苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)在葡萄酒的酿造过程中起着重要作用。MLF不仅可以降低葡萄酒的酸涩感和粗糙感,使之柔和、圆润,还可提高葡萄酒的感官质量和生物稳定性[1-3]。MLF虽然在适宜条件下可以自发启动,但自然触发MLF很难进行有效调控,风险较高,不但增加了酒体中腐败微生物生长的机率,而且不能保证产品品质的稳定性[4-5]。所以,目前工艺上采用添加乳酸菌的方法来降低风险。在众多乳酸菌菌株中,酒酒球菌(Oenococcus oeni)表现出优良的酿酒风味特性,对提升葡萄酒品质有着积极作用,因此商业乳酸菌主要以酒酒球菌为主导[6]。
传统的MLF接种方式主要以酒精发酵(alcohol fermentation,AF)结束后的顺序接种为主[7]。顺序接种在AF结束后进行并需要控制较低的发酵温度,所以这种接种方式整体发酵时间较长。在酒精发酵的同时接种乳酸菌进行混合发酵,被称为前期接种[8]。普遍认为同时接种乳酸菌对酒精含量的逐渐适应,以及葡萄汁中更高的有效性营养,可使MLF更容易成功[9]。酵母和乳酸菌共同接种被证明是最省时的接种方案,同时,不同接种时期会导致葡萄酒中释放出不同的香气化合物,改变葡萄酒的品质特征[10]。研究发现,采用共同接种方式酿造的葡萄酒中,成熟水果香气更加突出[11-13]。目前的研究主要关注酒精发酵时同时接种和酒精发酵完成后的顺序接种乳酸菌,然而,目前仍然缺乏对于更具体的接种时间对葡萄酒品质的影响的研究。目前的研究主要集中在前期接种和酒精发酵完成后的顺序接种,早期接种可极大程度地缩短MLF时间,且所酿酒品的果香、新鲜度和颜色更为艳丽且口感更好。后期接种会延长MLF时间且容易造成腐败微生物生长的风险。但葡萄醪会获得充分浸渍,有利于得到颜色艳丽、结构更饱满的葡萄酒[14]。然而,目前仍然缺乏对于更具体的接种时期对葡萄酒品质的影响研究。
该研究对酒精发酵前、发酵中和发酵结束后接种两种商业乳酸菌对贺兰山东麓‘赤霞珠’干红葡萄酒品质的影响进行了研究分析,旨在为MLF工艺的优化提供理论基础和技术支持。
1.1.1 材料
乳酸菌:酒酒球菌(Oenococcus oeni)LACTOENO8 B7 DIRECT(编号为LA):法国拉氟德公司;酒酒球菌OENO1(编号为OE):法国诺盟公司。
酿酒辅料:活性干酵母‘卓越XR’、Vinozym vintage FCE果胶酶(14 000 U/g)、偏重亚硫酸钾:法国诺盟公司。
葡萄原料:‘赤霞珠’葡萄为2023年10月5日采自宁夏贺兰山东麓产区,还原糖含量256.98 g/L,可滴定酸含量(以酒石酸计)为5.50 g/L,pH为3.95,卫生状态良好。
1.1.2 化学试剂
4-甲基-2-戊醇(色谱纯):日本TCI公司;氢氧化钠、葡萄糖、氯化钠等(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司;苹果酸、L-乳酸(均为色谱纯):北京索莱宝科技有限公司;50%乙酸、正丁醇(均为分析纯):徐州天鸿化工贸易有限公司;溴酚蓝(分析纯):上海罗恩试剂公司。
2,3-丁二醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、2,3-丁二酮、正丁醇、1-癸醇、异戊酸、异丁酸、癸酸、辛酸、癸醛、异丁醇、香茅醇、芳樟醇、异丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、异戊酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸、己酸异戊酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、己酸、乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、乳酸乙酯、苯乙醛、棕榈酸乙酯、壬酸乙酯、苯乙醇、辛酸甲酯、异戊醇标准品(均为色谱纯):美国Sigma-Aldrich公司。
TU-1901型分光光度计:北京普析通用仪器有限公司;雷磁pHS-3C型pH计:上海仪电科学仪器股份有限公司;ME104E电子天平:瑞士METTLE公司;7890B-7000D气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)仪、DB-WAX色谱柱(60 m×250 μm,0.25μm)、Agilent1220型高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪、1220InfinityII液相色谱仪、ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm):美国Agilent公司;PAL3自动进样器:瑞士CTC公司。
1.3.1 葡萄酒发酵工艺流程及操作要点
除梗破碎、入罐:对采收后的‘赤霞珠’葡萄进行人工筛选,使用除梗破碎机进行除梗、破碎处理。然后按照实验要求将葡萄醪分装至10 L玻璃广口瓶(装至8 L刻度线处)。
添加辅料:加入SO2和果胶酶,添加量均为30 mg/L,室温浸渍1 d。
酒精发酵:接种‘卓越XR’活性干酵母200 mg/L,发酵温度控制在24~26 ℃,每天人工压冒2次,用普通比重计对AF进行监测,当比重达到0.995时酒精发酵结束。
苹果酸-乳酸发酵(MLF):按照AF的不同时期(前期、中期、后期)分别接种10 mg/L的商业乳酸菌(LA、OE),进行MLF。其中当AF结束后进行皮渣分离,将自流汁和压榨汁混合并继续进行MLF。MLF过程中对苹果酸的含量进行监测,当苹果酸质量浓度<0.2 g/L时(MLF结束),添加60 mg/L的SO2。终止发酵后,将葡萄酒静置澄清、装瓶贮存,并对发酵结束后的酒样进行分析检测。
