保健酒是中国传统酒文化和中医药文化的有机融合，其不仅能补充人体所需的营养物质，还能改善人体的亚健康状况，这种功能恰好符合中医的“治未病”理念[1]。随着我国社会经济发展水平的改善和消费者健康意识的增强，一系列有助于降血脂、增强免疫力、保肝等功能的酒类食品被开发，如毛铺苦莽酒[2]、复方金钗石斛酒[3]、铁皮石斛灵芝酒等[4]。
竹叶青酒被誉为“中华圣酒”，是中华“药酒同源理论”的活体见证者，也是世界上唯一的一种“植物养生保健酒”[5]。现代研究表明，得益于山西杏花村得天独厚的汾酒微生物体系，以及传承千年的古法工艺酿造而成的竹叶青酒具有保肝、护胃、清心、除烦、消食之功效[6]。竹叶青酒配方秉承了绿色健康理念，融合“百草之香”郁金酿制的健康需求，使得其在2023保健酒热度榜（品牌）Top10获得了第四名的好成绩[7-8]。王金辉等[9]研究发现，竹叶青酒具有缓解急性肝损伤疾病的作用，但对其功效物质基础没有进行深入的研究。网络药理学研究表明，竹叶青酒配方中的栀子通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K-AKT）等信号通路发挥肝损伤的保护作用[10]，但对于栀子肝损伤保护作用的功效成分没有深入研究。竹叶青酒配方中的陈皮、淡竹叶虽有文献报道其具有保护肝损伤的作用[11-12]，但其功效成分和作用机制仍不清楚。目前，关于竹叶青酒如何通过其独特的成分和机制来缓解急性肝损伤的研究仍然非常有限。因此，对竹叶青酒的功效成分和潜在作用机制进行深入的探索性研究，将有助于竹叶青酒更好的开发与利用。
网络药理学是一个阐明药物作用机制并指导药物研发进入临床诊断和治疗的系统性学科[13]。分子对接可以通过预测成分与蛋白质之间的结合亲和力来筛选活性成分，已被广泛应用于药物发现领域[14]。网络药理学和分子对接相结合，可以更有效地筛选中药中的活性成分并确定其潜在靶点和作用机制[15-17]。近年来，液相色谱-质谱技术（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）在食品及中药成分定性与定量领域中得到了广泛的应用[18]，如YANG F G等[19]采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-串联质谱（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole timeof-flight tandem mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术，从给予肠康方提取物处理的大鼠生物样品中检测到149种外源性物质（58种原型成分和91种代谢物）。因此，本研究应用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术与网络药理学及分子对接技术相结合的方法探究竹叶青酒缓解急性肝损伤的功效成分及作用靶点，为阐明竹叶青酒功效物质及健康机理奠定科学基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
42%vol青享版竹叶青酒：山西杏花村汾酒厂股份有限公司；甲酸、乙腈（均为色谱纯）：美国Thermo公司；甲醇（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；木香烃内酯、阿魏酸、栀子苷、橙皮苷、藏红花酸标准品（纯度均≥98%）：成都普思生物科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 1290超高效液相色谱仪：美国Agilent公司；Q-TOF 5600+质谱仪：美国AB Sciex公司；KQ-500VDE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水机：上海康磊分析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 竹叶青酒潜在化学成分的筛选与收集
（1）基于数据库竹叶青酒潜在化学成分的筛选
利用中药系统药理学数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索竹叶青酒配方中药化学成分信息，以药效动力学参数口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥20%或类药性（druglikeness，DL）≥0.10为条件进行筛选[20]。筛选的具体做法以栀子为例，首先选择“Herb name”选项，输入“栀子”或“Gardeniae Fructus”获得数据库收录的化学成分后，通过检索结果的OB和DL值对栀子中各化学成分进行筛选，以此类推，获得竹叶青酒中配方中药的成分信息。
（2）基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术竹叶青酒化学成分的鉴定[21]
