食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物为主要原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人来食用的酵素产品[1]。因其独特的风味和营养价值，受到越来越多的关注。酵素发酵不仅可以利用果蔬原料中的营养成分，积累有机酸、氨基酸、挥发性风味物质等风味化合物，赋予发酵其丰富的滋味和香气感官特征，而且通过微生物发酵产生新的次生代谢物及活性成分，可满足人们对口感、风味、营养以及健康功能的需求[2-3]。苹果经微生物发酵可将大分子活性物质转化为小分子营养成分，有利于人体吸收，发酵后含有丰富的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等功效酶及较强的抗氧化能力[4-5]。目前，有关苹果酵素的研究大多集中在自然发酵的工艺优化[6]、代谢产物分析[7]及活性物质的变化[8]等方面，然而自然发酵酵素的菌种混杂多样，可能会有一些杂菌参与发酵过程，致使发酵进程受到诸多不可控因素的影响，难以保证产品质量[9-10]，因而开展特定益生菌发酵生产植物酵素产品以提高其品质和发酵过程中的可控性成为人们关注的焦点，菌种及其发酵性能是决定发酵过程可控程度的重要因素，并严重影响产品的品质[11]。
酵母菌和乳酸菌兼具益生菌和发酵特性，可以提升发酵产品的风味、口感、营养和保存期，并降低有害成分的含量，是食用植物酵素的优良发酵菌剂[12-14]。研究表明，费比恩塞伯林德纳氏酵母（Cyberlindnera fabianii）作为优良的生香、产酯菌株，有利于生产风味佳、品质高的发酵产品，广泛应用于食品工业中[15]；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）有利于积累有机酸、氨基酸和生物活性物质[16]；戊糖乳植物杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）和肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）不仅可以改善混菌发酵黄瓜汁的感官品质和延长保藏期，而且其代谢产物对人体健康起促进作用[17]，但相关菌种在苹果酵素发酵中的应用研究较少。为了提高苹果酵素产品质量和风味品质，在前期研究中[18]，通过比较发酵液pH、总酸和可溶性糖等的变化，确定采用费比恩塞伯林德纳氏酵母、酿酒酵母、戊糖乳植物杆菌和肠膜明串珠菌混菌发酵生产苹果酵素。本研究通过单因素及响应面试验探究混菌发酵条件对苹果酵素品质的影响，以期为苹果酵素产品质量控制和指导生产实践提供部分理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
富士苹果：2023年10月上旬采收自甘肃省平凉市苹果试验基地，果实完好无损，无病虫害；酵母菌（费比恩塞伯林德纳氏酵母（Cyberlindnera fabianii）（Cf）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Sc）），乳酸菌（戊糖乳植物杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）（Lp）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）（Lm））：中国食品发酵工业研究院有限公司。
1.1.2 培养基
MRS培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.1.3 试剂
NaOH、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA·2Na）（均为分析纯）：中瑞化学试剂公司。
1.2 仪器与设备
GS-MFC4005S四联5L平行生物反应器：上海顾信生物科技有限公司；SpectraMax190酶标仪：美国Molecular Devices Corporation（MDC）公司；LRH-70型恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-LS-75G型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；CARY 100紫外-可见分光光度计：美国瓦里安有限公司；TGL-16LM高速冷冻离心机：湖南星科科学仪器有限公司；MDF-U3386S超低温冰箱：青岛海尔集团；DL-CJ-1N超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；PB-10型精密pH计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种活化
