食醋在人们日常生活中扮演着十分重要的角色，不仅可以作为调味品使用，还具有独特的保健功能[1]。研究表明，食醋具有促进食欲、缓解疲劳、抗菌杀菌、调节血糖、改善血脂和抗癌等作用[2-6]。传统固态发酵食醋风味优良，但生产周期长，而液态发酵食醋风味虽不及固态醋，但生产成本低，周期短，因此液态法酿造食醋逐渐被推广应用[7]。以食用酒精为原料酿造的食醋正是液态法生产食醋的一种。此外，高浓度的酒精醋不仅可以作为调味品，还可以作为一种化工原料，广泛应用在食品加工业、保洁业、美容业和医疗业等行业[8]。
酒精醋发酵体系中除乙醇外，几乎没有能满足醋酸菌正常生理活动的其他物质，因此必须向发酵液中添加营养物质来支持醋酸菌的生长代谢。营养物质是多种化合物混合而成，包括碳源、氮源、金属盐和生长因子等物质[9]。目前，酒精醋工业生产大都使用德国的Frings营养盐，虽然使用方便，但是价格昂贵，导致经济成本较高。对于营养盐的优化主要以葡萄糖和酵母浸粉为基础，添加无机元素，虽然降低了成本，但产酸相比于Frings营养盐仍有差距[10-12]。此外，也有研究通过添加醋酸菌代谢途径中相关因子或相关酶的前体物质，以实现高强度发酵[13-14]，虽没有具体说明营养盐配方，但为后续的相关研究提供了思路，有必要对其进行深入研究。
本研究首先通过单因素试验确定醋酸菌发酵产酒精醋所需营养物质（碳源、氮源、无机盐、生长因子）的种类及添加量，再以总酸含量为响应值，使用响应面法对其进行优化，得到酒精醋发酵最佳营养盐配方，以期提高总酸含量和发酵效率，为酒精醋的工业生产和营养盐的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）：由本实验室筛选保藏。
1.1.2 试剂
95%食用酒精：安徽安特食品股份有限公司；天冬氨酸（aspartate，Asp）、丙氨酸（alanine，Ala）、脯氨酸（proline，Pro）（均为分析纯）：中国惠兴生化试剂有限公司；乙酸（分析纯）等氨基酸、酚酞：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、无水氯化钙、磷酸二氢铵（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司；无水硫酸镁（分析纯）：上海凌峰化学试剂有限公司；柠檬酸铵（分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司。
1.1.3 培养基
斜面培养基：葡萄糖10.00 g/L，酵母浸粉10.00 g/L，琼脂20 g/L，121 ℃，0.1 MPa灭菌20 min，冷却至30 ℃后加入食用酒精3%（V/V）与CaCO3 15 g/L。
种子培养基：葡萄糖10.00 g/L，酵母浸粉10.00 g/L，121 ℃，0.1 MPa灭菌20 min，冷却至30 ℃后加入食用酒精3%（V/V）。
基础培养基：葡萄糖5.00 g/L，Asp 0.5 g/L，Ala 0.5 g/L，Pro 0.5 g/L，柠檬酸铵0.5 g/L，磷酸二氢铵0.5 g/L，无水氯化钙0.04 g/L，无水硫酸镁0.04 g/L，泛酸0.05 g/L，121 ℃，0.1 MPa灭菌20 min，冷却至30 ℃后加入食用酒精5%（V/V），乙酸1%（V/V）。
全合成培养基1：葡萄糖5.00 g/L，柠檬酸铵0.5 g/L，磷酸二氢铵0.5 g/L，无水氯化钙0.04 g/L，无水硫酸镁0.04 g/L，泛酸0.05 g/L，121 ℃，0.1 MPa灭菌20 min，冷却至30 ℃后加入食用酒精5%（V/V），乙酸1%（V/V）。
全合成培养基2：葡萄糖5.00 g/L，Asp 0.5 g/L，Ala 0.5 g/L，Pro 0.5 g/L，121 ℃，0.1 MPa灭菌20 min，冷却至30 ℃后加入食用酒精5%（V/V），乙酸1%（V/V）。
1.2 仪器与设备
ZQZY-88AN振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；TG16KR冷冻离心机：长沙东旺实验仪器有限公司；立式蒸汽压力灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；UVmini-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；SW-CJ-1D单人净化工作台：苏州净化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 种子液制备