苹果酸-乳酸发酵的进程监测:葡萄酒接种乳酸菌后,进行MLF。采用有机酸层析的方法[15],对MLF进程进行监测。当滤纸上的苹果酸斑点减少,乳酸斑点增多时,说明葡萄酒开始MLF,当苹果酸斑点消失,说明MLF结束,并使用高效液相色谱法对葡萄酒的苹果酸含量进行检测。
1.3.2 乳酸菌的接种时期
接种时期:本试验选择了酒精发酵的3个时期分别接种乳酸菌LA和OE。前期:接种活性干酵母24 h后接种乳酸菌;中期:葡萄醪的比重下降至1.040时接种乳酸菌;后期:酒精发酵结束后,即皮渣分离后接种乳酸菌。
1.3.3 葡萄酒理化指标测定
残糖、总酸、挥发酸、酒精度等理化指标:参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定;pH的测定:采用pH计测定;色度、色调:参照文献[16]的方法,葡萄酒样品经过0.45 μm水系滤膜过滤,处理后将葡萄酒样品置于1.0 cm比色皿中,分别在波长420 nm、520 nm、620 nm测定酒样的吸光度值,分别计为A420 nm、A520 nm、A620 nm;计算公式如下:
色度值=A420nm+A520nm+A620nm
色调值=A420nm/A520nm。
苹果酸测定:参照文献[17]的方法,采用HPLC法测定苹果酸的含量。取2 mL酒样至10 mL容量瓶后,加水定容,并经0.22 μm水系滤膜过滤后进行苹果酸的测定。
1.3.4 葡萄酒中挥发性香气成分提取检测
参照李亚军等[18]的方法用顶空固相微萃取(head spacesolid phase microextraction,HS-SPME)气质联用技术对酒样中的香气成分进行提取分析。
萃取条件:称取1.5 g在105~110 ℃烘干的NaCl于20 mL的顶空瓶中,加入5 mL酒样和10 μL 4-甲基-2-戊醇内标(1.008 3 g/L),将顶空瓶置于自动进样器中,萃取头老化温度为250 ℃,样品振摇速度250 r/min,40 ℃预热5 min,40 ℃萃取30 min。
气相色谱条件:采用不分流进样模式,进样口以240 ℃解吸10 min,载气高纯氦气(He)(纯度≥99.999%),流速1 mL/min,色谱柱起始柱温40 ℃,恒温5 min,以3 ℃/min升温至97 ℃,保持7 min,以2 ℃/min升温至120 ℃,再以3 ℃/min升温至150 ℃,最后以8 ℃/min升温至220 ℃,保持10 min。
质谱条件:电子电离(electronic ionization,EI)源,电子能量70 eV,MS传输线温度为235 ℃,离子源温度230 ℃,扫描模式Scan,扫描范围35~300 m/z。
1.3.5 挥发性香气成分的定性定量分析及香气活性值计算
参照郎咏梅等[17,19]的方法利用HS-SPME-GC-MS技术对酒样中的挥发性香气成分进行定性分析。定量方法通过内标-标准曲线法进行定量(4-甲基-2-戊醇为内标1.008 3 g/L),有标准品的香气物质用其标准曲线进行定量分析,没有标准品的香气物质,通过与其化学结构相似的物质进行定量分析。
对香气物质的气味活性值(odor activity value,OAV)进行分析,当葡萄酒中某种香气物质的OAV>1时,表示该物质的浓度足以在葡萄酒中产生感知的香味,对于葡萄酒的香气特征有显著贡献;而当OAV<1时,表示该物质的浓度不足以在葡萄酒中产生感知的香味,对葡萄酒的香气特征贡献较小,OAV的计算公式如下:
1.3.6 葡萄酒感官评价
感官品评小组由宁夏大学葡萄与葡萄酒学专业学生组成,共19名。感官品评采取国际化标准化组织的相关标准ISO 8589—1988参考《感官分析 试验室设计的总则》在标准品酒室使用标准品酒杯(GB/T ISO 3591—1997《感官分析 葡萄酒、果酒品评杯使用要求》)进行品鉴。并参照国际葡萄与葡萄酒组织(international vine and wine organization,OIV)制定的百分制评价体系的评分标准对葡萄酒品质进行打分[20],感官评分依据见表1。分别从外观(澄清度、色调、色度)、香气(纯正度、浓郁度、优雅度、协调度)、口感(纯正度、浓郁度、结构协调度、香气持久度、余味)和典型性共14个方面打分,满分100分。
表1 葡萄酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of wine
项目 优 很好 好 一般 较差 差 很差外观香气口感澄清度色调色度纯正度浓郁度优雅度协调度纯正度浓郁度结构协调度香气持久度余味典型性66668886888868 55557775777757 44446664666646 33335553555535 22224442444424 11112221222212 00000000000000
1.3.7 数据统计与处理
使用Microsoft Office 2016软件进行数据统计分析;IBM SPSS Statistics 23.0软件对酒样中理化指标和香气物质进行单因素方差分析(one-way analysis of variance,One-way ANOVA),Duncan法进行事后多重比较,差异显著(P<0.05);使用Origin 2022绘制堆积柱状图。
不同时期接种MLF结束时间和苹果酸的含量测定结果见表2。由表2可知,苹果酸含量都<0.2 g/L,均已完成MLF。但不同接种时期,发酵完成所需的时间各不相同。两种乳酸菌在前期接种时完成MLF所需时间接近12~14 d,平均为13 d;中期接种16~18 d,平均为17 d;后期接种25~27 d,平均为26 d。与中期、后期接种方式相比,选择前期接种乳酸菌,可快速启动MLF,缩短发酵周期。在相同时期接种乳酸菌,接种OE的酒样MLF时间更长。