分别取甘油管中保存的酵母菌和乳酸菌各50 μL涂布于YPD、MRS固体培养基上，酵母菌于28 ℃培养48～72 h、乳酸菌于37 ℃培养24 h后，挑取单菌落，相同条件传代液体培养得到酵母菌和乳酸菌活化液，将菌体活化液于4 ℃、5 000 r/min离心10 min，取菌泥用等体积蒸馏水重悬清洗3次，备用；Cf菌液浓度为5.47×106 CFU/mL、Sc菌液浓度为7.96×106 CFU/mL，Lp菌液浓度为1.61×108 CFU/mL、Lm菌液浓度为1.75×108 CFU/mL。
1.3.2 苹果酵素制备工艺流程及操作要点
操作要点[19]：新鲜苹果用纯净水冲洗干净，沥干水分后去核并切分成厚度3～5 mm的片，冰糖以及相关试验用器皿均紫外辐照处理30 min，将苹果片与纯净水按料液比200∶1（g∶L）加入5 L生物反应器中；添加冰糖调节糖度至15.0°Bx，添加柠檬酸调节pH至4.5。接种3%活化后的Cf、Sc混合菌液（Cf∶Sc=1.0∶0.2（V/V）），于（24±1）℃条件下发酵20 d；碳酸钠调节pH至5.0，接种5%活化后的Lp、Lm混合菌液（Lp∶Lm=1∶1（V/V）），于（33±1）℃条件下发酵10 d；分别取样，-80 ℃保存待检测。
1.3.3 苹果酵素混菌发酵工艺优化单因素试验
酵母菌发酵阶段：固定酵母菌接种量3%、酵母菌菌种比例（Cf∶Sc=1.0∶0.3）、发酵温度28 ℃、初始pH 4.5；乳酸菌接种量5%、乳酸菌菌种比例（Lp∶Lm=1.0∶1.5）、发酵温度37 ℃、初始pH 5.0。分别考察酵母菌接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、酵母菌菌种比例（Cf∶Sc）（1.0∶0.1、1.0∶0.2、1.0∶0.3、1.0∶0.4、1.0∶0.5）、发酵温度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃）、初始pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）对苹果酵素品质的影响。
乳酸菌发酵阶段：固定酵母菌接种量3%、酵母菌菌种比例（Cf∶Sc=1.0∶0.3）、发酵温度28 ℃、初始pH 4.5；乳酸菌接种量5%、乳酸菌菌种比例（Lp∶Lm=1.0∶1.5）、发酵温度37 ℃、初始pH 5.0。分别考察乳酸菌接种量（3%、4%、5%、6%、7%）、菌种比例（Lp/Lm）（1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1∶2.5）、发酵温度（29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃、45 ℃）、初始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）对苹果酵素品质的影响。
1.3.4 苹果酵素多菌种发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken模型试验设计原理[20]，以酵母菌和乳酸菌的菌种比例（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和初始pH（D）为自变量，以苹果酵素酵母菌发酵优化阶段（Y1）和乳酸菌发酵优化阶段（Y2）的感官评分为响应值，进行4因素3水平响应面分析，试验重复3次，响应面试验因素与水平见表1。
表1 苹果酵素酵母菌和乳酸菌发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of apple Jiaosu by yeast and lactic acid bacteria
因素A 菌种比例B 接种量/%C 发酵温度/℃D 初始pH酵母菌发酵阶段-1 0 1乳酸菌发酵阶段-1 0 1 1.0∶0.1 2 20 4.0 1.0∶0.2 3 24 4.5 1.0∶0.3 4 28 5.0 1.0∶0.5 4 29 4.5 1.0∶1.0 5 33 5.0 1.0∶1.5 6 37 5.5
1.3.5 测定方法
pH值：采用pH计测定；可溶性固形物含量：采用糖度计测定；总酸含量：参照GB 12456—2021《食品中总酸的测定》方法测定；还原力（OD700 nm值）：参照LIU Q等[21]的方法测定；SOD活性：参照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》测定[22]。
感官评分：参照张海燕等[7]的方法略作改动，筛选出嗅觉、味觉优异经过培训的感官评定人员7人，从产品的色泽、组织状态、滋味、气味、杂质5个方面进行感官标度描述，取5项标度平均值赋分，满分10分，取7人的平均分。苹果酵素感官评分描述词标度见表2。
表2 苹果酵素感官评分描述词标度
Table 2 Sensory score descriptor scale of apple Jiaosu
注：10=极强，9=很强，8=有点强，7=强，6=强度中等，5=弱，4=有点弱，3=很弱，2=微弱，1=极弱。
项目 要求 标度/分色泽组织形态滋味气味杂质色泽清亮均匀，为淡褐红色液态口感细腻、绵滑，醇厚清爽无涩味、苦味、浓呛以及其他异味无正常视力可见外来杂质1～10 1～10 1～10 1～10 1～10