将培养24 h的新鲜斜面菌种接种至100 mL种子培养基中，30 ℃，180 r/min条件下振荡培养24 h。
1.3.2 发酵方法
将10 mL种子液在4 ℃、8 000 r/min条件下离心5 min，用同体积磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer solution，PBS）洗涤沉淀，并重新悬浮，将10 mL细胞悬液接种至100 mL发酵培养基中，30 ℃、180 r/min条件下振荡培养96 h。
1.3.3 营养盐配方优化试验设计
（1）单因素试验
葡萄糖对酒精醋发酵的影响：葡萄糖作为醋酸菌最好利用的碳源，可为其细胞生长繁殖提供碳架来源，因此选用葡萄糖作为营养盐中碳源。改变基础培养基葡萄糖的添加量（1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L），在30℃、180r/min条件下振荡培养96h后测定总酸含量，以确定葡萄糖的最佳添加量。
氨基酸对酒精醋发酵的影响：根据巴氏醋杆菌氨基酸代谢网络模块[15]筛选出了该试验所用的氨基酸。以不加氨基酸为对照，在全合成培养基1的基础上分别添加0.5 g/L的甘氨酸（glycine，Gly）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、天冬氨酸（Asp）、丙氨酸（Ala）、组氨酸（histidine，His）、脯氨酸（Pro）、精氨酸（argnine，Arg）、色氨酸（tryptophane，Trp）、赖氨酸（lysine，Lys）、半胱氨酸（cysteine，Cys）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、酪氨酸（tyrosine，Tyr），在30 ℃、180 r/min条件下振荡培养96 h后测定总酸含量和OD600 nm值，筛选出最佳氨基酸种类。再考察筛选出的氨基酸添加量（0.05 g/L、0.1 g/L、0.15 g/L、0.2 g/L、0.25 g/L、0.3 g/L、0.35 g/L、0.4 g/L、0.45 g/L）对总酸含量的影响。
无机氮源对酒精醋发酵的影响：以不加无机氮源为对照，在全合成培养基2的基础上分别添加0.5 g/L的柠檬酸铵、磷酸二氢铵、草酸铵、硫酸铵，30 ℃，180 r/min条件下振荡培养96 h后测定总酸含量和OD600nm值，筛选出最佳无机氮源种类。再考察筛选出的无机氮源添加量（0.02 g/L、0.04 g/L、0.06g/L、0.08g/L、0.1g/L、0.12g/L）对总酸含量的影响。
无机盐对酒精醋发酵的影响：以不加无机盐为对照，在全合成培养基2的基础上分别添加0.04 g/L的磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、无水氯化钙、无水硫酸镁，30 ℃、180 r/min条件下振荡培养96 h后测定总酸含量和OD600 nm值，筛选出最佳无机盐种类。考察筛选出的无机盐添加量（0.02 g/L、0.04 g/L、0.06 g/L、0.08 g/L、0.1 g/L、0.12 g/L）对总酸含量的影响。
生长因子对酒精醋发酵的影响：以不加生长因子为对照，在全合成培养基2的基础上分别添加0.05 g/L的烟酸、泛酸、对氨基苯甲酸，30 ℃、180 r/min条件下振荡培养96 h后测定总酸含量和OD600nm值，筛选出最佳生长因子种类。考察筛选出的生长因子添加量（0.02 g/L、0.04 g/L、0.06 g/L、0.08 g/L、0.10 g/L、0.12 g/L）对总酸含量的影响。
（2）Plackett-Burman试验[16]
将单因素试验中筛选出的9种物质作为影响因素进行Plackett-Burman试验，共设计12组试验，以总酸含量为评价指标（Y1），变量包括葡萄糖（A）、Ala（B）、Asp（C）、Pro（D）、磷酸二氢铵（E）、柠檬酸铵（F）、无水氯化钙（G）、无水硫酸镁（H）、泛酸（J）添加量，虚拟变量（K、L），每个因素取高低两个水平，每组试验3次取平均值。
表1 营养盐配方优化Plackett-Burman试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design for nutrient salt formula optimization