供试品溶液的制备：取42%vol青享版竹叶青酒50 mL，45 ℃恒温水浴加热浓缩至低于1 mL，所得残留物加入体积分数70%乙醇溶液溶解并定容至1 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。将供试品溶液注入UPLC-Q-TOFMS/MS仪进行分析。
UPLC色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1mm×100mm，1.7μm）；进样量为5μL；流速为0.3mL/min；柱温为40 ℃；流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱程序为0～1 min，98%～95%A；1～7 min，95%～90%A；7～15 min，90%～60%A；15～25 min，60%～5%A；25～27 min，5%～95%A；27～29 min，95%～5%A。
质谱条件：电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源采用正离子模式进行数据采集，雾化气为氮气（N2），锥孔气为N2。喷雾电压为5 500 V，雾化器温度为550 ℃，气帘气为35 psi，雾化气与辅助加热气均为55 psi；裂解电压为80 V，碰撞能量为30 eV，碰撞能量差为15 eV，质荷比扫描范围为50～1 500 m/z。
定性分析：将采集到的原始数据导入SCIEX OS软件，并导入SCIEX数据库收录的中药成分信息（分子式、加合方式、二级质谱图），通过软件Auto peak算法匹配准分子峰。通过质量误差置信度、同位素置信度、数据库匹配置信度等参数过滤匹配结果，并对比数据库二级质谱鉴定竹叶青酒中的化学成分。
最后，将TCMSP数据库筛选得到的成分与UPLC-QTOF-MS/MS鉴定得到的成分去重后，获得竹叶青酒潜在功效成分信息。
1.3.2 竹叶青酒功效成分与急性肝损伤共有靶点的筛选
利用TCMSP数据库下载潜在成分靶点，并通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）找到潜在成分靶点对应的基因名称；随后使用PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载潜在成分的3D结构式，并通过Swiss Target Prediction（http：//swisstargetprediction.ch/）收集潜在成分的靶点[22]，并去除重复靶点。通过GeneCards数据库[23]（https：//www.genecards.org）和OMIM数据库（https：//www.omim.org）输入急性肝损伤疾病的英文名称“Acute liver failure”、“Acute liver damage”，并以Relevance score≥5对检索出的结果进行筛选。将成分作用靶点与急性肝损伤疾病靶点共同导入微生信在线平台[24]（www.bioinformatics.com.cn）进行映射，获得竹叶青酒缓解急性肝损伤的共有靶点。
1.3.3 蛋白质互作网络构建
利用String在线数据平台（https：//string-db.org/）导入共有靶点信息，所得的靶点互作数据导入Cytoscape 3.7.2软件中用于构建共有靶点的蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络关系图，并以网络拓扑学参数“Degree、Closeness centrality、Betweenness centrality”为条件筛选出核心潜在靶点。
1.3.4 GO功能与KEGG信号通路富集分析
为进一步研究共有靶点在基因功能上的作用及其主要的作用通路，将共有靶点输入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能注释与京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，GO功能富集分析主要包含生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cell component，CC）。
1.3.5“功效成分-潜在靶点-作用通路”网络图的构建
将竹叶青酒潜在成分、共有靶点、作用通路分析结果导入Cytoscape 3.7.2软件构建“潜在成分-潜在靶点-作用通路”的网络。进一步利用CytoNCA 2.1.6工具计算和筛选与疾病靶点相互作用密切的功效成分与信号通路，最后通过去除其他成分节点上的靶点与通路后，重新绘制“功效成分-潜在靶点-作用通路”网络图。
1.3.6 分子对接计算化学成分与作用靶点的亲和力