1.3.6 数据处理及分析
所有试验均重复3次。采用Microsoft Excel 2010、IBM SPSS 26和Design-Expert 8.0.6等数据分析软件进行数据分析处理、作图及响应面分析。
2 结果与分析
2.1 苹果酵素多菌种发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 菌种比例对苹果酵素品质的影响
菌种比例的变化会影响发酵产品的风味和品质[23]，酵母菌和乳酸菌在不同菌种比例下对苹果酵素品质指标的影响见图1。由图1A可知，随着酿酒酵母接种比例的升高，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均呈先升高后降低的趋势，可溶性固形物含量和pH均呈先降低后升高的趋势；当菌株Cf∶Sc为1.0∶0.2时，苹果酵素的SOD活性、感官评价、总酸含量、还原力均最高，分别为39.91 U/mL、7.65分、2.91 g/L和4.18，可溶性固形物含量和pH均最低，分别为5.50°Bx和4.02。因此选择酵母菌Cf∶Sc为1∶0.2进行后续试验。由图1B可知，随着肠膜明串珠菌接种比例的升高，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均呈先升高后降低的趋势，可溶性固形物含量和pH均呈先降低后升高的趋势；当菌株Lp∶Lm为1.0∶1.0时，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均最高，分别为52.69 U/mL、8.59、4.12 g/L和5.68，可溶性固形物含量和pH均最低，分别为3.2 °Bx和3.12。因此选择乳酸菌Lp∶Lm为1.0∶1.0进行后续试验。
图1 酵母菌（A）及乳酸菌（B）菌种比例对苹果酵素品质的影响
Fig.1 Effect of yeast (A) and lactic acid bacteria (B) proportion on apple Jiaosu quality
2.1.2 接种量对苹果酵素品质的影响
接种量是影响发酵进程中微生物生长繁殖的重要因素之一[24]。接种量对苹果酵素可溶性固形物、pH、总酸含量、还原力、SOD活性和感官评分等品质指标的影响见图2。由图2A可知，随着酵母菌接种量的升高，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均呈先升高后降低的趋势，可溶性固形物含量和pH均呈先降低后升高的趋势；当菌株Cf+Sc的接种量为3%时，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均最高，分别为35.13 U/mL、7.79、3.46 g/L和4.70，可溶性固形物含量和pH均最低，分别为4.30°Bx和4.07。因此选择酵母菌Cf+Sc接种量为3%进行后续试验。由图2B可以看出，随着乳酸菌接种量的变化，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均呈先升高后降低的趋势，可溶性固形物含量和pH均呈先降低后升高的趋势；当菌株Lp+Lm的接种量为5%时，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均最高，分别为43.15U/mL、8.21、4.56 g/L和5.42，可溶性固形物含量和pH均最低，分别为3.10°Bx和3.28。因此选择乳酸菌Lp+Lm接种量为5%进行后续试验。
图2 酵母菌（A）及乳酸菌（B）接种量对苹果酵素品质的影响
Fig.2 Effect of yeast (A) and lactic acid bacteria (B) inoculum on apple Jiaosu quality
2.1.3 发酵温度对苹果酵素品质的影响
发酵温度通过影响发酵进程中各种酶的活性和反应速率、发酵液的理化性质以及活性物质的合成方向进而影响发酵的动力学特性和产品品质，因此适宜的温度环境是保证发酵进程的重要因素之一[25]。由图3A可知，随着酵母菌发酵温度的升高，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均呈先升高后降低的趋势，可溶性固形物含量和pH均呈先降低后升高的趋势；当酵母菌发酵温度为24 ℃时，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均最高，分别为36.29 U/mL、7.53、2.94 g/L和3.71，可溶性固形物含量和pH均最低，分别为7.30°Bx和4.03。因此选择酵母菌发酵温度为24 ℃进行后续试验。由图3B可知，随着乳酸菌发酵温度的变化，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均呈先升高后降低的趋势，可溶性固形物含量和pH均呈先降低后升高的趋势；乳酸菌发酵温度为33 ℃时，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均最高，分别为48.29 U/mL、8.91、4.28 g/L和4.21，可溶性固形物含量和pH均最低，分别为3.70°Bx和3.16。因此选择乳酸菌发酵温度为33 ℃进行后续试验。
