水平也在逐渐改善，饮食结构的摄入就是其中表现之一，饮食习惯不断转变，动物性食物的摄入量逐年上涨，导致脂肪摄入量的增加，高脂血症患病率呈逐年升高趋势，而且患病群体不断趋于年轻化[4-5]。高脂血症属于慢性疾病，早期无明显的临床症状，在长期影响身体健康的情况下，会诱发动脉粥样硬化、冠心病、肝硬化等多种疾病[6]。中医认为高脂血症是由于肝失疏泄、心气虚衰等原因造成血行不畅、脉道阻塞，时久则导致气滞血瘀，因此气滞血瘀型高脂血症多采用活血化瘀的基本治则[7]。酒，味辛，性温，可行气活血还能够预防心脑血管病，降血压、降血脂，一些养生酒具有降低血脂水平的效果[8]，如梁丽珍等[9]通过网络药理学方法研究发现，茗酿养生酒中的功能成分可多成分-多靶点-多途径影响高脂血症；钟赛薇等[10]研究发现，绿豆养生酒关键活性成分中的支链氨基酸和不饱和脂肪酸可通过影响甲状腺通路，发挥降低胆固醇、改善血脂的作用。近年来对米酒的研究主要集中于原辅料、发酵工艺、风味物质及产品品质的相关研究[11-14]，而对其功能成分影响高脂血症的作用机制鲜有报道。
本研究以前期酿造的苗家米酒为研究对象[15]，采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术对苗家米酒中挥发性活性成分进行检测，结合SwissADME数据库中的功能组分，得出相关功能组分集合，进一步联合网络药理学的方法，探讨苗家米酒中的功能成分集合在抗高脂血症方面的协同药效作用机制，为苗家米酒的科学配伍提供新的研究思路，同时为后续的动物实验提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苗家米酒：本实验室参照文献[15]酿造。
1.2 仪器与设备
7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪：DB-5MS色谱柱（30 mm×250 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司；202-3AB型电热恒温干燥箱：天津泰斯仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 苗家米酒挥发性活性成分分析
采用气相色谱-质谱法（GC-MS）技术对苗家米酒挥发性活性成分进行分析，具体参照文献[16]并做相应调整。
气相色谱条件：进样口温度为260 ℃；不分流进样；载气为高纯氦气（He），流速为1 mL/min；柱压为9.08 Psi；程序升温条件为初始温度60 ℃保持1 min，以12 ℃/min升温至200 ℃，以5 ℃/min升温至325 ℃；进样量为1.0 μL。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度250 ℃；传输线温度为280 ℃；溶剂延迟时间2 min；Scan扫描模式，质量范围为1～1 200 m/z，使用美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）谱图库进行检索分析，选择匹配度＞80%的峰，并结合相关文献进行定性。
1.3.2 苗家米酒挥发性活性成分的获取及其作用靶点预测
结合GC-MS检测结果，使用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库查询GC-MS鉴定的挥发性活性成分的Canonical SMILES号及其2D结构式，并利用Swiss ADME（http：//www.swissadme.ch）数据库对苗家米酒主要活性成分进一步筛选，主要依据胃肠道吸收（GI absorption）评分选择“high”及药物相似性（drug likeness）＞3个“yes”作为选择标准，将功能活性成分的Canonical SMILES号或2D结构式上传至Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库中，属性为“Homo sapiens”，按照Probability≥0筛选靶点，预测出苗家米酒中挥发性活性化成分作用靶点。
1.3.3 高脂血症疾病靶点预测及其与活性成分作用靶点交
集靶点的获取
在OMIM数据库、Drugbank数据库、DisGeNET数据库、GeneCards数据库（Relevance score＞1）中输入“Hyperlipidemia”或“Hyperlipoproteinemia”为关键词，检索与高脂血症有关的靶点，整合筛选去重后获得与高脂血症有关的作用靶点。使用Venny2.1.0在线绘图软件绘制韦恩图，获得苗家米酒活性成分作用靶点与高脂血症疾病靶点的交集靶点。
1.3.4“苗家米酒-成分-靶点”网络图的构建
