随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，人们越来越注重管理和维护自己的“美丽”和健康[1]。工业发展和城市化产生的粉尘、PM2.5以及臭氧层破坏紫外线增多等因素，致使人们的皮肤损伤、颜色加重等[2]。因此，人们对皮肤护理越来越重视，需求崇尚安全性高、天然无刺激，具有美白护肤功能的化妆品越来越受到人们青睐[3]。
人体的皮肤颜色除了遗传因素外，紫外光的生物感受性是导致肤色差异的主要原因[4]。当紫外光照射人体时，皮肤会产生黑色素以保护皮肤组织[5]，黑色素的过量积累会导致皮肤色素沉着，严重时可能会演变为皮肤黑色素瘤等疾病。酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）是黑色素合成代谢的关键酶，TYR活性直接决定黑色素形成量的多少[6]。同时，紫外光暴露，皮肤会产生活性氧自由基，也促进黑色素的氧化聚合[7]。因此，化妆品对紫外光的吸收能力、抗氧化能力和抑制TYR活性能力是评价化妆品美白功效性的常用指标[8]。
近年来，寻找一种具有美白功能的天然产物成为化妆品行业的研究热点[9]。啤酒废酵母（Brewer's Spent Yeast，BSY）是啤酒制造产生的副产品，每生产1 000 t啤酒约产生15～18 t BSY[10]，因BSY产量大且价格低廉等因素，一直被作为饲料、食品辅料等使用[11-12]，严重制约了其高价值开发利用。彭颖等[13]研究了酵母抽提物中谷胱甘肽的美白活性，结果表明，其强于熊果苷且与维生素C相近；FUKUNAGA S等[14]证实酵母提取物中的神经酰胺等成分可抑制黑色素生成；SEO J W等[15]的实验结果表明，浆果中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）FT4-4提取物具有较高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性、酪氨酸酶抑制活性，对皮肤美白作用显著；JO D U等[16]的研究表明，发酵韩国传统白酒的酵母残渣提取物是酪氨酸酶的竞争性抑制剂，能用来生产皮肤美白剂。BSY及提取物安全性高，富含蛋白质、谷胱甘肽、酚类等营养物质，具有延缓衰老、抗氧化、抑制肿瘤等多种功能[17-20]，而研究BSY全提取物在护肤化妆品领域的应用研究却鲜有报道。
评价天然产物的功能性较为常见的方法是使用不同极性溶剂提取天然产物中的有效成分[21-23]，综合评价相应性质。本研究以BSY为实验材料，通过乙醇浸提并浓缩得BSY醇提物浸膏（BSY alcohol extract，BSYAE），以萃取率为评价指标，采用单因素及响应面试验对其提取工艺进行优化，并使用不同极性溶剂进行萃取，测定其对紫外线的吸收能力、TYR活性抑制能力和抗氧化能力等，评价其美白效果。以期为进一步开发利用BSY资源提供理论支持，促进BSY的功能性研究和啤酒工业产业链的健康发展具有重要的现实意义和应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
BSY：按照张军等[24]的方法制备，由本校食品与化工学院精酿啤酒实训中心提供；无水乙醇（分析纯）、酒石酸（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；无水磷酸二氢钠（分析纯）、无水磷酸氢二钠（分析纯）、过二硫酸钾（分析纯）、L-酪氨酸（纯度99%）、酪氨酸酶（≥500 U/mg）、2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）（纯度均≥98.0%）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BS210S电子天平：德国Sartorius公司；T2602紫外分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；RE-5C旋转蒸发器：巩义市予华仪器有限责任公司；HC-3018R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；PHSJ-3F pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 BSYAE乙醇提取条件优化单因素试验
参照罗依雨等[25]的方法，称取2 g BSY于50 mL烧杯中，在一定条件下于水浴锅浸提，浸提完成后于4 000 r/min离心10 min，上清液使用减压旋转蒸发仪30 ℃条件下浓缩，即得BSY醇提物浸膏（BSYAE），4 ℃冰箱保存备用。分别考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL），提取温度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）、乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）、提取时间（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）对BSYAE提取率的影响。
1.3.2 BSYAE乙醇提取条件优化响应面试验