图3 酵母菌（A）及乳酸菌（B）发酵阶段发酵温度对苹果酵素品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on apple Jiaosu quality in fermentation stage of yeast (A) and lactic acid bacteria (B)
2.1.4 初始pH对苹果酵素品质的影响
初始pH的高低显著影响微生物菌体生长和代谢产物的合成，因此在食用酵素发酵中维持最适pH值是生产成功的关键因素之一[26]。由图4A可知，随着酵母菌发酵初始pH的变化，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均呈先升高后降低的趋势，可溶性固形物含量和pH均呈先降低后升高的趋势；当酵母菌发酵初始pH为4.5时，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均最高，分别为28.15 U/mL、7.96、3.62 g/L和3.76，可溶性固形物含量和pH均最低，分别为5.60°Bx和3.91。因此选择酵母菌发酵初始pH为4.5进行后续试验。由图4B可知，随着乳酸菌发酵初始pH的变化，苹果酵素的SOD活性、感官评价、总酸含量、还原力均呈先升高后降低的趋势，可溶性固形物含量和pH均呈先降低后升高的趋势；乳酸菌发酵初始pH为5.0时，苹果酵素的SOD活性、感官评分、总酸含量、还原力均最高，分别为46.37 U/mL、8.91、4.74 g/L和4.77，可溶性固形物含量和pH均最低，分别为3.30°Bx和3.12。因此选择乳酸菌发酵初始pH为5.0进行后续试验。
图4 酵母菌（A）及乳酸菌（B）发酵阶段初始pH对苹果酵素品质的影响
Fig.4 Effect of initial pH on apple Jiaosu quality in fermentation stage of yeast (A) and lactic acid bacteria (B)
2.2 苹果酵素多菌种发酵工艺优化响应面分析
2.2.1 响应面试验设计及结果
食用酵素作为一种功能性食品，感官品质是消费者青睐的重要依据之一[27]。响应面试验设计及结果见表3。
表3 苹果酵素酵母菌和乳酸菌发酵阶段工艺优化响应面试验设计与结果
Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation technology optimization of apple Jiaosu by yeast and lactic acid bacteria
试验号 A B C D Y1酵母菌感官评分/分Y2乳酸菌感官评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 0 -0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 --1-1 1-1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 7.28±0.35 6.36±0.14 5.21±0.39 8.01±0.22 6.88±0.13 9.65±0.12 5.59±0.58 6.01±0.27 6.82±0.11 7.34±0.32 7.38±0.36 6.14±0.56 8.12±0.33 5.56±0.41 9.66±0.16 6.23±0.23 7.39±0.42 7.14±0.33
续表
试验号 A B C D Y1酵母菌感官评分/分Y2乳酸菌感官评分/分10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29-1 1 0 01--1 11-1-1 1-1-1 000011-00001000001-00000-1000-1000-101-100-1-1-1 0-1 00010010000-10 1000-11 00 10001 8.33±0.33 7.38±0.51 8.62±0.16 8.12±0.54 5.15±0.18 6.96±0.32 7.57±0.15 7.33±0.21 9.62±0.24 9.69±0.34 7.83±0.37 6.83±0.22 9.328±0.29 8.34±0.13 6.96±0.11 7.53±0.34 9.18±0.25 8.13±0.15 6.45±0.36 8.99±0.28 6.88±0.53 5.38±0.43 7.66±0.22 4.38±0.27 7.22±0.65 7.19±0.18 5.12±0.66 6.14±0.28 9.33±0.11 9.52±0.19 7.12±0.46 7.35±0.21 9.38±0.36 5.98±0.22 5.33±0.28 4.14±0.20 9.42±0.58 7.98±0.12 5.35±0.09 8.12±0.27