因素A 葡萄糖/（g·L-1）B 丙氨酸/（g·L-1）C 天冬氨酸/（g·L-1）D 脯氨酸/（g·L-1）E 磷酸二氢铵/（g·L-1）F 柠檬酸铵/（g·L-1）G 无水氯化钙/（g·L-1）H 无水硫酸镁/（g·L-1）J 泛酸/（g·L-1）水平-1 1 0.50 0.25 0.25 0.35 0.04 0.08 0.04 0.04 0.06 1.50 0.35 0.35 0.45 0.08 0.12 0.08 0.08 0.10
（3）最陡爬坡试验
根据Plackett-Burman试验结果，对筛选得到的4个最显著影响因素按其正负效应确定爬坡方向，以各因素效应值的大小确定变化步长，能迅速有效地逼近最佳区域[17]。其余次要因素按其正负效应取值，正效应取高值，负效应取低值。
（4）响应面试验
根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，对筛选得到的4个最显著影响因素无水硫酸镁（X1）、无水氯化钙（X2）、Asp（X3）、Pro（X4）作为试验因素，以最陡爬坡试验的较优水平作为中心点，以总酸含量（Y2）为响应值，用Design-Expert 13.0对试验结果进行多元拟合回归分析[18]，得到响应面分析结果，确定酒精醋发酵最佳营养盐配方。
表2 营养盐配方优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests design for nutrient salt formula optimization
因素X1无水硫酸镁/（g·L-1）X2无水氯化钙/（g·L-1）X3天冬氨酸/（g·L-1）X4脯氨酸/（g·L-1）-1水平0 1 0.08 0.08 0.35 0.15 0.09 0.09 0.45 0.25 0.10 0.10 0.55 0.35
1.3.4 分析检测
总酸含量（以乙酸计）的测定：采用酸碱滴定法测定总酸含量[19]。
生物量的测定：采用分光光度计法在波长600 nm处测定菌液的吸光度值（OD600nm值）[20]。
1.3.5 数据处理
使用Design-Expert 13.0进行数据处理与分析，使用Origin 2017软件绘图。
2 结果与分析
2.1 营养盐配方优化单因素试验结果与分析
2.1.1 葡萄糖对巴氏醋杆菌产酸量的影响
不同葡萄糖添加量对酒精醋总酸含量的影响见图1。由图1可知，当葡萄糖添加量由0提升至1 g/L时，酒精醋总酸含量随之上升，最高为40.37 g/L，但葡萄糖添加量超过1 g/L时，总酸含量基本不变。其原因在于适量的单糖可促进巴氏醋杆菌的生长，当添加量为1 g/L时，发酵体系中碳源已满足菌体的生长需求，过多的葡萄糖对发酵并无明显影响，故选择Plackett-Burman试验中葡萄糖的添加量为1 g/L。
图1 葡萄糖添加量对酒精醋总酸含量的影响
Fig.1 Effect of glucose addition on total acid contents of alcohol vinegar
2.1.2 氨基酸对巴氏醋杆菌生长和产酸量的影响
不同氨基酸对巴氏醋杆菌生长和产酸量的影响见图2。
图2 不同氨基酸对巴氏醋杆菌生物量（a）和总酸含量（b）的影响
Fig.2 Effects of different amino acids on biomass (a) and total acid contents (b) of Acetobacter pasteurensis
由图2可知，Asp、Ala和Pro对巴氏醋杆菌的生长影响较大，OD600 nm值均高于0.145，同时，单独添加Asp、Ala和Pro总酸含量有明显提升，均高于33 g/L。相比于对照组，除Asp、Ala和Pro之外的其余9种氨基酸对巴氏醋杆菌生物量和总酸含量的影响则较小。其原因可能是Asp、Ala或Pro可以通过增强磷酸戊糖途径过程中用于合成核酸、脂肪酸和谷胱甘肽的戊糖磷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的生成，提高细胞的稳定性。同时增强氨基酸的脱氨作用，增加细胞内铵离子浓度，以维持细胞内pH的稳定，从而提高巴氏醋杆菌的抗酸能力。所以选择Asp、Ala和Pro作为营养盐中的氨基酸。