将“功效成分-潜在靶点-作用通路”网络中节点连接度（degree）值较高的功效成分与核心潜在靶点在AutoDock 1.5.7软件中进行分子对接。首先，采用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）检索靶点蛋白，并设定物种为人源（Homo sapiens），并通过PDB数据库（https：//www.uniprot.org）下载靶点蛋白质结构，每个靶点下载2个具有X-单晶衍射结构的PDB格式文件[25]。小分子MOL2.格式文件则由ChemDraw 20.0软件转化得到，对接结果可视化通过PyMOL 2.5.0软件处理得到，采用蛋白质-配体相互作用分析工具（https：//plip.biotec.tudresden.de/plipweb/plip/index）分析成分与靶点之间形成的氢键、疏水键等作用力[26]。
2 结果与分析
2.1 竹叶青酒潜在功效成分的收集与鉴定
应用TCMSP数据库检索竹叶青酒配方中药化学成分信息，并结合药效动力学参数OB、DL值进行有效筛选，共得到71种潜在成分，同时通过UPLC-Q-TOF-MS/MS检测分析，从竹叶青酒中共鉴定出53种成分，最终通过去除11个重复成分后，获得113个潜在成分，具体信息见表1。
表1 竹叶青酒中潜在功效成分的筛选结果
Table 1 Screening results of potential functional components in Zhuyeqing liquor
成分 OB/%/母离子 DL/碎片离子 成分归属异牡荆苷（-）绿原酸（-）咖啡酸（-/+）异鼠李素（-）木犀草素（-）γ-谷甾醇（-）柚皮素（-/+）山柰酚（-）5,7-二羟基-2-（3-羟基-4-甲氧基苯基）苯并吡喃-4-酮（-）亚油酸乙酯（-）醋酸豆甾醇（-）β-谷甾酮（-）苜蓿素（-）苜蓿素-7-O-葡萄糖苷（-）荭草苷（-）异荭草苷（-）牡荆苷（-）山柰苷（-）藏红花酸（-/+）欧前胡素（-）苏丹红III（-）异欧前胡素（-）油酸乙酯（-）伞房花耳草素（-）异山柰素（-）京尼平（-）藏红花素（-）柠檬黄素（-）31.29/13.61/54.97/49.60/36.16/36.91/59.29/41.88/0.72/0.31/0.05/0.31/0.25/0.75/0.21/0.24/47.74/0.27/檀香、淡竹叶菊花、栀子菊花菊花、檀香菊花、檀香菊花、砂仁陈皮、菊花丁香、菊花、零陵香、山柰、栀子陈皮、菊花42.00/46.44/36.08/27.86/30.41/31.79/23.30/3.05/8.16/35.30/34.55/84.07/45.46/32.40/51.96/60.16/26.06/7.06/86.90/0.19/0.86/0.76/0.34/0.51/0.75/0.76/0.71/0.79/0.26/0.22/0.59/0.23/0.19/0.41/0.26/0.10/0.12/0.51/零陵香、栀子零陵香、砂仁菊花、砂仁淡竹叶淡竹叶淡竹叶淡竹叶淡竹叶淡竹叶栀子栀子栀子栀子栀子栀子栀子栀子栀子陈皮
续表
成分 OB/%/母离子 DL/碎片离子 成分归属川陈皮素（-/+）橙皮苷（-/+）新橙皮苷（-）辛弗林（-）芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（-）金合欢素-7-O-葡萄糖苷（-）圣草酚（-）木犀草苷（-/+）（24r）-沙林甾醇（-）[（1S,5S,7S）-7-乙酰氧基-5-异丙烯基-2,8-二亚甲基环癸基]乙酸酯（-）金合欢素蒙花苷金圣草黄素（-）半齿泽兰素（-）香叶木素（-/+）艾黄素（-）邻苯二甲酸正丁异辛酯（-）异乙烯苷内酰胺（-）双[（2R）-2-乙基己基]苯-1,2-二羧酸酯（-）丁香酚（-）紫丁香苷（-）11H-苯并[a]咔唑（-）菜蓟苦素（-）白桦脂酸（-）豚草素（-）异戊内酯（-/+）山奈素（-）对甲氧基肉桂酸乙酯（-）β-谷甾醇乙酸酯（-）菠菜甾醇（-）亚麻酸乙酯（-）香草木宁（-）香风草苷（-）香胶甾酮（-）维生素E（-）11,14-二十碳二烯酸甲酯（-）豆甾烷-3,6-二酮（-）乙酸龙脑酯（-）左旋龙脑（-）香草酸（-）α-蒎烯（-）Z-藁本内酯（-/+）欧当归内酯A（-）61.67/13.33/11.57/79.00/21.89/19.66/71.79/7.29/39.36/0.52/0.67/0.69/0.04/0.23/0.79/0.24/0.78/0.79/陈皮陈皮陈皮陈皮菊花菊花菊花菊花菊花37.02/0.19/菊花34.97/39.84/35.85/30.23/31.14/49.55/43.74/76.30/43.59/56.24/14.64/35.22/67.50/55.38/58.57/53.43/73.41/23.36/40.39/42.98/46.10/66.68/41.24/42.45/32.29/39.67/33.12/59.30/81.80/35.47/39.56/53.72/2.15/0.24/0.71/0.27/0.37/0.27/0.48/0.24/0.76/0.35/0.04/0.32/0.22/0.38/0.78/0.14/0.15/0.27/0.06/0.85/0.76/0.20/0.20/0.72/0.44/0.70/0.23/0.79/0.51/0.05/0.04/0.06/0.07/0.82/菊花菊花菊花菊花菊花菊花菊花丁香丁香丁香丁香木香木香木香木香木香山柰山柰零陵香零陵香零陵香香排草香排草香排草砂仁砂仁砂仁砂仁砂仁砂仁当归当归当归