在单因素试验的基础上，以BSYAE提取率（P）为考察指标，选取3个对BSYAE提取率影响较显著的因素乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取温度（C），按照Design Expert 8.0.6软件设计3因素3水平试验，响应面试验因素与水平如表1所示。
表1 啤酒废酵母醇提物浸膏提取条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test for brewer's spent yeast alcohol extract extraction condition optimization
水平 A 乙醇体积分数/% B 料液比（g∶mL） C 提取温度/℃1 2 3 70 80 90 1∶20 1∶25 1∶30 50 60 70
1.3.3 不同极性溶剂BSYAE萃取物制备
参照许倩倩[26]的方法稍作修改，将BSYAE搅拌并超声使其完全溶于蒸馏水，分别加入等体积的萃取剂（乙醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯）振荡混合均匀，置室温条件下30 min后至两相完全分离，取上清液待用；同样方法提取下层沉淀物3次。汇集所得清液后减压旋转蒸发即得BSYAE不同极性溶剂萃取物。
1.3.4 测定方法
（1）BSYAE提取率
（2）BSYAE不同极性溶剂萃取物的抗紫外线能力测定
参照高子怡等[27]的方法，稍作修改。通过测定BSYAE不同极性溶剂萃取物在紫外线C区（ultraviolet C，UVC）（200～280 nm）、UVB区（280～320 nm）和UVA区（320～400 nm）的紫外线透过率评价抗紫外线能力，计算紫外线吸收率，其计算公式如下：
紫外线吸收率=（1-透过率）×100%
（2）BSYAE不同极性溶剂萃取物抗氧化活性测定
ABTS+、DPPH自由基清除能力测定参照张军等[24]的试验方法。
（3）BSYAE不同极性溶剂萃取物对TYR活性抑制测定
参照LI J X等[28]的方法并稍作修改。分别取1 mLBSYAE不同极性溶剂萃取物样品、磷酸缓冲液（pH 6.8）、0.03%酪氨酸溶液于试管中，置37 ℃水浴10 min后加入1 mL酪氨酸酶溶液，混合均匀后静置25 min，用分光光度计测波长475 nm处的吸光度值（A1），以等体积的磷酸缓冲液代替酪氨酸酶测波长475 nm处的吸光度值（A2）；以等体积蒸馏水代替样品测波长475 nm处的吸光度值（B1），以等体积磷酸缓冲液代替酪氨酸酶溶液测波长475 nm处的吸光度值（B2）。计算样品对酪氨酸酶的抑制率，其计算公式如下：
1.3.5 数据处理
试验中所有样品均进行3次平行试验，使用Microsoft Excel 2019进行数据收集和处理、采用Design Expert 12.0软件对响应面优化试验结果进行回归及分析，采用Origin 2020进行绘图。
2 结果与分析
2.1 BSYAE乙醇提取条件优化单因素试验
2.1.1 乙醇体积分数对BSYAE提取率的影响
由图1可知，随着乙醇体积分数的增大，BSYAE提取率呈先上升后下降的趋势；当乙醇体积分数为80%时，BSYAE提取率达到最高为35.44%，与其他水平存在显著性差异（P＜0.05）；这可能是因为BSY中物质种类多，极性范围广，不同体积分数乙醇的极性也不同，而80%乙醇溶液的极性（溶解性）最有利于亲水型、多羟基产物在溶剂中溶出[29]。因此，选择乙醇体积分数80%进行后续试验。
图1 乙醇体积分数对啤酒废酵母醇提物浸膏提取率的影响
Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rates of brewer's spent yeast alcohol extract
2.1.2 料液比对BSYAE提取率的影响
由图2可知，随着料液比的减小，BSYAE提取率呈先上升后下降的趋势；当料液比达到1∶25（g∶mL）时，BSYAE提取率达到最高为35.97%，与其他水平存在显著性差异（P＜0.05）；这可能是因为随着提取溶剂体积的增大，单位料样所接触到提取溶剂的有效面积增加，酵母细胞溶胀作用增强，溶出物增加；但当料液比超过1∶25（g∶mL）时，单位料样接触到的有效提取溶剂减少，酵母亲水成分溶出有所降低，粒子之间的碰撞减弱，溶剂用量不再对萃取率有促进作用，且提取溶剂体积过大增加了下一步的旋转蒸发难度，造成时间和能源的浪费，综合考虑提取效果和提取剂成本，选择料液比为1∶25（g∶mL）进行后续试验。
图2 料液比对啤酒废酵母醇提物浸膏提取率的影响
Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rates of brewer's spent yeast alcohol extract
2.1.3 提取温度对BSYAE提取率的影响
由图3可知，随着提取温度的升高，BSYAE提取率呈现出先上升后下降的变化趋势；当提取温度达到60℃时，BSYAE提取率达到最高为31.11%，与其他水平存在显著性差异（P＜0.05）；这可能是由于温度升高使提取溶液黏度减小，分子运动速率加快，促使提取溶剂渗入到BSY细胞内使其溶胀破裂，成分溶出增多；但当温度过高时，可造成BSY溶出物分子结构破坏、氧化等，同时，温度过高也会导致乙醇挥发过多，料液比加大，导致萃取率降低[25]。因此，选择提取温度60 ℃进行后续试验。