对Asp、Ala和Pro逐个进行添加量试验，结果见图3。由图3可知，酒精醋总酸含量随着Asp、Ala、Pro添加量的增加呈先上升后下降的趋势，添加量分别为0.3 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L时，总酸含量最高，分别为44.7 g/L、46.5 g/L、44.1 g/L，故选择Plackett-Burman试验中营养盐各氨基酸的添加量为Asp 0.3 g/L、Ala 0.3 g/L、Pro 0.4 g/L。
图3 氨基酸添加量对酒精醋总酸含量的影响
Fig.3 Effect of amino acid addition on total acid contents of alcohol vinegar
2.1.3 无机氮对巴氏醋杆菌生长和产酸量的影响
不同无机氮对巴氏醋杆菌生长和总酸含量的影响见图4。由图4可知，磷酸二氢铵、硫酸铵、草酸铵和柠檬酸铵对巴氏醋杆菌的生长均有不同程度的促进作用，其中磷酸二氢铵和柠檬酸铵影响最为明显，OD600 nm值均高于0.102。同时，单独添加磷酸二氢铵和柠檬酸铵时，总酸含量均有增加，与对照相比分别提高了10.87%和26.1%。所以选择磷酸二氢铵和柠檬酸铵作为营养盐中的无机氮。
图4 不同无机氮对巴氏醋杆菌生物量（a）和总酸含量（b）的影响
Fig.4 Effects of different inorganic nitrogen on biomass (a) and total acid contents (b) of Acetobacter pasteurensis
进一步对磷酸二氢铵和柠檬酸铵添加量进行优化，结果见图5。由图5可知，酒精醋总酸含量随着磷酸二氢铵和柠檬酸铵添加量的增加呈先上升后下降的趋势，在添加量分别为0.06 g/L和0.10 g/L时，总酸含量最高，分别为39.9 g/L和43.5 g/L。过多的磷酸二氢铵与柠檬酸铵会改变初始培养基的pH值，使醋酸菌处于不利于生长代谢的环境中，进而弱化其产酸作用。故选择Plackett-Burman试验中营养盐各无机氮的添加量为磷酸二氢铵0.06 g/L、柠檬酸铵0.10 g/L。
图5 无机氮添加量对酒精醋总酸含量的影响
Fig.5 Effect of inorganic nitrogen addition on total acid contents of alcohol vinegar
2.1.4 无机盐对巴氏醋杆菌生长和产酸量的影响
不同无机盐对巴氏醋杆菌生长和总酸含量的影响见图6。由图6可知，无水氯化钙和无水硫酸镁对巴氏醋杆菌的生长有明显促进作用，OD600 nm值分别达到了0.175和0.372。磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、无水氯化钙和无水硫酸镁对总酸含量均有不同程度的促进作用，其中，无水氯化钙和无水硫酸镁促进作用最为明显，相比与对照组，总酸含量分别提高了39.4%和49.5%。分析可能是因为无水氯化钙可以改善细胞壁的完整性，保持乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，增加巴氏醋杆菌对恶劣环境的抵抗力[21]；Mg2+可以作为醋酸菌乙醇氧化过程中相关酶的激活剂，提高巴氏醋杆菌的产酸能力[22]。所以选择无水氯化钙和无水硫酸镁作为营养盐中的无机盐。
图6 不同无机盐对巴氏醋杆菌生物量（a）和总酸含量（b）的影响
Fig.6 Effects of different inorganic salts on biomass (a) and total acid contents (b) of Acetobacter pasteurensis
进一步对无水氯化钙和无水硫酸镁优化进行添加量，结果见图7。由图7可知，巴氏醋杆菌总酸含量随着无水氯化钙和无水硫酸镁添加量的增加呈先上升后略微下降的趋势，添加量均为0.06 g/L时，总酸含量最高，分别为45.65 g/L和48 g/L，故选择Plackett-Burman试验中营养盐各无机盐的添加量为无水氯化钙0.06 g/L、无水硫酸镁0.06 g/L。
图7 无机盐添加量对酒精醋总酸含量的影响
Fig.7 Effect of inorganic salt addition on total acid contents of alcohol vinegar
2.1.5 生长因子对巴氏醋杆菌生长和产酸量的影响
不同生长因子对巴氏醋杆菌生长和产酸量的影响见图8。由图8可知，氨基苯甲酸、泛酸、烟酸会对巴氏醋杆菌的生长有不同程度的促进作用，其中泛酸影响最为明显，相比于对照组，OD600nm值提升了50%，达到了0.108。同时，泛酸会促进巴氏醋杆菌的产酸，总酸含量最高，为46 g/L。所以选择泛酸作为营养盐中的生长因子。