使用Cytoscape3.9.1软件构建“苗家米酒-成分-靶点”网络图。将苗家米酒中的活性成分与56个交集靶点导入Cytoscape中，进行可视化分析。并使用Network Analysis分析工具计算各活性成分的节点连接度（Degree）值，筛选出连接度值排名靠前的核心活性成分。
1.3.5 蛋白质互作网络的构建
将交集靶点输入并上传至STRING（https：//string-db.org）数据库，将物种组织（Orgnisim）设置为人源（Homo sapiens），最低相互作用评分（minimum required interaction score）设置为0.4，下载蛋白质互作（protein protein interac tion，PPI）数据，并将分析结果以TSV格式导入Cytoscape 3.9.1软件中进行可视化，结果采用cyto Hubba插件中的Degree算法计算得到相关的前10的hub基因。
1.3.6 GO和KEGG通路富集分析
将交集靶点导入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）数据库中，进行基因本体论（gene ontology，GO）注释和京都基因与基因百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。GO富集分析涉及分子生物学功能（MolecularFunction，MF）、细胞学组分（CellularComponents，CC）、生物学过程（Biological Process，BP）3个模块。以P≤0.01为显著富集条件，将GO注释中每类排名前20的条目，以及KEGG通路分析中排名前20的通路，借助微生信在线平台（http：//www.bioinformatics.com.cn）进行气泡图可视化绘制和分析。
1.3.7 苗家米酒核心活性成分与关键靶点及通路的确定
将苗家米酒的所有活性成分、交集靶点及KEGG富集的前20条信号通路导入CytoScape 3.9.1软件中构建“苗家米酒-成分-靶点-通路-疾病”网络图，并根据网络拓扑学参数确定苗家养生米酒影响高脂血症的核心活性成分、关键靶点及主要通路。
2 结果与分析
2.1 苗家米酒挥发性活性成分GC-MS分析结果及作用靶点筛选
通过GC-MS法从苗家米酒样品中共检测出21种挥发性成分，进一步采用SwissADME数据库从中筛选得到13种主要挥发性活性成分进行网络药理学机制研究，结果见表1。
表1 苗家米酒主要挥发性活性成分筛选结果
Table 1 Screening results of main volatile active ingredients in Miaojia rice wine
编号 保留时间/min CAS 化合物J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 10.557 14.853 14.949 15.72 16.557 16.852 16.852 19.674 19.895 20.372 21.504 22.653 27.261 123-66-0 60-12-8 141-63-9 18829-56-6 106-32-1 488-05-1 3913-81-3 25152-83-4 6138-88-1 25152-84-5 20407-84-5 475-20-7 56114-62-6正己酸乙酯苯乙醇甲基五硅氧烷2-壬烯醛辛酸乙酯香薷酮反式-2-癸烯醛2.4-癸二烯醛去氢香薷酮反式-2,4-癸二烯醛反-2-十二烯醛长叶烯3,4-二羟基苯基二醇
由表1可知，13种主要挥发性活性成分包括酯类、醇类、酮类、醛类等。进一步通过SwissTargetPrediction数据库对13种主要挥发性活性成分对应的作用靶点进行预测，依据probability＞0结果共获得311个主要作用靶点。
2.2 高脂血症疾病靶点及其与活性成分作用靶点的交集靶点的获取
使用OMIM数据库、Drugbank数据库、DisGeNET数据库、GeneCards数据库（Relevance score＞1）输入“Hyper lipidemia”或“Hyperlipoproteinemia”为关键词，检索得到与高脂血症有关的靶点，整合筛选去重后共获得652个与高脂血症有关的疾病靶点，进一步使用Venny2.1.0在线绘图软件绘制苗家米酒活性成分作用靶点（311个）与高脂血症疾病靶点（652个）的Venn图，结果见图1。由图1可知，苗家米酒活性成分作用靶点与高脂血症疾病靶点共有56个交集靶点。
图1 苗家米酒活性成分作用靶点与高脂血症疾病靶点的韦恩图