表2 不同时期接种乳酸菌葡萄酒苹果酸-乳酸发酵结束时间
Table 2 End time of malolactic fermentation of wines inoculated with lactic acid bacteria at different periods
注:同行不同小写字母代表不同时期接种LA的差异显著(P<0.05),同
行不同大写字母代表不同时期接种OE的差异显著(P<0.05)。下同。
处理 拉氟德(LA)前期 中期诺盟(OE)前期 中期 后期总发酵时间/d MLF结束苹果酸含量/(g·L-1)12 0.09±0.01a 16 0.14±0.01a后期27 0.13±0.02a 14 0.11±0.01A 18 0.13±0.01A 25 0.13±0.02A
不同时期接种两种乳酸菌发酵的‘赤霞珠’干红葡萄酒的基本理化指标测定结果见表3。由表3可知,各理化指标均符合GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求。不同时期接种的酒样完成发酵后,与葡萄汁相比,MLF后的葡萄酒总酸降低,降低幅度达8.2%~18%,这是由于MLF的生物降酸作用,从而使葡萄酒的总酸含量降低[21]。但各处理之间总酸没有显著差异(P>0.05);前、中、后期接种得到的酒样挥发酸的均值分别为0.46 g/L、0.40 g/L、0.35 g/L,具有显著差异(P<0.05),其中前期接种最高,这可能是因为在高糖的条件下,乳酸菌可能会利用糖异型发酵代谢产生乙酸,从而增加挥发酸的含量[22]。两种乳酸菌在不同时期接种,色度、色调、残糖、酒精度均无显著性差异(P>0.05)。虽然接种LA在不同处理酒样中pH之间存在显著性差异(P<0.05),但接种OE在不同处理酒样中pH之间无显著性差异(P>0.05)。该研究表明,不同时期接种两种乳酸菌对‘赤霞珠’干红葡萄酒的基本理化指标影响较小。
表3 ‘赤霞珠’干红葡萄酒基本理化指标分析结果
Table 3 Analysis results of basic physicochemical indexes of 'Cabernet Sauvignon' dry red wine
理化指标挥发酸/(g·L-1)总酸/(g·L-1)pH值酒精度/%vol色度色调残糖/(g·L-1)前期0.47±0.02a 4.81±0.17a 3.78±0.01a 13.43±0.27a 7.73±1.06a 0.78±0.02a 1.68±0.01a LA中期 前期后期0.40±0.06ab 5.05±0.19a 3.63±0.01c 13.83±0.74a 6.72±0.38a 0.78±0.00a 1.60±0.05a 0.37±0.05b 4.87±0.00a 3.75±0.01b 13.46±0.30a 6.76±0.11a 0.79±0.01a 1.70±0.13a 0.45±0.03A 4.62±0.00A 3.76±0.03A 13.69±0.18A 8.66±1.32A 0.74±0.00A 1.69±0.11A OE中期 后期0.40±0.05AB 4.52±0.10A 3.75±0.03A 13.80±0.64A 7.35±1.57A 0.74±0.01A 1.65±0.09A 0.33±0.06B 4.74±0.25A 3.75±0.01A 13.91±0.06A 7.95±1.10A 0.72±0.04A 1.67±0.11A
2.3.1‘赤霞珠’干红葡萄酒的香气物质总量
对不同试验处理酒样的香气物质进行检测,不同时期接种的‘赤霞珠’干红葡萄酒中香气的含量见图1。
图1 ‘赤霞珠’干红葡萄酒香气物质总量
Fig.1 Total contents of aroma substances in 'Cabernet Sauvignon'dry red wine
由图1可知,不同时期接种发酵的酒样产生的香气物质含量均存在差异。前期接种LA的香气物质总量为1 182.46 mg/L、中期为921.93 mg/L、后期为836.92 mg/L。前期接种OE的香气物质总量为985.95mg/L、中期为961.88mg/L、后期为935.19mg/L。接种两种乳酸菌,均表现出前期接种香气物质总量最高,后期接种香气物质总量最低,前期接种处理较其他接种处理在香气物质的含量上具有明显优势。
2.3.2 不同时期接种乳酸菌的葡萄酒香气物质对比
(1)酯类化合物
酯类化合物大多呈现出水果香气。如乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸异戊酯、壬酸乙酯、辛酸乙酯以及癸酸乙酯等,具有苹果、草莓、香蕉和桃李等水果香[23-24]。由表4可知,本试验6个不同处理组共检测出32种酯类化合物。其中,接种菌株LA时,前期接种的葡萄酒中检测出酯类化合物26种,含量为291.47 mg/L;中期接种的葡萄酒中检测出酯类化合物23种,含量为240.13 mg/L;后期接种的葡萄酒中检测出酯类化合物25种,含量为235.10 mg/L。接种菌株OE时,前期接种的葡萄酒中检测出酯类化合物23种,含量为192.83 mg/L;中期接种的葡萄酒中检测出酯类化合物23种,含量为161.69 mg/L;后期接种的葡萄酒中检测出酯类化合物21种,含量为155.69 mg/L。在不同时期接种两种乳酸菌,前期接种的葡萄酒中表现出酯类物质种类多和含量高的特点,其中乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乳酸乙酯、辛酸甲酯的物质含量显著高于中期和后期接种(P<0.05)。接种菌株LA的酒样检测出了异丁酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸异戊酯、乙酸壬酯等物质,而接种菌株OE的酒样检测出了乙酸丁酯和甲酸辛酯。在不同时期接种菌株LA、OE,在前期接种时,葡萄酒中乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乳酸乙酯和辛酸甲酯物质含量更高,给酒样带来草莓、乳香、柑橘、花香的香味特征。在中期接种的葡萄酒中异戊酸乙酯含量更高,可赋予葡萄酒果香特征。在后期接种时葡萄酒中产生的酯类香气物质含量较低,说明不同乳酸菌发酵后的香气物质通过数量、种类以及相互之间的协调作用使葡萄酒展现出特有的香气[25]。