续表
注：“-”代表数据来源于TCMSP数据库；“+”代表通过UPLC-Q-TOFMS/MS鉴定得到。
成分 OB/%/母离子 DL/碎片离子 成分归属脯氨酸（+）亮氨酸（+）百秋李醇（+）栀子苷（+）龙胆苦苷（+）秦皮苷（+）芦丁（+）槲皮素（+）橙皮素（+）芸香柚皮苷（+）野黄芩素（+）毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷（+）槐角苷（+）鸢尾黄素（+）羟基芫花素（+）芫花素（+）黄豆黄素（+）橘皮素（+）金腰乙素（+）柠檬苦素（+）小白菊内酯（+）洋川芎内酯A（+）木香烃内酯（+）去氢木香内酯（+）川芎嗪（+）莪术二酮（+）对二甲胺基苯甲醛（+）丁香醛（+）茴香醛（+）黄连素（+）N-苄基-9顺,12顺-亚油酸酰胺（+）阿魏酸（+）奎宁酸（+）熊果酸（+）积雪草酸（+）科罗索酸（+）薯蓣皂素（+）川续断皂苷乙（+）咖啡酸乙酯（+）去乙酰车叶草苷酸甲酯（+）苯丙氨酯（+）对羟基苯甲酸乙酯（+）116.071 4 132.102 0 223.204 5 389.366 1 357.118 0 370.311 1 611.163 1 303.050 4 303.086 1 581.014 9 287.056 5 447.120 9 433.117 3 301.075 1 301.071 4 285.076 1 285.076 1 373.128 5 375.107 2 471.200 1 249.141 9 193.122 0 233.154 1 231.138 0 137.107 3 237.185 1 150.091 1 183.076 5 137.061 1 336.123 4 370.311 8 195.065 9 193.171 3 457.233 6 489.357 7 473.363 0 415.123 1 1 092.595 1 209.044 6 405.138 5 180.086 0 167.072 3 70.06,68.05 97.06,86.09,73.02,69.06 175.08,149.13 209.07,149.06,147.05,111.03 309.06,177.05,149.05,121.06,81.07 209.24,208.71 465.10,303.05 303.05,302.04,257.04,201.05 153.01,177.05 419.13,383.11,274.07,273.07,85.02 269.56,153.01 285.07 271.06 286.04,285.03,168.01,156.97 258.05 268.03,242.05,240.04 270.06,242.05,167.04,153.01 343.08,325.07,271.05 229.05 161.06,425.19,95.01,105.06 213.12,185.14,130.98,91.05 147.11,137.05,119.09 187.14,145.10,131.08 195.11,185.13,165.06,143.08,91.05 96.08,80.04,55.05 219.17,201.16,161.13 135.06,122.09,120.08,107.04 123.04,155.07,95.04,183.07,140.05,95.05 94.04,77.04,51.02,66.04 321.09,320.09,292.07 108.08,91.05 177.05,149.06,145.02,134.03,117.03,89.04 146.93,156.04,175.98 453.39,411.19,455.35 453.34,435.33,327.23 391.32,249.18,119.08 271.20,253.06 913.51,603.21,455.35 191.03,163.04,145.02,106.99,78.99 243.09,211.06,167.07 120.08,118.06,103.05,92.04,91.05 149.05,121.02,95.04,77.04-- -栀子- ---陈皮陈皮菊花菊花-- - - -陈皮菊花-菊花当归木香木香-栀子-丁香-- - 当归——---栀子- -
由表1可知，113潜在成分涉及淡竹叶7种，栀子15种，陈皮10种，菊花26种，丁香6种，木香7种，山柰3种，零陵香6种，檀香3种，香排草3种，砂仁9种，当归5种。经过筛选收集的化学成分大部分来自于菊花、栀子及陈皮，说明其可能构成了竹叶青酒缓解急性肝损伤的主要物质基础。王春丽[27]研究发现，菊花醇提取物通过腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activatedproteinkinase，AMPK）途径，并介导糖原合成酶激酶-3β-核转录因子红系2相关因子2（glyco gen synthase kinase-3β-nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，GSK-3β-Nrf2）信号通路，减轻肝脏氧化应激，从而改善乙酰氨基酚过量导致的大鼠肝脏损伤。秦莎莎[28]研究发现，栀子提取物通过上调Cy8bI信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表达，并抑制肝脏中初级胆汁酸（primary bile acid，PBA）的合成，从而发挥改善急性胆汁淤积性肝损伤的作用。