Fig.1 Veen diagram of effect targets of active components in Miaojia rice wine and disease targets of hyperlipidemia
2.3 “苗家米酒-成分-靶点”网络图的构建及核心活性成分的筛选
将13种主要挥发性活性成分及56个交集靶点编写type、network文件后分别导入Cytoscape 3.9.1软件中，构建“苗家米酒-成分-靶点”网络图，结果见图2。在网络图中，用边表示活性成分与靶点之间的相互作用关系；用节点连接度值表示网络中和节点相连的路线的条数，与节点相连的边越多，节点的连接度值越高，连接度值高的节点为网络的核心节点。
图2 “苗家米酒-成分-靶点”网络图
Fig.2 Network diagram of "Miaojia rice wine-component-target"
由图2可知，“苗家米酒-成分-靶点”网络图中含有70个节点，146条边，其中节点连接度值排前4的活性成分为J13（3,4-二羟基苯基二醇）、J5（辛酸乙酯）、J1（正己酸乙酯）、J11（反-2-十二烯醛），连接度值分别为2.7、3.36、3.43、4.70，说明3,4-二羟基苯基二醇、辛酸乙酯、正己酸乙酯、反-2-十二烯醛等为成分网络的核心节点。除J6（香薷酮）、J9（去氢香薷酮）外，其余活性成分均能与多个靶点相连接，说明米酒可多成分、多靶点调节高脂血症。
2.4 蛋白质互作网络的构建及关键靶点的筛选
将56个交集靶点导入STRING数据库中，获取相互作用关系及PPI网络图，并采用Cytoscape 3.9.1软件进可视化分析，结果见图3。
图3 蛋白互作网络图（a）及其可视化分析图（b）
Fig.3 Network diagram (a) and visual analysis diagram (b) of protein-protein interaction
由图3a可知，获得56个节点，317条边，平均节点连接度值为11.3，平均局部聚类系数为0.599，P＜0.01，表明该交集靶点与随机相似靶点组合对比具有显著差异。图3b中以过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）为中心展开图形颜色越深、图形越大，靶点连接度值越高，说明其对应的节点在网络中越重要。利用cyto Hubba插件中的Degree值对节点进行关键靶点筛选并有序排列，结果发现，排名前10的靶点为PPARG、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、PPARA、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）、雌激素受体1（Estrogen receptor 1，ESR1）、表皮生长因子受体（epdermal growth factor receptor，EGFR）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）、维甲酸X受体α（retinoid X receptor alpha，RXRA）、核受体亚家族3，C组，成员1（nuclear receptor subfamily 3，group c，member 1，NR3C1）、血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1），说明这10个靶点是苗家米酒中活性成分影响高脂血症的关键靶点。过氧化物酶体增值物激活受体被誉为“脂肪感应器”，作为调节脂质代谢的关键因子及人类脂质代谢疾病的治疗靶点[17]。PPARG是核激素受体超家族的成员，对体内脂肪细胞分化和代谢调节的有重要意义，还是脂肪组织分化时所必需的[18]，主要参与能量代谢、脂肪生成与分化及葡萄糖稳态控制的整合。IL-6是与炎症相关的细胞因子，具有双向调节作用，适度IL-6的产生能防御细菌感染和治疗疾病，但过度的合成IL-6与疾病有关[19]，IL-6等炎症因子与高脂血症有着密切的联系[20]，梁玉佳等[21-22]通过试验研究证实IL-6基因具有改善高脂血症及调节血脂水平的作用。PPARG、IL-6均为促炎因子，而高脂血症能进一步发展为与炎症免疫反应、不同证型代谢综合征密切相关的动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）、代谢综合征（metabolic syndrome，MS）冠状动脉性心脏病和高脂血症性急性胰腺炎等疾病[23-24]。
2.5 GO和KEGG通路富集分析