表4 不同时期接种乳酸菌葡萄酒的香气物质含量
Table 4 Contents of aroma substances in wines inoculated with lactic acid bacteria at different periods μg/L
CAS 香气成分 香气描述前期LA中期 前期后期OE中期 后期141-78-6 110-19-0 105-54-4 108-64-5 123-92-2 624-54-4 123-66-0 142-92-7 106-30-9 97-64-3 111-11-5 106-32-1 2198-61-0 123-29-5 110-38-3 2035-99-6 123-25-1 103-45-7 106-33-2 2306-91-4 124-06-1 628-97-7 19329-89-6 76649-16-6 97-62-1 105-37-3 2396-83-0 105-68-0 112-06-1 112-32-3 123-86-4 143-13-5水果香气、酯香草莓味、果香、花香果香、草莓、青苹果香蕉、甜果香香蕉、果香苹果味草莓、青苹果苹果、茴香新鲜果香乳香、悬钩子果香果香、柑橘、甜橙菠萝、梨、花香香蕉、果香果香、玫瑰花脂肪、果香水果香味水果清香花香、桃子果香、花香、奶酪/花香、肉桂香苹果、菠萝、奶油奶酪、坚果果香、皮革气味果香、草莓香菠萝果香/杏仁、菠萝的苦甜味椰子、菠萝甜水果香果香花果香78-83-1 71-36-3 589-35-5 111-27-3 928-96-1酯类总量乙酸乙酯乙酸异丁酯丁酸乙酯异戊酸乙酯乙酸异戊酯丙酸戊酯正己酸乙酯乙酸己酯庚酸乙酯乳酸乙酯辛酸甲酯辛酸乙酯己酸异戊酯壬酸乙酯癸酸乙酯辛酸3-甲基丁酯丁二酸二乙酯乙酸苯乙酯月桂酸乙酯癸酸3-甲基丁酯十四酸乙酯棕榈酸乙酯乳酸异戊酯反式-4-癸烯酸乙酯异丁酸乙酯丙酸乙酯3-己烯酸乙酯丙酸异戊酯乙酸庚酯甲酸辛酯乙酸丁酯乙酸壬酯高级醇类总量异丁醇正丁醇3-甲基-1-戊醇正己醇叶醇291 466.97 199 952.85±66.74a 61.84±9.91a 491.57±10.64a 5.40±0.60a 74 250.20±6.62a 5.18±0.38a 2 047.33±49.25a 26.90±1.37a 7.19±0.53b 4 846.86±15.57a 5.09±0.52a 4 569.69±11.47a 12.03±2.60a 38.41±2.57a 2 087.08±55.42a 516.71±80.08a 568.23±31.99a 179.73±12.08a 174.08±12.74a 122.96±17.63a 72.85±15.73a 49.22±8.71a 277.70±13.75a 966.35±31.19a Nd Nd Nd 4.23±0.57a Nd Nd Nd 127.29±8.55a 550 161.65 86 279.50±308.09c 2 710.34±55.29a 99.25±2.59b 4 467.20±20.76a 84.11±2.79a 240 134.86 172 393.98±49.12b 61.31±5.61a 460.03±5.55ab 7.45±1.44a 57 902.92±73.36b Nd 1 259.95±42.80c 7.86±1.63b 210.83±9.68a 2 305.40±32.22b 3.00±0.20b 2 939.28±10.17c 13.86±0.09a 33.77±0.93ab 1 572.18±50.93c 21.49±0.06b 481.87±18.24ab 44.17±1.74b 217.78±26.89a 4.60±0.54b 5.45±1.38b 38.97±5.00a 70.24±5.07b 78.47±14.78b Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd 491 155.50 90 519.70±90.15b 1 933.08±10.64b 48.25±7.27b 2 326.59±63.93c Nd 235 098.01 168 630.81±64.53c 58.55±4.28a 429.40±7.10b 6.11±0.08a 56 449.11±117.52c Nd 1 541.42±58.35b 25.10±1.14a 6.51±0.26b 2 056.67±24.57c 3.57±0.48ab 3 084.04±15.90b 11.13±1.20a 28.80±2.33b 1 845.19±31.03b 37.40±3.89b 459.45±8.50b 143.72±15.03a 216.42±25.64a Nd Nd 37.17±3.72a Nd 2.23±0.97b 6.95±0.41a 7.60±1.43a 3.30±0.53a 4.27±0.66a 