2.2 竹叶清酒功效成分与疾病共有靶点的筛选及PPI网络的构建
通过TCMSP和Swiss Target Prediction数据库预测得到竹叶青酒功效成分的510个作用靶点，通过GeneCards及OMIM数据库检索得到急性肝损伤1 197个靶点，将急性肝损伤疾病的作用靶点与功效成分的作用靶点绘制Venn图，得到共有靶点，并将共有靶点导入到String在线数据平台，以此构建共有靶点PPI网络图，结果见图1。
图1 “化学成分作用靶点-疾病靶点”韦恩图（A）及共有靶点PPI网络图（B）
Fig.1 Venn diagram of "chemical composition action targets-disease targets" (A) and PPI network diagram (B) of common targets
由图1A可知，急性肝损伤疾病的作用靶点与功效成分的作用靶点共有178个交集靶点。由图1B可知，通过拓扑学分析，最终得到了Degree、Betweenness、Closeness值排名前五的核心潜在靶点，分别是肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）、JUN原癌基因（JunProto-Oncogene，JUN）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸激酶1（RAC-alpha serine/threonine kinase 1，AKT1）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）。其中，TP53、AKT1、JUN、STAT3、ESR1的Degree 值分别为33、35、24、13、15；Betweenness值分别为0.210、0.126、0.114、0.090、0.071；Closeness值分别为0.461、0.462、0.442、0.440、0.437。
已有研究证明这5个核心潜在靶点在肝损伤疾病中发挥的作用，BUITRAGO-MOLINA L E等[29]研究发现，在代谢性肝损伤模型中，TP53的缺失会损害氧化应激反应并加重肝损伤，表明TP53对肝细胞具有直接的依赖性保护作用。陈欣黎等[30]研究发现，激活STAT3可直接或间接诱导肝细胞内细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）及细胞周期蛋白E（Cyclin E）的表达，并促进肝细胞增殖，加快损伤肝脏的修复速度。此外，STAT3还能通过调节糖类和脂质代谢来维持机体内环境稳态[31]。编码α-1抗胰蛋白酶（alpha-1 antitrypsin，AAT）serpin家族成员1（serpin family a member 1，SERPINA1）基因的突变会引起α-1抗胰蛋白酶缺乏症（alpha-1 antitrypsin deficiency，AATD），导致AAT滞留在肝细胞内质网中，从而导致蛋白毒性肝损伤[32]。JUN已被证明与C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）协同上调SERPINA1，从而加重由SERPINA1的Z等位基因编码突变引起肝脏功能损伤[33]。
2.3 共有靶点的GO功能与KEGG信号通路富集分析
将178个共有靶点导入DAVID数据库进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，以P＜0.05作为筛选条件，根据P值从小到大排序，GO功能富集分析结果分别选取排名前十的BP、CC、MF条目进行分析，结果见图2。
图2 竹叶青酒缓解急性肝损伤疾病潜在靶点GO功能富集分析结果
Fig.2 GO functional enrichment analysis results of potential targets of acute liver injury disease alleviation by Zhuyeqing liquor
由图2可知，BP结果主要涉及对异生物刺激的反应、细胞凋亡过程的负调控、基因表达的正调控等生物过程；CC主要涉及受体复合物、细胞外间隙、质膜微囊、胞浆等细胞组成部分；MF主要涉及酶结合、相同蛋白质结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等分子功能。同样地，选取排名前十的通路进行分析，结果见图3。
图3 竹叶青酒缓解急性肝损伤疾病潜在靶点KEGG信号通路富集分析结果