图8 不同生长因子对巴氏醋杆菌生物量（a）和总酸含量（b）的影响
Fig.8 Effects of different growth factors on biomass (a) and total acid contents (b) of Acetobacter pasteurensis
进一步对泛酸添加量进行优化，结果见图9。由图9可知，酒精醋总酸含量随着泛酸添加量的增加呈先上升后略微下降的趋势，在泛酸添加量为0.08 g/L时，总酸含量最高，为46.1 g/L，故选择Plackett-Burman试验中泛酸的添加量为0.08 g/L。
图9 泛酸添加量对酒精醋总酸含量的影响
Fig.9 Effect of pantothenic acid addition on total acid contents of alcohol vinegar
综上，通过单因素优化试验，得到Plackett-Burman试验各因素的添加量为葡萄糖1 g/L、Asp 0.3 g/L、Ala 0.3 g/L、Pro 0.4 g/L、磷酸二氢铵0.06 g/L、柠檬酸铵0.1 g/L、无水氯化钙0.06 g/L、无水硫酸镁0.06 g/L、泛酸0.08 g/L。
2.2 Plackett-Burman试验设计结果与分析
Plackett-Burman试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4，由表3数据结果得出回归方程（1）如下：
表3 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments
试验号 A B C D E F G H J K L Y1总酸含量/（g·L-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0-1-1 1-1-1 1 1 1 -1-1-1 1 1 1 -1 1 -1-1 1-1-1 1-1-1 1-1 1 1-1-1 1 1 1 -1 1 1 1 -1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 1 1 1 1 -1 1 --1-1-1 1 1 -1-1-1 1 1 -1 1 --1-1-1 1 1 1 1 -1-1-1 1-1-1-1 1-1 1 1 -1 11 12 1 1 1 1 1 1 -1-1 1-1 1-1-1 1-1 1 1 -1-1-1-1-1 1-1 1-1 1-1-1 1 1-1-1 1-1-1 1-1 1 1 1-1-1 1 49.40 48.80 42.20 45.20 47.00 50.60 47.40 45.80 41.20 41.00 47.60 49.80
表4 Plackett-Burman试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。下同。
因素 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCDEFGHJ 121.65 0.12 0.053 13.65 12.81 0.013 6.45 40.33 48.00 0.21 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 13.52 0.12 0.053 13.65 12.81 0.013 6.45 40.33 48.00 0.21 38.99 0.35 0.15 39.38 36.96 0.038 18.62 116.35 138.46 0.62 0.025 2 0.615 9 0.732 7 0.024 5 0.026 0 0.864 6 0.050 1 0.008 5 0.007 1 0.514 9*** ****
由表4可知，模型决定系数R2=0.994 3，模型的P值为0.025 2，表明模型具有良好的显著性[23]。Asp（C）和Pro（D）对巴氏醋杆菌产酸影响显著（P＜0.05），无水氯化钙（G）、无水硫酸镁（H）对巴氏醋杆菌产酸影响极显著（P＜0.01）。因此，选择无水硫酸镁、无水氯化钙、Asp和Pro作为关键变量进行爬坡试验，其余因素按照正负效应进行取值，正效应取高值，负效应取低值。
2.3 最陡爬坡试验