3.09±0.53a Nd Nd Nd 449 610.23 95 514.71±51.90a Nd 223.08±20.73a 3 218.13±32.90b 53.39±3.77b 192 834.68 118 723.65±49.64A 53.28±1.21A 322.12±18.01A 6.14±0.26B 37 681.17±209.93B Nd 1 107.06±4.06A 7.79±2.19B 25.08±0.99A 29 291.39±10.55A 3.79±0.22A 2 775.18±16.18B 9.85±1.34A 35.78±3.23A 1 688.41±49.55B 18.83±1.96B 594.44±37.25A 166.08±2.64AB 169.00±22.5A 7.70±1.45B Nd 32.17±3.13B Nd 96.73±4.89B Nd Nd Nd Nd Nd 5.72±0.40A 13.32±1.35A Nd 563 485.02 95 418.51±236.08A Nd 105.39±14.79A Nd 64.10±0.84A 161 689.85 106 960.86±29.68C 43.18±2.53AB 324.38±16.92A 75.31±6.01A 45 068.18±33.07A 7.20±2.14A 1 169.44±26.91A 19.15±2.35A 4.29±1.01B 870.79±9.38C 3.43±1.20A 3 616.84±1.76A 10.27±2.07A Nd 2 180.88±4.03A Nd 630.06±13.39A 213.18±22.37A 257.80±37.59A 14.18±0.80A 4.03±0.28B 44.39±0.23AB Nd 165.12±3.60A Nd Nd Nd Nd 2.18±0.59A 4.70±0.46AB Nd Nd 559 497.84 72 734.38±128.83C 1 284.08±18.66A 127.82±8.71A 2 324.03±51.80B 38.81±5.28B 155 685.36 113 703.67±90.22B 34.55±4.46B 281.47±15.39A 5.25±0.76B 34 191.81±1.76C Nd 1 161.68±26.10A 8.17±1.09B 24.94±1.12A 1 145.79±23.33B 3.41±0.68A 2 364.06±13.57C 10.88±2.67A Nd 1 602.83±25.61B 43.66±3.72A 562.90±9.15A 146.51±11.80B 267.64±22.66A 12.28±0.76AB Nd 46.94±3.57A Nd 63.56±7.04C Nd Nd Nd Nd Nd 3.36±0.26B Nd Nd 522 213.51 81 904.70±136.57B Nd 141.20±19.00A 2 791.94±33.32A 48.89±2.27B轻甜、醇香清新醇香辛辣、青草辛辣、青草草香味
续表
注:“Nd”表示未检出;“/”表示未查阅到相关资料。
CAS 香气成分 香气描述前期LA中期 前期后期OE中期 后期628-99-9 513-85-9 111-87-5 143-08-8 112-30-1 100-51-6 60-12-8 123-51-3 626-89-1 505-10-2水果清香、蔷薇香气果香、奶油茉莉花、柠檬,柑橘玫瑰花、甜橙味甜橙味、花香甜味、烘烤味玫瑰花,蜂蜜,丁香香蕉,果香杏仁味、烘烤味生土豆味,蒜味64-19-7 503-74-2 79-31-2 142-62-1 124-07-2 334-48-5 4536-23-6醋酸味泡菜味、腐败味黄油、奶酪味奶酪,木料味,树叶味奶酪,涩味脂肪味/106-22-9 23726-93-4 78-70-6青草,柠檬,蔷薇果香,花香花香、薰衣草431-03-8 600-14-6 112-31-2 78-98-8 513-86-0 122-78-1 2-壬醇2,3-丁二醇1-辛醇1-壬醇1-癸醇苄醇苯乙醇异戊醇4-甲基-1-戊醇3-甲硫基丙醇脂肪酸类总量乙酸异戊酸异丁酸己酸辛酸癸酸2-甲基己酸萜烯类总量香茅醇大马士酮芳樟醇醛酮类总量2,3-丁二酮2,3-戊二酮癸醛丙酮醛乙偶姻苯乙醛39.75±5.89a 605.78±5.35a 59.15±7.47a 569.99±12.80a 5.59±1.43a 282.65±23.99a 77 150.95±57.71a 377 807.39±100.80a Nd Nd 331 311.20 323 250.31±2 018.46a 2 431.92±107.42a 3 892.86±91.52b 922.86±2.10a 545.80±20.01ba 267.45±15.26a Nd 85.79 7.02±1.28a 5.43±1.46a 73.34±0.58a 9435.55 9 424.87±62.96a Nd 10.68±2.17a Nd Nd Nd Nd 76.61±10.50c 62.61±11.13a 460.05±13.70b 7.02±1.96a 186.50±5.39b 57 703.52±148.32b 337 827.72±176.91b 3.85±0.22b Nd 190 570.01 184 847.78±2 160.06b Nd 4 147.40±3.25a 867.92±2.39b 495.02±10.48a 211.89±12.96ab Nd 69.55 7.39±1.32a 6.95±2.95a 55.21±10.47a 0 