图3 提取温度对啤酒废酵母醇提物浸膏提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rates of brewer's spent yeast alcohol extract
2.1.4 提取时间对BSYAE提取率的影响
由图4可知，随着提取时间的延长，BSYAE提取率呈现出先上升后下降的变化趋势；提取率从23.52%增加至35.84%，在提取时间为2 h时，BSYAE提取率达到最高为35.84%，与其他水平存在显著性差异（P＜0.05）；这可能是在一定的提取时间内，提取物从BSY内渗出并基本达到平衡，过度延长提取时间、加热时间过长，导致提取物成分氧化、分解[30]。因此，选择提取时间2 h进行后续试验。
图4 提取时间对啤酒废酵母醇提物浸膏提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on extraction rates of brewer’s spent yeast alcohol extract
2.2 BSYAE乙醇提取条件优化响应面试验
2.2.1 响应面试验设计结果与方差分析
BSYAE乙醇提取条件优化响应面试验设计及结果见表2，方差分析见表3。
表2 啤酒废酵母醇提物浸膏提取条件优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface test for brewer's spent yeast alcohol extract extraction condition optimization
试验号 A 乙醇体积分数/%B 料液比（g∶mL）C 提取温度/℃P BSYAE提取率/%1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 70 70 90 90 80 80 80 80 70 90 70 90 80 80 80 80 80 1∶20 1∶30 1∶20 1∶30 1∶20 1∶30 1∶20 1∶30 1∶25 1∶25 1∶25 1∶25 1∶25 1∶25 1∶25 1∶25 1∶25 60 60 60 60 50 50 70 70 50 50 70 70 60 60 60 60 60 30.39 32.58 28.77 33.98 30.79 34.65 28.41 29.12 30.95 30.12 27.92 24.89 36.91 37.12 36.42 36.12 37.21
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著
（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B********AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总离差228.89 2.08 17.91 32.68 2.28 1.21 2.48 60.78 9.81 84.76 3.55 2.67 0.88 232.44 91111111117341 6 25.43 2.08 17.91 32.68 2.28 1.21 2.48 60.78 9.81 84.76 0.51 0.89 0.22 50.11 4.10 35.29 64.4 4.49 2.38 4.89 119.76 19.34 167.03＜0.000 1＜0.01＜0.01＜0.01＜0.05＜0.05＜0.01＜0.000 1＜0.01＜0.000 1**********4.05 0.105不显著
采用Design-Expert 8.0.6软件对表3的BSYAE提取率数据进行多元回归分析，得到响应值P与3个因素之间拟合的多元二次回归方程：
由表3可知，拟合模型F值为50.11（P＜0.000 1）极显著，说明此模型各因素与响应值之间相关性极强，即此试验模型能够正确反映BSYAE提取率与乙醇体积分数、料液比、提取温度的关系，可用于BSYAE提取及预测；模型失拟项P=0.105＞0.05，表明回归模型拟合度良好；决定系数R2=0.994 7，变异系数（coefficient of variation，CV）=5.14%，表明试验值与预测值之间相关程度较高，试验值精确、可靠。由P值可知，一次项A、B、C，交互项BC，二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01）；交互项AB、AC对结果影响显著（P＜0.05）。依据F值进行判断，各因素对BSYAE提取率的影响大小顺序依次为C＞B＞A，即提取温度＞料液比＞乙醇体积分数。
2.2.2 各因素间交互作用响应面分析
乙醇体积分数、料液比、提取温度交互作用对BSYAE提取率的影响如图5所示。
图5 料液比、乙醇体积分数和提取温度间交互作用对啤酒废酵母乙醇提取物提取率影响的响应面及等高线图
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between solid-liquid ratio, ethanol volume fraction and extraction temperature on brewer's spent yeast alcohol extract extraction rates