根据回归方程（1）中C、D、G、H因素效应系数的正负，因素D的系数为负，其他因素的系数为正，因此依次增大Asp、无水氯化钙、无水硫酸镁的添加量，依次减小Pro的添加量，设计5组试验，试验设计及结果见表5。
表5 最陡爬坡试验设计及结果
Table 5 Design and results of the steepest climb experiments
试验号 Asp/（g·L-1）Pro/（g·L-1）无水氯化钙/（g·L-1）无水硫酸镁/（g·L-1）总酸含量/（g·L-1）1 2 3 4 5 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 43.2 45.1 47.4 49.2 48.0
由表5可知，随着Asp、无水氯化钙、无水硫酸镁添加量逐渐增加，Pro添加量逐渐减少，酒精醋总酸含量呈现先增大后减小的趋势。当采用第4组配方即营养盐中Asp 0.45 g/L、Pro 0.25 g/L、无水氯化钙0.09 g/L、无水硫酸镁0.09 g/L时，总酸含量达到最高。因此，以第4组试验水平作为响应面试验设计的中心点，进行下一步优化。
2.4 Box-Behnken中心组合试验结果与分析
2.4.1 Box-Behnken中心组合试验结果
根据最陡爬坡试验结果，选择4号试验各物质添加量作为响应面试验中心点进行试验设计，利用Design-Expert 13.0软件设计4因素3水平试验，共计29组试验，Box-Behnken试验设计及结果见表6，方差分析见表7。
表6 Box-Behnken试验设计及结果
Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments
试验号 X1 X2 X3 X4 Y2总酸含量/（g·L-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0-1 1-1 0-1 0 0 1 0 --1 1 0 0 1 0 1 0 1 -1 0 1 -0 0 1 -0 0 0 0 0 0 0 0 -1-1 11 12 13 14 15 16 17 1 0 0 0 0 0 -1 0 -1 0 -1 1 0 1 0 0 1 0 0 -1 1 1 1 0 -1 0 0 0 -1 1 0-1 0 49.82 44.92 51.80 49.61 51.27 47.31 52.40 53.04 53.90 53.20 50.55 51.20 49.90 52.00 51.22 52.30 49.15
续表
试验号 X1 X2 X3 X4 Y2总酸含量/（g·L-1）18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 0 0 0 0 0 0 0 -0 0 1 -1 0 0 0 0 1 --1 0-1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 -1 0 -1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 52.10 53.40 52.25 45.17 53.48 49.68 45.26 45.35 50.15 50.28 53.08 49.00
表7 Box-Behnken试验回归模型方差分析
Table 7 Variance analysis of regression model of Box-Behnken experiments
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型X1X2X3X4**********14 X1X2 X1X3**X1X4 X2X3 X2X4 X3X4 X12 X22 X32 X42 41.24 79.45 35.77 46.38 224.08 3.96 18.05 2.09 0.326 2 37.01 15.99 49.21 17.73 67.96 36.01＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.066 4 0.000 8 0.170 4 0.576 9＜0.000 1 0.001 3＜0.000 1 0.000 9＜0.000 1＜0.000 1************残差失拟项纯误差总和192.72 26.52 11.94 15.48 74.80 1.32 6.03 0.697 2 0.108 9 12.36 5.34 16.43 5.92 22.69 12.02 4.67 2.62 2.06 197.40 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 10 4 28 13.77 26.52 11.94 15.48 74.80 1.32 6.03 0.697 2 0.108 9 12.36 5.34 16.43 5.92 22.69 12.02 0.333 8 0.261 8 0.513 9 0.509 4 0.823 6