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd 172.83±8.86b 33.60±0.97a 181.51±9.06c 6.89±1.00a 168.78±7.03b 49 825.48±168.26c 30 0181.59±180.54c 30.24±6.14a Nd 142 983.75 136 451.27±107.20c 1 785.59±41.25b 4 092.83±30.53ab Nd 484.77±13.00a 169.29±16.35b Nd 9.55 9.55±0.55a Nd Nd 9214.67 9 169.69±219.11a 44.98±5.52a Nd Nd Nd Nd Nd 521.48±8.34C Nd 466.42±7.06B 7.25±0.64AB 348.24±8.40C 82 032.54±94.97B 384 260.47±423.32A Nd 260.62±5.03A 229 258.36 222 269.49±36.73C 1 461.02±15.24A 3 823.83±75.00A 903.23±54.85A 586.82±1.87B 213.97±7.41B Nd 238.10 7.85±1.62A 5.37±1.52A 224.88±1.63A 136.37 Nd Nd Nd 136.37±18.50A Nd Nd 36.09±14.09A 1 290.34±30.66B Nd 621.36±4.70A 9.10±0.10A 471.24±12.18A 116 005.37±413.44A 364 477.54±357.71B 77.68±2.04A Nd 240 593.30 234 842.98±76.59B Nd 3 897.86±12.74A 867.31±13.49A 746.12±11.87A 239.03±3.23A Nd 57.76 10.40±1.51A 5.97±1.91A 41.39±0.67B 142.16 Nd Nd Nd Nd 122.58±2.26A 19.58±3.22A Nd 1 643.41±17.07A 42.64±0.40A 160.11±3.00C 6.37±0.50B 409.50±15.08B 81 624.00±48.51B 353 440.75±14.13C Nd Nd 249 094.75 247 749.85±862.10A Nd Nd Nd 558.55±38.34B 222.25±4.60AB 564.10±21.62A 25.76 7.14±1.86A Nd 18.62±1.44C 8172.91 8 171.61±50.66A 1.30±0.30A Nd Nd Nd Nd奶油味近似于苯醌的微甜味甜橙和橘子香/脂肪味、奶油味奶油味
(2)高级醇类化合物
高级醇属于酵母酒精发酵过程中糖代谢和氨基酸转化的次级代谢产物之一[26]。由表4可知,本试验6个不同处理组共检测出15种高级醇类化合物。其中,接种LA时,前期接种的葡萄酒中检测出高级醇类化合物13种,含量为550.16 mg/L;中期接种的葡萄酒中检测出高级醇类化合物12种,含量为491.16 mg/L;后期接种的葡萄酒中检测出高级醇类化合物12种,含量为449.61 mg/L。接种OE时,前期接种的葡萄酒中检测出高级醇类化合物10种,含量为563.49 mg/L;中期接种的葡萄酒中检测出高级醇类化合物13种,含量为559.50 mg/L;后期接种的葡萄酒中检测出高级醇类化合物11种,含量为522.21 mg/L。两种乳酸菌在不同时期接种,结果显示在前期接种,所得到的酒样的高级醇类物质含量较其他两个接种时期更高,在前期接种时葡萄酒中的叶醇和异戊醇的含量显著高于中期和后期接种(P<0.05),给酒样带来青草、香蕉的香味特征;在中期接种LA时,葡萄酒中1-辛醇和1-癸醇等物质含量显著高于前期和后期接种(P<0.05),给酒样带来茉莉花、柠檬,柑橘的香味特征;在后期接种的葡萄酒中3-甲基-1-戊醇和4-甲基-1-戊醇的物质含量显著高于前期和中期(P<0.05),会给酒样带来辛辣、青草、烘烤味。接种OE时,在中期接种的葡萄酒中1-癸醇、苄醇、苯乙醇等物质含量显著高于前期和后期接种(P<0.05),给酒样带来花香、烘烤味、醇香、丁香的香味特征。在后期接种的葡萄酒中2,3-丁二醇、正己醇、3-甲基-1-戊醇等物质含量显著高于前期和中期接种(P<0.05),给酒样带来辛辣、青草、果香、奶油、柠檬的香气特征。
(3)脂肪酸类化合物
脂肪酸类化合物一般来源于葡萄酒发酵过程中酵母和乳酸菌代谢所得的副产物,其多数化合物具有醋酸、腐臭及不愉快的脂肪酸味,但在较低浓度时可平衡酒体果香,赋予酒体特殊奶酪味[27-28]。由表4可知,本试验共检测到7种脂肪酸类化合物。其中,接种LA时,前期接种的葡萄酒中检测出脂肪酸类化合物6种,含量为331.31 mg/L;中期接种的葡萄酒中检测出脂肪酸类化合物5种,含量为190.57 mg/L;后期接种的葡萄酒中检测出脂肪酸类化合物5种,含量为142.98 mg/L。接种OE时,前期接种的葡萄酒中检测出脂肪酸类化合物6种,含量为229.26 mg/L;中期接种的葡萄酒中检测出酸类化合物5种,含量为240.59 mg/L;后期接种的葡萄酒中检测出脂肪酸类化合物4种,含量为249.09 mg/L。接种OE的酒样检测出了2-甲基己酸,接种不同乳酸菌,脂肪酸类化合物含量表现出不一样的特征。当接种LA时,前期接种的葡萄酒中脂肪酸类物质的含量最高,会给酒样带来更浓郁的黄油和奶酪味,同时醋酸、泡菜、腐败味也更重,会降低酒样的香气质量。当接种OE时,前期接种的葡萄酒中脂肪酸类物质的含量最低,酒样产生的不良气味对酒样的香气质量影响较小。