由图5可以看出，响应曲面都是向下开口的凸型曲面，即BSYAE提取率有最大值；交互作用的等高线图呈现出椭圆形，表明这两个因素交互作用明显。料液比和乙醇浓度、料液比和提取温度的响应曲面投影线图呈现椭圆，说明两者交互作用显著（P＜0.05）；乙醇浓度和提取温度的响应曲面投影线图呈现接近圆形，说明两者交互作用极显著（P＜0.01）；该结果与响应面试验方差分析结果一致。
2.2.3 最佳提取条件的确定与验证试验
通过Design Expert 12.0软件得到最佳提取条件为料液比1∶27.99（g∶mL）、乙醇体积分数78.62%、提取温度57.08 ℃，此条件下BSYAE提取率理论值为37.36%。为了方便实际操作，修改提取条件为料液比1∶28（g∶mL）、乙醇体积分数79%、提取温度57 ℃，在此条件下进行验证试验，所得到的BSYAE提取率为38.1%，与回归模型预测理论值比较接近，说明拟合方程和模型可靠度较高，利用响应面法分析得出的最优工艺参数可靠。
2.3 不同溶剂萃取BSYAE提取物紫外吸收试验
BSYAE经过不同极性溶剂萃取后对紫外光的吸收能力实验结果见图6。
图6 不同溶剂萃取啤酒废酵母醇提物浸膏的紫外吸收能力
Fig.6 UV absorption ability of brewer's spent yeast alcohol extract extracted with different solvents
由图6可知，在乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取溶剂浓度相同的情况下，在UVC 区（波长200～280 nm），乙酸乙酯提取物的紫外吸收能力相对较弱，紫外吸收率为70.7%，乙醇、正丁醇、石油醚BSYAE提取物的紫外吸收能力较强，紫外吸收率都在95%以上，UVC 区紫外光基本都被吸收；在UVB区（波长280～320 nm），4种溶剂BSYAE提取物的紫外吸收能力有不同程度的减弱，其中正丁醇、石油醚相的BSYAE提取物对中波紫外线仍然能保持较高的吸收，紫外吸收率都在92%以上；在UVA区（波长320～400 nm），仅有石油醚BSYAE的提取物紫外吸收率仍然保持在87.01%。在三个紫外波长区，石油醚相BSYAE提取物的紫外吸收率都在87%以上，具有较强的美白防晒作用，乙醇、正丁醇相BSYAE提取物也有一定防晒护肤作用。此结论与刘峻熙等[31]的结论类似。
2.4 不同溶剂萃取BSYAE提取物抗氧化活性
不同极性溶剂萃取BSYAE产物抗氧化活性测定结果见图7。
图7 不同溶剂萃取啤酒废酵母醇提物浸膏的抗氧化活性
Fig.7 Antioxidant activity of brewer's spent yeast alcohol extract extracted with different solvents
由图7可知，4种溶剂萃取BSYAE提取物的ABTS+、DPPH自由基清除率随底物浓度的增加而增加。不同溶剂萃取BSYAE提取物质量浓度为2.0 mg/mL时，各样品对ABTS+·清除率大小依次为乙醇提取物（96.49%）＞乙酸乙酯提取物（94.47%）＞正丁醇提取物（80.72%）＞石油醚提取物（41.21%）；各样品对DPPH·清除率大小依次为乙酸乙酯提取物（93.49%）＞石油醚提取物（91.21%）＞乙醇提取物（85.47%）＞正丁醇提取物（58.72%）。
2.5 不同溶剂萃取BSYAE提取物对TYR抑制作用
不同溶剂萃取BSYAE提取物对酪氨酸酶抑制作用见图8。
图8 不同溶剂萃取啤酒废酵母醇提物浸膏对酪氨酸酶的抑制率
Fig.8 Inhibition rate of brewer's spent yeast alcohol extract extracted with different solvents
由图8可知，4种不同溶剂萃取BSYAE提取物对抑制率随浓度的增加而增加，不同溶剂萃取BSYAE提取物质量浓度为2.0 mg/mL时，对TYR抑制率大小依次为石油醚提取物（33.29%）＞正丁醇提取物（32.93%）＞乙醇提取物（21.67%）＞乙酸乙酯提取物（12.41%），表明不同溶剂萃取BSYAE提取物能够有一定抑制TYR活性的作用，进而抑制黑色素的生成，具有美白功效。
3 结论
BSYAE提取的最佳条件为料液比1∶28（g∶mL）、乙醇体积分数79%、提取温度57 ℃，在此优化条件下所得到的BSYAE提取率为38.1%。BSYAE不同极性部位提取物的紫外吸收试验证明对紫外线均有吸收效果，石油醚提取物紫外吸收率都在87.01%以上，乙酸乙酯萃取部位对紫外线的吸收能力相对最低。抗氧化结果表明，乙醇提取物质量浓度为2.0 mg/mL时ABTS+·清除率最高为96.49%，ABTS+·清除率总体大小依次为乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油提取物。DPPH·清除率试验中底物质量浓度为2.0 mg/mL时，乙酸乙酯相清除率最高为93.49%，DPPH·清除率大小（平均）依次为乙酸乙酯提取物＞石油提取物＞乙醇提取物＞正丁醇提取物。抑制TYR活性试验结果表明，4种不同溶剂提取物均表现出TYR抑制作用，石油醚提取物抑制能力最显著，达到33.29%，正丁醇提取物次之，乙酸乙酯BSYAE提取物对酪氨酸酶抑制能力较差。因此，本研究结果可为BSY提取物在护肤化妆品中的应用提供指导，可用于美白护肤产品的研发。
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