Fig.3 KEGG enrichment analysis results of potential targets of acute liver injury disease alleviation by Zhuyeqing liquor
由图3可知，178个共有靶点主要富集在抑制其蛋白表达会加重死亡受体介导的肝细胞凋亡和肝损伤的PI3KAKT信号通路[34]，可诱导免疫激活和免疫调节细胞因子产生的Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）信号通路[35]，诱导肝细胞凋亡和坏死、肝脏炎症和再生的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路[36]，与降低肝细胞凋亡蛋白表达相关的蛋白酪氨酸激酶-信号传导子及转录激活因子（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）信号通路[37]，及与肝损伤、肝纤维化和肝细胞癌相关的活化B细胞的核因子kappa轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）等信号通路上[38]。
2.4 竹叶青酒“功效成分-潜在靶点-作用通路”网络图构建
通过Cytoscape 3.7.2软件构建“潜在成分-潜在靶点-作用通路”的网络。通过拓扑学研究发现，竹叶青酒中Degree值排名前六的关键功效成分为柚皮素（Degree=55）、金合欢素（Degree=46）、京尼平（Degree=34）、山柰酚（Degree=32）、苜蓿素（Degree=13）、川陈皮素（Degree=10）。在此基础上，进一步去除其他成分节点上的靶点与通路后，重新绘制“功效成分-潜在靶点-作用通路”图，结果见图4。由图4可知，“功效成分-潜在靶点-作用靶点”网络图中共包含115节点和304条边。拓扑学分析发现，Degree值排名前五的通路为PI3K-AKT信号通路（Degree=23）、MAPK信号通路（De gree=18）、TNF信号通路（Degree=16）、Toll样受体信号通路（Degree=12）、JAK-STAT信号通路（Degree=10）。结果表明，竹叶青酒可能以柚皮素、金合欢素、京尼平等为关键成分，作用于TP53、AKT1、JUN等核心潜在靶点，通过调控PI3K-AKT、NF-κB、JAK-STAT等信号通路，发挥缓解急性肝损伤的作用。
图4 竹叶青酒缓解肝损伤“功效成分-潜在靶点-作用通路”网络图
Fig.4 "Functional component-potential targets-action pathway"network diagram of liver injury alleviation by Zhuyeqing liquor
有研究表明，柚皮素可通过减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生来降低脂质过氧化，并回调阿霉素诱导的肝功能损伤降低的抗氧化酶水平，如过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶等，从而发挥显著的保肝作用[39]。此外，也有研究发现，柚皮素可通过调节MAPK、PI3K-AKT等靶点，阻断氧化应激、炎症反应来预防或治疗脏器纤维化，柚皮素调控与上述信号分子相关的信号通路有望成为治疗肝纤维化新型的方法[40]。京尼平是栀子中含量最丰富的环烯醚萜苷成分，因其具有多功能特性，在预防和治疗肝病疾病方面一直是研究的热点[41]。有研究表明，京尼平通过抑制NF-κB和STAT3信号通路来减弱四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱导的小鼠肝损伤的炎症反应[42]。
金合欢素是一种具有抗炎和抗癌活性的有效成分，存在于菊花、金合欢树等植物中，其在肝脏保护中也表现出一定的药理学潜力[43]。通过评估炎症介质（肿瘤因子-α，白介素-1β）及血清转氨酶（丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶）的水平揭示了金合欢素对缺血再灌注引起的肝损伤小鼠具有恢复作用[44]。此外，金合欢素可通过抗炎、增强机体谷胱甘肽（glutathione，GSH）系统功能、抑制自由基和脂质过氧化物的产生，起到对肝细胞的保护作用[45]。在抗肿瘤作用机制方面，金合欢素的研究已较为成熟，主要通过抑制肿瘤细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达和AKT通路[46]，与本研究中聚焦的基因和通路存在部分重叠。因此，推测金合欢素也可能具有相似的治疗机制。
2.5 关键功效成分与核心潜在靶点分子对接验证结果
竹叶青酒关键功效成分与核心潜在靶点分子对接结果的对接结合能、氢键和疏水键信息见表2。采用PyMOL软件对关键功效成分与核心潜在靶点亲和力最优组合的氢键情况进行可视化处理，结果见图5。
图5 竹叶青酒关键功效成分与核心潜在靶点结合的可视化情况