(4)萜烯类和醛酮类化合物
萜烯类化合物在葡萄酒香气成分中具有较大的贡献,其香气感官阈值极低,因此少量的萜烯类物质即可赋予葡萄酒较好的花果香和品种香[29-30]。由表4可知,本试验6个处理组酒样检测到萜烯类和醛酮类共9种。其中,接种LA时,前期接种的葡萄酒中检测出萜烯类和醛酮类化合物共5种,含量为9.52 mg/L;中期接种的葡萄酒中检测出萜烯类和醛酮类化合物共3种,含量为0.07 mg/L;后期接种的葡萄酒中检测出萜烯类和醛酮类化合物共3种,含量为9.22 mg/L。接种OE时,前期接种的葡萄酒中检测出萜烯类和醛酮类化合物4种,含量为0.37 mg/L;中期接种的葡萄酒中检测出萜烯类和醛酮类化合物5种,含量为0.20 mg/L;后期接种的葡萄酒中检测出萜烯类和醛酮类化合物4种,含量为8.20 mg/L。代晨曦等[31]同样在葡萄酒检测中得到萜烯类物质种类少含量低的结果。在后期接种LA、OE的酒样中检测出了2,3-戊二酮。接种LA时,前期接种的葡萄酒中检测出萜烯类和醛酮类化合物的含量较高,可赋予葡萄酒花香、果香、奶油的香气特征。当接种OE时,后期接种的葡萄酒中检测出萜烯类和醛酮类化合物的含量较高,可赋予葡萄酒更浓郁的花香、果香、奶油香气特征,中期接种两种不同乳酸菌的葡萄酒中萜烯类和醛酮类化合物的含量最低。
2.3.3 乳酸菌的接种时期对‘赤霞珠’干红葡萄酒气味活性值的影响
葡萄酒在发酵过程中,会产生大量的香气物质,每种化合物对整个香气的贡献可以通过其气味活性值(OAV)来估计,当香气物质的OAV>1时,便会对葡萄酒的香气特征产生影响[37]。不同时期接种对葡萄酒气味活性值(OAV)的影响结果见表5。
表5 ‘赤霞珠’干红葡萄酒气味活性值分析
Table 5 Analysis of odor activity value of 'Cabernet Sauvignon' dry red wine
香气成分 CAS 阈值[32-36]/(μg·L-1) 香气描述气味活性值(OAV)前期 中期LA后期 前期 中期OE乙酸乙酯丁酸乙酯异戊酸乙酯乙酸异戊酯正己酸乙酯辛酸乙酯癸酸乙酯乳酸乙酯异丁醇苯乙醇1-壬醇乙酸异戊醇异丁酸己酸辛酸芳樟醇2,3-丁二酮癸醛大马士酮141-78-6 105-54-4 108-64-5 123-92-2 123-66-0 106-32-1 110-38-3 97-64-3 78-83-1 1960/12/8 143-08-8 64-19-7 123-51-3 79-31-2 142-62-1 124-07-2 78-70-6 431-03-8 112-31-2 23726-93-4 7 500 35 3 2 000 14 600 200 14 000 40 000 14 000 600 200 000 30 000 2 300 420 500 25 100 10 0.05水果香气、酯香果香、草莓、青苹果香蕉、甜果香香蕉、果香草莓、青苹果菠萝、梨、花香脂肪味、水果香乳酸味、覆盆子轻甜、醇香玫瑰花、丁香、蜂蜜玫瑰花、甜橙味醋酸味香蕉、果香黄油、奶酪味奶酪、木料味、树叶味奶酪味、涩味花香、薰衣草奶油味甜橙果香、花香26.66±0.01a 14.05±0.31a 1.80±0.20a 37.13±0.01a 146.24±3.52a 7.62±0.02a 10.44±0.28a<1 2.16±0.01c 5.51±0.00a<1 1.62±0.01a 12.60±0.01a 1.69±0.04a 2.20±0.01a 1.09±0.04a 2.90±0.03a 94.25±0.63a 1.07±0.22a 108.63±29.23a 22.99±0.01b 13.15±0.16ab 2.48±0.48a 28.95±0.04b 90.00±3.06c 4.90±0.02c 7.87±0.26c<1 2.27±0.01b 4.12±0.01b<1<1 11.27±0.01b 1.80±0.00a 2.07±0.01b<1 2.21±0.42a<1<1 138.94±58.94a 22.49±0.01c 12.27±0.20b 2.04±0.03a 28.23±0.06c 110.10±4.17b 5.14±0.03b 9.23±0.16b<1 2.39±0.00a 3.56±0.01c<1<1 10.01±0.01c 1.78±0.01a<1<1<1 91.70±2.19a<1<1 15.83±0.01A 9.21±0.52A 2.05±0.09B 18.85±0.11B 79.08±0.29A 4.63±0.03B 8.44±0.25B 2.09±0.00A 2.39±0.01A 5.86±0.01B<1 1.11±0.00C 12.81±0.02A 1.67±0.04A 2.15±0.13A 1.18±0.01B 9.00±0.07A<1<1 107.31±30.31A 14.27±0.01C 9.27±0.49A 25.11±2.01A 22.54±0.02A 83.53±1.92A 6.03±0.00A 10.90±0.02A<1 1.82±0.00C 8.29±0.03A 1.04±0.01A 1.17±0.00B 12.15±0.01B 1.70±0.01A 2.07±0.04A 1.50±0.03A 1.66±0.03B<1<1 119.42±38.22A后期15.16±0.01B 8.04±0.44A 1.75±0.25B 17.10±0.00C 82.98±1.87A 3.94±0.02C 8.02±0.13B<1 2.05±0.01B 5.83±0.00B<1 1.24±0.01A 11.78±0.00C<1<1 1.12±0.08B<1 81.72±0.51A<1<1