2.2.2 回归模型的建立与方差分析
利用Design-Expert 8.0数据分析软件对表3数据进行多元回归拟合分析，得到苹果酵素酵母菌（Y1）和乳酸菌（Y2）发酵阶段感官评分对自变量菌种比例（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和初始pH（D）的二次多项回归模型方程分别为：
Y1=9.49-0.34A+0.36B-0.89C+0.51D-0.11AB-0.59AC+0.59AD-
0.24BC+0.54BD+0.33CD-1.06A2-1.72B2-0.85C2-0.11D2
Y2=9.69+0.66A+0.46B+0.47C+0.94D-0.38AB-0.71AC-0.86AD+0.13BC+0.45BD-0.49CD-1.13A2-1.74B2-1.75C2-1.71D2
进一步对回归模型进行方差分析，结果见表4。由表4可知，苹果酵素多菌种发酵酵母菌发酵阶段的回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项P值为0.498 1＞0.05，无显著性影响，决定系数R2=0.994 9，调整决定系数R2Adj=0.989 9，说明该模型能够解释99.49%的变化，能够较好地模拟苹果酵素多菌种发酵酵母菌发酵工艺；由P值可以看出，一次项A、B、C、D，交互项AC、AD、BC、BD、CD，二次项A2、B2、C2、D2对结果的影响均达到了极显著水平（P＜0.01），交互项AB对结果影响不显著（P＞0.05）；由F值可以看出，各因素对感官评价影响大小顺序为C＞D＞B＞A。乳酸菌发酵阶段回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项P值为0.764 1，影响不显著（P＞0.05），决定系数R2=0.990 9，调整决定系数R2Adj=0.981 9，说明预测值和试验值之间有较好的相关性，该模型能够解释99.93%的变化，对苹果酵素多菌种发酵乳酸菌发酵工艺优化试验拟合程度较好；由P值可以看出，一次项A、B、C、D，交互项AB、AC、AD、BD、CD，二次项A2、B2、C2、D2对结果的影响均达到了极显著水平（P＜0.01），交互项BC对结果影响不显著（P＞0.05）；由F值可以看出，各因素对感官评价影响大小顺序为D＞A＞C＞B。
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
变异来源模型ABCDA B AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总和酵母菌发酵阶段平方和 自由度 均方 F 值 P 值52.94 1.38 1.53 9.40 3.12 0.046 1.40 1.40 0.23 1.17 0.43 7.49 10.21 23.74 7.02 0.27 0.20 0.071 53.21 14 111111111111111 4 196.91 71.88 79.86 489.42 162.53 2.41 73.12 73.12 12.00 60.74 22.34 389.91 531.50 1236.30 365.80＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.143 1＜0.000 1＜0.000 1 0.003 8＜0.000 1 0.000 3＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 10 4 28 3.78 1.38 1.53 9.40 3.12 0.046 1.40 1.40 0.23 1.17 0.43 7.49 10.21 23.74 7.02 0.019 0.020 0.018 1.12 0.498 1显著性****************************不显著乳酸菌发酵阶段平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性72.16 5.19 2.51 2.65 10.68 0.59 2.00 2.99 0.065 0.81 0.98 8.23 19.67 19.87 19.03 0.66 0.40 0.26 72.82 14 111111111111111 4 109.33 110.04 53.28 56.23 226.51 12.58 42.47 63.49 1.38 17.18 20.79 174.58 417.25 421.45 403.59＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.003 2＜0.000 1＜0.000 1 0.259 8 0.001 0 0.000 4＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1****************************10 4 28 5.15 5.19 2.51 2.65 10.68 0.59 2.00 2.99 0.065 0.81 0.98 8.23 19.67 19.87 19.03 0.047 0.040 0.066 0.60 0.764 1不显著