Fig.5 Visualization of combination of key functional components and core potential targets in Zhuyeqing liquor
A：金合欢素与3CQU；B：京尼平与5AX3；；C：柚皮素与3CQU；D：山柰酚与5AX3；E：川陈皮素与2AYR；F：苜蓿素与1A1E。
表2 竹叶青酒关键功效成分与核心潜在靶点对接结合能、氢键和疏水键信息
Table 2 Binding energy, hydrogen bond and hydrophobic bond of key functional components and core potential targets in Zhuyeqing liquor
化合物 蛋白质 结合能/（kcal·mol-1）金合欢素京尼平山柰酚柚皮素川陈皮素1H10（AKT1）3CQU（AKT1）1A52（ESR1）2AYR（ESR1）1A02（JUN）6Y3V（JUN）1A1U（TP53）1A1E（TP53）5AX3（STAT3）5U5S（STAT3）1H10（AKT1）3CQU（AKT1）1A52（ESR1）2AYR（ESR1）1A02（JUN）6Y3V（JUN）1A1U（TP53）1A1E（TP53）5AX3（STAT3）5U5S（STAT3）1H10（AKT1）3CQU（AKT1）1A52（ESR1）2AYR（ESR1）1A02（JUN）6Y3V（JUN）1A1U（TP53）1A1E（TP53）5AX3（STAT3）5U5S（STAT3）1H10（AKT1）3CQU（AKT1）1A52（ESR1）2AYR（ESR1）1A02（JUN）6Y3V（JUN）1A1U（TP53）1A1E（TP53）5AX3（STAT3）5U5S（STAT3）1H10（AKT1）3CQU（AKT1）1A52（ESR1）2AYR（ESR1）-6.18-7.53-5.77-7.31-7.45-4.80-5.90-5.87-7.45-6.40-5.74-6.72-4.35-6.65-5.41-3.92-4.37-5.61-7.47-5.28-6.50-7.54-5.77-7.27-6.50-5.27-5.57-5.93-8.51-5.31-6.68-7.48-5.81-7.14-6.95-5.67-4.84-5.42-7.13-6.43-5.71-6.65-5.84-7.10氢键数量结合位点3 5 3 4 1 2 4 2 3 2 2 2 2 1 1 3 1 2 2 1 4 3 3 3 1 5 3 4 4 3 4 5 4 4 3 5 2 3 5 2 3 5 5 4 Ser56,Gln61,Arg76 Gly373,Thr371,Met343,Arg243,Glu247 Ser433,Lys472,Gln506 Asp332,Ala340,Gly344,Asn348 Arg537 Tyr19,Glu20 Lys40,Tyr44,Lys51,Asp52 Phe328,Leu330 Arg139,Thr181,Tyr184 Pro28,Lys31 Glu17,Thr87 Thr160,Ile180 Gly400,Asp426 Asn532 Arg421 Tyr130,Asn175,Asn226 Glu43 Leu330,Ile332 Arg185,Ile189 Asp34 Ser56,Gln59,Gln61,Arg76 Thr5,Lys158,Lys276 Asp332,Ala340,Gly344 Thr347,Glu353,Arg394 Ser429 Glu17,Tyr19,Asp21,Val51,Gln55 Arg37,Lys51,Asp52 Glu326,Thr329,Asn345,Glu349 Arg182,Arg185,Asp140,Leu175 HIis9,Ser19,Arg106 Lys8,His89,Glu91,Glu98 His207,Leu210,Thr211,Leu213,Arg206 Asp351,Val376,Tyr526,Lys529 Glu353,Leu387,Arg394,Gly521 Arg282,Ala524,Arg537 Tyr19,Glu20,Asn50,Gln55,Glu91 Gln31,Lys40 Glu326,Leu330,Phe341 Asp140,Leu141,Arg182,Arg185,Met190 Lys31,Gln288 Lys39,Glu40,Leu52 His207,Ala212,Glu228,Lys289,Lys419 Ala307,Lys362,Gly366,Val368,Asp369 Glu380,Trp383,Val533,A5n532疏水键数量 结合位点2 4 2 4 0 4 3 4 4 4 2 3 2 2 1 1 4 2 3 2 3 4 3 3 0 2 3 2 4 4 3 2 5 3 2 3 4 5 3 4 1 2 1 2 Ala58,Leu78 Val244,Glu247,Pro369,Leu372 Arg434,His476 