将56个交集靶点利用DAVID在线工具进行GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析，结果发现，显著性P＜0.01的条目包括149个BP、58种MF、29类CC，根据这些条目的富集程度与显著性，分别筛选BP、CC、MF中P值从小到大排名前20的条目绘制气泡图；显著性P＜0.01的通路包括51条，筛选P值从小到大排名前20的通路绘制气泡图，结果见图4。由图4A～图4C可知，生物学过程（BP）主要涉及类固醇激素介导的信号通路、RNA聚合酶Ⅱ转录物的正调控促进剂、DNA正转录调控等；细胞组分（CC）主要涉及聚合酶Ⅱ转录因子复合体、细胞表面、整体膜的组成、细胞膜及细胞质等；分子功能（MF）主要涉及类固醇激素受体活性、蛋白质结合及核受体结合等。由图4D可知，与苗家米酒影响高脂血症密切相关的通路主要涉及过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、癌症通路、脂肪细胞因子信号通路等，PPARs是由脂肪酸及其衍生物激活的核激素受体，有3种表型（PPARα、PPARβ/δ和PPARγ），其中，PPARα/γ的激动剂对血脂异常和糖尿病研究具有重要意义[25-26]，此外，PPARγ还可选择性地促进脂肪组织的脂质摄取和脂肪生成，降低循环甘油三酯和游离脂肪酸的含量调节脂代谢紊乱[27-28]；而PPARα则通过调节脂蛋白脂肪酶（lipoprtein lipase，LPL）、载脂蛋白基因、脂肪酸转运和氧化基因以及磷脂转运蛋白（phospholipid transprotein，PLTP）和线粒体3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶（mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGCS2）的表达来刺激脂肪酸分解代谢以此来调节高脂血症[29]。
图4 苗家米酒活性成分影响高脂血症靶点GO富集（A～C）及KEGG通路富集（D）分析气泡图
Fig.4 Bubble diagram of GO enrichment (A-C) and KEGG pathway enrichment (D) analysis of targets for active components in Miaojia rice wine affect hyperlipidemia
2.6 苗家米酒核心活性成分与关键靶点及通路的确定
为了初步阐明苗家米酒影响高脂血症的潜在机制，将苗家米酒所筛选的活性成分、交集靶点及KEGG信号通路富集分析的前20条信号通路导入CytoScape构建“苗家米酒-成分-靶点-通路-疾病”网络图并进行可视化分析，结果见图5。由图5可知，“苗家米酒-成分-靶点-通路-疾病”网络图中包括90个节点和283条边，平均节点连接度值为6.3；苗家米酒中的J13（3，4-二羟基苯基二醇）、J5（辛酸乙酯）、J1（正己酸乙酯）、J11（反-2-十二烯醛）连接度值较高。连接度值排名靠前的靶点和通路在上述GO和KEGG富集分析结果中也靠前，作用于PPARG、IL6、PPARA、HMGCR、ESR1等关键靶点，进而调控过氧化物酶体增殖物激活受体、癌症通路、脂肪细胞因子信号通路等通路。此外，56个关键靶点无孤立靶点，均能与主要通路产生连接，进一步说明苗家米酒可能是通过关键靶点作用于这些通路发挥调节高脂血症作用，多个潜在靶点与多种活性成分相互作用、与多条信号通路产生联系，提示苗家米酒是通过多成分、多靶点、多通路调节方式发挥调节高脂血症作用。
图5 “苗家米酒-成分-靶点-通路-疾病”网络图
Fig.5 Network diagram of "Miaojia rice wine-component-targetpathway-disease"
3 结论
本研究基于GC-MS法和网络药理学的研究方法研究贵州苗家米酒调节高血脂相关的作用机制。结果表明，贵州苗家米酒可能以3,4-二羟基苯基二醇、辛酸乙酯、正己酸乙酯、反-2-十二烯醛等为关键活性成分，作用于过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、癌症通路、脂肪细胞因子信号通路等通路上的过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、白细胞介素-6（IL-6）和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）等关键靶点发挥调节高脂血症的作用，初步揭示了苗家米酒中挥发性功能成分影响高脂血症具有多成分-多靶点-多途径的作用特点，为进一步通过动物模型研究苗家米酒对高脂血症及安全性或养生方面影响奠定理论基础。
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