2.2.3 响应曲面图分析
响应面图直观地反映了各因素间的交互作用对响应值的影响程度，响应曲面坡度越陡峭，该因素交互作用对响应值的影响越显著，反之则对响应值的影响较小[28]，交互作用对多菌种发酵苹果酵素酵母菌发酵阶段和乳酸菌发酵阶段感官评分影响的响应面等高线图分别见图5～图6。
图5 各因素间交互作用对苹果酵素酵母菌发酵阶段感官评分影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on sensory score of apple Jiaosu at yeast fermentation stage
图6 各因素间交互作用对苹果酵素乳酸菌发酵阶段感官评分影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on sensory score of apple Jiaosu at lactic acid bacteria fermentation stage
由图5可知，AC、AD、BC、BD和CD交互作用的响应曲面陡峭，说明对苹果酵素酵母菌发酵阶段感官评分的影响较大，AB交互作用的响应曲面较为陡峭，说明对苹果酵素酵母菌发酵阶段感官评分的影响较小，这与方差分析的结果一致。
由图6可知，AB、AC、AD、BD和CD交互作用的响应曲面陡峭，说明对苹果酵素乳酸菌发酵阶段感官评分的影响较大，BC交互作用的响应曲面较为陡峭，说明对苹果酵素乳酸发酵阶段感官评分的影响较小，这与方差分析的结果一致。
2.2.4 最佳条件预测及验证试验
根据响应面试验结果得到多菌种发酵苹果酵素酵母菌发酵阶段最佳工艺条件为：菌种比例（Cf∶Sc）1∶0.20，接种量3.28%，发酵温度23.03 ℃，初始pH4.67，在此条件下，苹果酵素的感官评分预测值可达9.64分；乳酸菌发酵阶段最佳工艺条件为菌种比例（Lp∶Lm）1∶1.07，接种量5.15%，发酵温度33.30 ℃，初始pH5.12，在此条件下，苹果酵素的感官评分预测值可达9.81分；为方便实际操作，将酵母菌发酵阶段最佳发酵工艺条件修正为菌种比例（Cf∶Sc）1∶0.2，接种量3.3%，发酵温度23 ℃，初始pH4.7；乳酸菌发酵阶段最佳工艺条件修正为菌种比例（Lp∶Lm）1∶1，接种量5.2%，发酵温度33 ℃，初始pH5.1。在此条件下进行3次平行试验，得到苹果酵素的感官评分为9.82，SOD活性、总酸含量、还原力、可溶性固形物含量和pH分别为55.83 U/mL、9.82、4.96 g/L、6.83、3.14°Bx和2.96。
3 结论
本研究选择多菌种发酵（Cf+Sc+Lp+Lm）制备苹果酵素，利用单因素试验和响应面法，通过考察菌种比例、接种量、发酵温度、初始pH对苹果酵素品质的影响，优化出多菌种发酵苹果酵素酵母菌发酵阶段最佳工艺条件为：费比恩塞伯林德纳氏酵母∶酿酒酵母1∶0.2，接种量3.3%，发酵温度23 ℃，初始pH4.7；乳酸菌发酵阶段最佳工艺条件为戊糖乳植物杆菌：肠膜明串珠菌1∶1，接种量5.2%，发酵温度33 ℃，初始pH5.1，在此优化条件下，多菌种发酵苹果酵素的感官评分为9.82，SOD活性为55.83 U/mL、总酸含量为4.96 g/L、还原力为6.83、可溶性固形物含量为3.14°Bx、pH为2.96。本研究有利于开发出一款感官评分较高的苹果酵素产品。
[1]中华人民共和国工业和信息化部.QB/T5323—2018 植物酵素[S].北京：中国标准出版社，2018.
[2]DAI J,SHA R Y,WANG Z Z,et al.Edible plant Jiaosu:manufacturing,bioactive compounds,potential health benefits,and safety aspects[J].Sci Food Agr,2020,100(15):5313-5323.
[3]蔡丽琴.猕猴桃酵素发酵过程中代谢产物变化规律研究[D].杭州：浙江工商大学，2022.
[4]FANG S,JIN Z N,XU Y S,et al.Chinese bayberry Jiaosu fermentationchanges of mycobiota composition and antioxidant properties[J].Int J Food Eng,2021,17(6):455-463.
[5]易媛，赵敏惠，左勇，等.桑葚酵素发酵过程中活性物质与抗氧化能力的相关性研究[J].食品与发酵工业，2022，48（9）：117-122.
[6]靳素媛，耿燕，周琦，等.24种食用植物酵素功能成分分析与生物活性初步研究[J].食品与生物技术学报，2023，42（8）：62-67.
[7]张海燕，康三江，袁晶，等.苹果酵素自然发酵工艺优化及品质分析[J].中国酿造，2020，39（10）：145-151.