由表5可知,本试验6个处理组酒样中香气物质OAV>1的共20种,在香气物质OAV>1的物质中,酯类物质种类最多,其次是脂肪酸类和高级醇类,萜烯类和醛酮类最少。接种两种乳酸菌,均表现出前期接种乳酸菌的葡萄酒中香气物质OAV>1的数量多于中期接种和后期接种的葡萄酒。在前期、中期、后期接种LA的葡萄酒中香气物质OAV>1的分别为18种、15种、13种。在前期、中期、后期接种OE的葡萄酒中香气物质OAV>1的分别为17种、17种、13种。在不同时期接种两种乳酸菌时,乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、异戊醇等物质含量存在显著差异(P<0.05),当化合物OAV较高时,会赋予葡萄酒更强烈、更复杂的香气特征[38],这些高OAV的物质对酒样的香气有巨大的正面影响,可赋予葡萄酒更浓郁的花香和果香特征。前期接种的葡萄酒中乙酸乙酯、2,3-丁二酮、芳樟醇、异戊醇的OAV较大,带给酒样更浓郁的奶油、果香、花香味特征。中期接种异戊酸乙酯、大马士酮、异丁酸的OAV较大,带给酒样更浓郁的香蕉、黄油、奶酪味、花香和果香味特征。后期接种的OAV较小,会减弱酒样的香气特性。
‘赤霞珠’葡萄酒不同时期接种乳酸菌感官评分结果见表6。由表6可知,所有酒样的感官评分总分在85.45~87.39分之间,属于优质健康的干红葡萄酒。其中感官评分总分最高的为前期接种LA的葡萄酒,感官评分为87.39分,其次为前期接种OE的葡萄酒,感官评分为87.34分。从外观方面来看,接种时期对澄清度、色调和色度影响不大,所有酒样清澈透亮,呈紫色色调。在香气特征方面,前期接种的酒样在香气纯正度、浓郁度和协调度评分均高于其他两个时期接种的酒样,口感方面,结构、香气持久度、余味的评分大小分别是前期接种高于中期接种和后期接种。综上所述,前期接种乳酸菌的葡萄酒相较于其他时期接种的葡萄酒,葡萄酒的整体品质总体评价更好。口感更有层次感、余味持久且令人愉悦。
表6 ‘赤霞珠’干红葡萄酒感官评分结果
Table 6 Sensory score results of 'Cabernet Sauvignon' dry red wine
外观香气口感项目 前期澄清度色调色度纯正度浓郁度优雅度协调度纯正度浓郁度结构协调度香气持久度余味典型性总分5.29±0.19a 5.26±0.07a 5.32±0.15a 5.29±0.11a 7.00±0.15a 7.34±0.11a 6.92±0.63a 5.18±0.48a 6.74±0.15a 7.03±0.56a 6.57±0.60a 7.11±0.60a 5.29±0.41a 7.05±0.82a 87.39±2.04a拉氟德中期 前期5.11±0.07a 5.32±0.15a 5.26±0.07a 5.13±0.11a 6.89±0.15a 7.05±0.22a 6.71±0.56a 5.37±0.30a 6.97±0.41a 6.84±0.15a 6.81±0.71a 6.89±0.30a 5.13±0.63a 6.84±0.74a 86.34±1.82a后期5.21±0.22a 5.21±0.15a 5.21±0.15a 5.08±0.19a 6.79±0.15a 7.11±0.07a 6.66±0.86a 5.37±0.37a 6.82±0.04a 6.61±0.71a 6.89±0.74a 6.63±0.74a 5.11±0.22a 6.76±0.26a 85.45±1.82a 5.29±0.11A 5.39±0.04A 5.37±0.07A 5.42±0.52A 7.32±0.74A 7.18±0.48A 6.50±0.04A 5.42±0.45A 6.68±0.07A 7.11±0.97A 6.79±0.15A 7.03±0.86A 5.16±0.45A 6.69±0.37A 87.34±1.82A诺盟中期 后期5.21±0.07A 5.37±0.15A 5.24±0.11A 5.32±0.45A 7.18±0.26A 7.29±0.26A 6.39±0.33A 5.32±0.52A 6.58±0.22A 7.00±0.82A 6.92±0.11A 6.92±0.04A 5.13±0.33A 6.66±0.04A 86.53±0.97A 5.26±0.22A 5.37±0.07A 5.13±0.11A 5.24±0.26A 7.13±0.48A 7.24±0.33A 6.29±0.78A 5.16±0.67A 6.63±0.15A 6.94±0.82A 6.98±0.04A 6.87±0.71A 5.05±0.22A 6.63±0.22A 85.92±1.30A
以‘赤霞珠’酿酒葡萄为原料,在酒精发酵前期、中期和后期3个时期接种两种商业乳酸菌对‘赤霞珠’干红葡萄酒理化及感官的影响研究中发现,3个不同接种时期处理下均能顺利完成发酵,前期接种所需发酵时间最短且降酸效果最明显。在不同时期接种两种乳酸菌,葡萄酒的色度、色调、残糖、酒精度均无显著性差异(P>0.05)。前期接种葡萄酒的香气物质含量最高且物质种类最多,此外,接种两种不同的乳酸菌,均表现出前期接种乳酸菌的葡萄酒中OAV>1的香气物质种类多于中期接种和后期接种的特点。前期接种的酒样评分最高,具有良好的感官特性。综上所述,前期接种乳酸菌相较于其他时期接种在葡萄酒生产上更有优势。
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Effects of inoculation with lactic acid bacteria at different periods on physicochemical and sensory quality of'Cabernet Sauvignon'dry red wine