Tyr331,Arg335,Phe337,Leu345/Tyr19,Glu20,Asn50,Val51 Ile41.Tyr44,Leu48 Leu330,Phe341,Leu344,Asn345 Val179,Arg182,Arg185,Ile189 Trp27,Tyr30,Asp34,Phe289 Arg15,Lys20 Leu181,Lys182,Val185 Leu429,Ala430 Lys531,Val533 148Lys 178Val Lys40,Ile41,Tyr44,Leu48 Ile332,Phe338 Val179,Arg182,Arg185 Trp27,Phe289 Ala58,Gln59,Leu78 Arg4,Phe161,Glu234,Glu278 Tyr331,Arg335,Phe337 Leu346,Ala350,Leu391/Arg18,Glu20 Ile32,Lys40,Tyr44 Tyr327,Phe328 Arg182,Arg185,Ile189,Leu191 Ile13,Lys15,Glu16,Arg106 Val90,Glu91,Glu95 Arg206,Leu210 Leu354,Leu379,Glu380,Trp383,Leu525 Ala350,Leu384,Leu525 Arg522,Asn523 Tyr19,Glu20,Val51 Ile32,Lys40,Ile41,Leu48 Phe328,Leu330,Ile332,Phe341,Asn345 Leu175,Val179,Arg185 Trp27,Tyr30,Leu38,Phe289 Leu52 Tyr417,Lys419 Ala318 Pro535,Leu536
续表
化合物 蛋白质 结合能/（kcal·mol-1）苜蓿素1A02（JUN）6Y3V（JUN）1A1U（TP53）1A1E（TP53）5AX3（STAT3）5U5S（STAT3）1H10（AKT1）3CQU（AKT1）1A52（ESR1）2AYR（ESR1）1A02（JUN）6Y3V（JUN）1A1U（TP53）1A1E（TP53）5AX3（STAT3）5U5S（STAT3）-6.93-5.32-4.99-5.1-5.77-6.04-5.94-6.19-5.73-6.00-6.05-4.39-4.52-7.13-5.76-6.49氢键数量结合位点4 3 3 1 5 3 5 3 6 5 4 3 3 2 5 4 His420,Arg421,Arg430,Lys434 Glu17,Tyr19,Glu20 Lys40,Lys51,Asp52 Leu330 Ser238,Glu240,Lys262,Thr285,Asn287 Lys31Asp34,Ser292 Leu62,Lys64,Glu97,Thr100,Thr101 Ser7,Lys276,Glu278 Arg394,Met396,Glu397,Asn439,Gln441,Gly442 Trp383,Met522,Lys529,Asn532,Val533 His420,Arg421,Arg430,Lys434 Glu17,Tyr19,Glu20 Lys40,Lys51,Asp52 Leu330,Glu349 Tyr119,Tyr122,Arg126,Gln305,Tyr306 Gln69,Arg76,Ala108,Asp112疏水键数量 结合位点2 0 2 0 1 1 2 2 3 2 2 1 3 0 3 2 Arg421,Ala574/Ile41,Tyr44/Phe286 Leu38 Leu62,Gln104 Arg4,Thr6 Trp393,Met396,Glu397 Tyr526,Lys529 Arg421,Ala574 Tyr19 Lys40,Tyr44,Leu48/Tyr122,Gln305,Lys352 Tyr107,Asp112
由表2及图5可知，6种关键功效成分与核心潜在靶点的对接结合能均＜-1.2 kcal/mol，表明分子与靶点结合性较好[47-48]。以山柰酚与靶点5AX3对接结果为例，山柰酚与靶点5AX3的结合能为-8.51 kcal/mol，通过与靶点5AX3的ASP-140、LEU-175、ARG-182、ARG-185四个氨基酸残基共形成4个氢建。
3 结论
本研究采用网络药理学结合UPLC-TOF-MS/MS分析及分子对接技术相结合的方法，探究了竹叶青酒缓解急性肝损伤的潜在功效成分及作用潜在靶点和作用通路。结果发现，竹叶青酒中可能以柚皮素、京尼平、金合欢素、山奈酚、川陈皮素、苜蓿素为关键功效成分，作用于PI3K-AKT、JAK-STAT、TLRs、TNF、MAPK信号通路上的AKT1、STAT3、JUN、TP53、ESR1靶点发挥缓解急性肝损伤的作用。竹叶青酒对急性肝损伤的缓解作用机制涉及多种功效成分、多个作用靶点以及多条作用通路，体现了中药多成分、多靶点的特点，但是对于这些成分确切的功效及作用机制还需进一步用细胞或动物实验进行验证。本研究为进一步阐释竹叶青酒保健功效物质基础及健康机理提供了参考依据。
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