[8]杨小幸，周家春，陈启明，等.苹果酵素天然发酵过程中代谢产物的变化规律[J].食品科学，2017，38（24）：15-19.
[9]张海燕，康三江，袁晶，等.苹果酵素自然发酵过程中生物活性物质的变化[J].中国酿造，2021，40（3）：111-114.
[10]康晓乐，李东霓，李晨，等.苹果自然发酵酵素微生物多样性分析[J].中国食品学报，2021，21（1）：283-290.
[11]张海燕，康三江，张霁红，等.苹果酵素发酵过程中微生物群落与风味物质的相关性分析[J].中国酿造，2022，41（12）：110-119.
[12]PENG W Y,MENG D Q,YUE T L,et al.Effect of the apple cultivar on cloudy apple juice fermented by a mixture of Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus plantarum,and Lactobacillus fermentum[J].Food Chem,2021,340:127922.
[13]ADESULU-DAHUNSI A T,DAHUNSI S O,OLAYANJU A.Synergistic microbial,interactions between lactic acid bacteria and yeasts during production of Nigerian indigenous fermented foods and beverages[J].Food Control,2020,110:106963.
[14]MA R F,SUI L,ZHANG J S,et al.Polyphasic characterization of yeasts and lactic acid bacteria metabolic contribution in semi-sol-id fermentation of Chinese Baijiu (traditional fermented alcoholic drink): towards the design of a tailored starter culture[J].Microorganisms,2019,7(5):147.
[15]汪继伟，阎春悦，马春蕾，等.两种非酿酒酵母与米曲霉互作特性研究[J].食品工业科技，2023，44（4）：171-180.
[16]DUNCAN J D,SETATI M E,DIVOL B,et al.Redox cofactor metabolism in Saccharomyces cerevisiae and its impact on the production of alcoholic fermentation end-products[J].Food Res Int,2023,163:112276.
[17]BREIDT F,SKINNER C.Buffer models for pH and acid changes occurring in cucumber juice fermented with Lactiplantibacillus pentosus and Leuconostoc mesenteroides[J].J Food Protect,2022,85(9):1273-1281.
[18]张海燕，康三江，袁晶，等.不同菌种组合对沙棘酵素发酵过程中理化指标及活性物质变化的影响[J].食品安全质量检测学报，2023，14（16）：268-276.
[19]DONG W W, ZENG Y T, CUI Y X, et al.RETRACTED: Unraveling the composition and succession of microbial community and its relationship to flavor substances during Xin-flavor Baijiu brewing[J].Int J Food Microbiol,2022,372:109679.
[20]魏建敏.刺梨酵素的制备及功能性研究[D].贵阳：贵州大学，2022.
[21]LIU Q, TANG G Y, ZHAO C N, et al.Antioxidant activities, phenolic profiles, and organic acid contents of fruit vinegars[J].Antioxidants,2019,8(4):78.
[22]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.171—2003 保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定[S].北京：中国标准出版社，2003.
[23]DAN T,HU H M,TIAN J L,et al.Influence of different ratios of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and Streptococcus thermophilus on fermentation characteristics of yogurt[J].Molecules,2023,28(5):2123.
[24]CUI L,CHANG S K C,NANNAPANENI R.Comparative studies on the effect of probiotic additions on the physicochemical and microbiological properties of yoghurt made from soymilk and cow's milk during refrigeration storage(R2)[J].Food Control,2021,119:107474.
[25]VALERO-CASES E, CERDÁ-BERNAD D, PASTOR J J, et al.Nondairy fermented beverages as potential carriers to ensure probiotics,prebiotics,and bioactive compounds arrival to the gut and their health benefits[J].Nutrients,2020,12(6):1666.
[26]ZHANG L H,ZHANG M,MUJUMDAR A S.New technology to overcome defects in production of fermented plant products-a review[J].Trends Food Sci Tech,2021,116:829-841.
[27]LI C, ZHANG S K, DONG G Y, et al.Multi-omics study revealed the genetic basis of beer flavor quality in yeast[J].LWT-Food Sci Technol,2022,168:113932.
[28]赵春妮，汤鑫鑫，刘可，等.响应面法优化金刺梨酵素发酵工艺[J].中国酿造，2023，42（3）：151-156.