利用Design-Expert 13.0软件对表6试验结果进行分析，得到总酸含量（Y2）的二次多元回归方程（2）：
由表7可知，模型的P＜0.000 1，极显著，说明该模型有效，失拟项P=0.823 6，不显著，说明该模型不存在失拟因素；决定系数R2和调整决定系数R2adj分别为0.976 3和0.952 6，说明该模型拟合程度好，试验误差较小，适用于酒精醋发酵用营养盐配方的优化及预测[24]。由P值可知，一次项X1、X2、X3、X4，二次项X12、X22、X32、X42及交互项X1X3、X2X4、X3X4对总酸含量的影响均极显著（P＜0.01），交互项X1X2、X1X4、X2X3对总酸含量的影响不显著（P＞0.05）。
2.4.2 Box-Behnken中心组合试验分析
无水氯化钙、Asp、Pro和无水硫酸镁添加量之间的交互作用对酒精醋总酸含量的影响见图10。等高线形状可用于判断变量之间交互作用的显著性，越密集越偏向于椭圆代表交互作用越显著，反之则不显著[25]。由图10可知，无水硫酸镁和Asp、Asp和Pro、无水氯化钙和Pro交互作用影响的等高线接近椭圆说明两者交互作用较大，这与方差分析结果一致。
图10 各因素间交互作用对总酸含量影响的响应面及等高线
Fig.10 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on total acid content
2.5 模型验证
采用Design-Expert 13.0软件，对总酸含量求极值，当酒精醋发酵用营养盐中无水硫酸镁添加量0.094 g/L、无水氯化钙0.090 g/L、Asp 0.436 g/L、Pro 0.180 g/L时发酵酒精醋总酸含量预测值为54.115 g/L。根据实际操作的可行性，将最佳配方修正为无水硫酸镁0.09 g/L、无水氯化钙0.09 g/L、Asp 0.44 g/L、Pro 0.18 g/L。因此最佳营养盐组分为葡萄糖1.50 g/L、Ala 0.15 g/L、Asp 0.44 g/L、Pro 0.18 g/L、柠檬酸铵0.15 g/L、无水氯化钙0.09 g/L、无水硫酸镁0.09 g/L、泛酸0.12 g/L。在该优化条件下进行3次平行试验，得到的总酸含量实际值为（53.85±0.22）g/L，其与预测值基本一致。利用最优营养盐发酵酒精醋总酸含量相较优化前提升了12.19%。
2.6 成分对比
对Frings营养盐与自制营养盐氨基酸与无机离子种类与含量进行对比，结果表明，Frings营养盐种包含15种氨基酸，总含量为3.768 2 mg/g；自制营养盐中包含3种氨基酸，总含量为281.62 mg/g。虽然Frings营养盐中氨基酸种类较多，但自制营养盐中氨基酸含量远大于Frings营养盐。Frings营养盐中含有5种无机离子，分别是NH4+、K+、Mg2+、Ca2+、Na+，总含量为167.0 mg/g；自制营养盐中同样含有5种无机离子，分别是NH4+、SO42-、Cl-、Ca2+、Mg2+，总含量为79.912 mg/g。自制营养盐无机离子含量低于Frings营养盐。
3 结论
本研究首先通过一系列单因素试验，确定了影响酒精醋发酵所需营养物质的种类和添加量，其次使用Plackett-Burman设计，从9个影响酒精醋总酸含量的因素中筛选出4个相对显著的影响因素：无水硫酸镁、无水氯化钙、Asp、Pro，最后使用最陡爬坡试验结合响应面分析得到最佳酒精醋发酵用营养盐配方为：葡萄糖1.5 g/L、Ala 0.15 g/L、Asp 0.44 g/L、Pro 0.18 g/L、柠檬酸铵0.15 g/L、无水氯化钙0.09 g/L、无水硫酸镁0.09 g/L、泛酸0.12 g/L。在最佳营养盐组合下，发酵酒精醋总酸含量达到了（53.85±0.22）g/L，相较优化前提升了12.19%。与Frings营养盐对比，自制营养盐中氨基酸含量较高，而无机离子含量较低。
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